不同產地魚腥草藥材質量的綜合評價Δ

溫倪婷 ，楊昌貴 ，周濤 ，康傳志 ，趙丹 ，王升 ，江維克 #（.貴州中醫藥大學中藥民族藥資源研究院，貴陽 55005；.中國中醫科學院中藥資源中心，北京 00700）

魚腥草為三白草科植物蕺菜HouttuyniacordataThunb.的新鮮全草或干燥地上部分，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功效[1]。2020年版《中國藥典》中有近20個中成藥以其為原料，西南地區民間以其作為蔬菜食用，貴州、四川、廣東、廣西、湖北和湖南等地有栽培[2]。有文獻報道，產地是影響魚腥草藥材質量的關鍵因素，不同產地間魚腥草中黃酮類成分的含量差異可達20倍[3]。因此，系統分析不同產地魚腥草藥材質量是確保藥材質量穩定的關鍵。目前，魚腥草藥材質量的評價多以2020年版《中國藥典》中水分、浸出物和酸不溶性灰分含量為指標，或采用指紋圖譜、一測多評法等單一模式對藥材質量進行評價，不能綜合體現藥材質量。

熵權法是一種廣泛應用的多目標決策算法，是解決多個不相容問題和方法的有力工具[4]；灰色關聯度分析法能較好地反映數據間的非線性關系[5]；二者合用可對藥材質量的各評價指標進行客觀賦值，避免主觀性和不確定性，能進一步提高灰色關聯度分析模型的評價精度，是一種有效評價中藥材質量的綜合模式。

有研究發現，魚腥草中總黃酮、浸出物具有抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用[6]，這與其清熱解毒、消癰排膿的功效相符。此外，魚腥草采挖清洗時容易帶入泥土、砂石等無機雜質，會影響藥材的凈度，因此總灰分可作為評價藥材凈度的指標[7]?；诖?，本研究以總黃酮、浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分含量為指標，采用熵權法結合灰色關聯度分析法對不同產地的魚腥草藥材質量進行綜合評價，建立其質量評價的新模式，旨在為全面、客觀評價魚腥草藥材質量提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括MS205DU型電子天平和ME204型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；UV-2700型紫外分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司]；101-2AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋（天津市恒奧科技發展有限公司）；FL-UP-JX-30型純水儀（蘇州飛鹿環?？萍加邢薰荆?。

1.2 藥材與試劑

蘆丁對照品（批號DSTDL001701，純度≥99%）購自成都樂美天醫藥科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸均為分析純，水為超純水。

30批魚腥草藥材樣品（編號S1～S30）經貴州中醫藥大學中藥民族藥資源研究院江維克教授鑒定為三白草科植物蕺菜H.cordataThunb.的干燥地上部分。所有藥材樣品經干燥后粉碎，保存于自封袋中。樣品來源信息見表1。

表1 30批不同產地魚腥草藥材的來源信息

2 方法與結果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱定蘆丁對照品135.10 mg，置于100 mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容，制得質量濃度為1.351 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取上述儲備液15 mL，置于100 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，即得質量濃度為0.202 7 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取魚腥草藥材樣品粉末（過三號篩），約0.5 g，精密稱定，置于150 mL錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，水浴回流45 min，放冷，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 線性關系考察

精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇至6 mL，精密加入7%亞硝酸鈉溶液0.3 mL、10%硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液15 mL，加入50%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，于502 nm波長處測定吸光度。以對照品的質量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到蘆丁的回歸方程為y＝11.878x+0.046（r＝0.999 5），表明蘆丁檢測質量濃度在0.008 1～0.048 6 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗

精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S28）1 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇至6 mL，按“2.1.3”項下方法顯色后，于502 nm波長處連續測定6次吸光度。結果顯示，吸光度的RSD為0.64%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗

取魚腥草藥材樣品（編號S28），精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于靜置0、2、4、6、24 h后精密吸取1 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%乙醇至6 mL，按“2.1.3”項下方法顯色后，于502 nm波長處測定吸光度。結果顯示，吸光度的RSD為1.19%（n＝5），表明樣品在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗

取同批魚腥草藥材樣品（編號S28）粉末，共6份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下方法顯色后，于502 nm波長處測定吸光度，并按標準曲線計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結果顯示，樣品含量的RSD為1.68%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

取已知含量的魚腥草藥材樣品（編號S28）粉末，共6份，每份0.25 g，精密稱定，加入蘆丁對照品13.51 mg，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下方法顯色后，于502 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率。結果顯示，蘆丁的平均加樣回收率為102.73%（RSD＝1.57%，n＝6）。

2.1.8 樣品含量測定

取30批魚腥草藥材樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下方法顯色后，于502 nm波長處測定吸光度并按照標準曲線計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結果見表2。

表2 30批魚腥草藥材樣品中總黃酮等5個指標的含量測定結果（n＝3，%）

2.2 浸出物、水分、總灰分和酸不溶性灰分的含量測定

本研究中的浸出物、水分、總灰分和酸不溶性灰分含量均按2020年版《中國藥典》（四部）通則項下方法測定。結果見表2。

2.3 單指標分析不同產地魚腥草藥材質量

應用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05。采用GraphPad Prism 8繪制魚腥草藥材總黃酮等5個指標的含量柱形圖。從總黃酮含量來看，30批樣品的含量為3.35%～13.64%，平均7.95%；以云南省建水縣產樣品的平均總黃酮含量最高（12.47%），與湖南省中方縣（7.42%）、貴州省都勻市（7.06%）、云南省保山市隆陽區（6.63%）、云南省彌渡縣（6.05%）、貴州省麻江縣（5.29%）、湖南省懷化市鶴城區（4.08%）產樣品比較有顯著性差異（P＜0.05）。平均總黃酮含量排名前5位的分別為云南省建水縣、廣西壯族自治區資源縣、廣西壯族自治區靈川縣、廣西壯族自治區全州縣、湖南省中方縣產樣品。結果見表2、圖1。

圖1 不同產地魚腥草藥材樣品中總黃酮等5個指標平均含量的柱形圖

從浸出物含量來看，30批樣品的含量為12.21%～28.60%，平均21.17%，均符合2020年版《中國藥典》不得少于10.0%的規定；以廣西壯族自治區全州縣產樣品的平均浸出物含量最高（26.02%），與廣西壯族自治區資源縣（16.82%）、貴州省都勻市（14.98%）產樣品比較有顯著性差異（P＜0.05）。平均浸出物含量排名前5位的分別為廣西壯族自治區全州縣、云南省建水縣、湖南省懷化市鶴城區、廣西壯族自治區靈川縣、云南省彌渡縣產樣品。結果見表2、圖1。

從水分含量來看，30批樣品的水分含量為6.76%～8.46%，平均7.56%，均符合2020年版《中國藥典》不得過15.0%的規定；除貴州省麻江縣（7.95%）產樣品的平均水分含量與廣西壯族自治區全州縣（6.99%）產樣品有顯著性差異（P＜0.05）外，其他產地的樣品間水分含量差異不顯著。結果見表2、圖1。

從總灰分含量來看，30批樣品的總灰分含量為7.56%～15.61%，平均12.16%，以廣西壯族自治區資源縣產樣品的平均總灰分含量最低（7.81%），藥材凈度最高，除與廣西壯族自治區全州縣（10.01%）產樣品差異不大外，與其他產地樣品均有顯著性差異（P＜0.05）。結果見表2、圖1。

從酸不溶性灰分含量來看，30批樣品的酸不溶性灰分含量為0.49%～5.65%，平均2.33%，其中貴州省都勻市（4.47%）、云南省保山市隆陽區（3.33%）、湖南省中方縣（3.16%）、云南省建水縣（2.93%）產樣品的平均酸不溶性灰分含量不符合2020年版《中國藥典》不得過2.5%的規定。結果見表2、圖1。

2.4 多指標分析不同產地魚腥草藥材質量

2.4.1 熵權法計算各指標權重

假設有n個樣本，m個指標，由此組成評價單元序列{Xij}（i＝1，2，3……n；j＝1，2，3……m；本研究中n＝30，m＝5）；分別按下列公式（1）和（2）對總黃酮、浸出物2個正向指標與水分、總灰分、酸不溶性灰分3個負向指標進行數據標準化處理[8]；再按公式（3）計算各指標的信息熵（Ej），按公式（4）計算各指標權重（Wj）。

公式（3）中，pij＝Yij/∑Yij，若pij＝0，則定義ln（pij）＝0。權重系數體現了指標的信息量，同一指標在不同對象中的客觀權重不同，公式（3）中的Ej可用來判斷各指標的離散程度，Ej越小表示該指標的離散程度越大，該指標對綜合評價的影響（即Wj）越大[9]。本研究中5個指標的Ej由小到大依次為總黃酮（0.934 1）＜總灰分（0.949 3）＜水分（0.957 9）＜酸不溶性灰分（0.967 6）＜浸出物（0.968 0）；Wj由大到小依次為總黃酮（0.295 5）＞總灰分（0.227 3）＞水分（0.188 7）＞酸不溶性灰分（0.145 1）＞浸出物（0.143 4），總黃酮和總灰分的權重相對較大，表明這兩個指標對魚腥草藥材的質量影響較大。

2.4.2 灰色關聯度分析法的建立

（1）參考序列的選擇。設樣品有n批，每批樣品有m個評價指標，組成評價單元序列{Xik}（i＝1，2，3……n；k＝1，2，3……m；本研究中n＝30，m＝5）。為了統一評價標準，采用低指標高優化的方法，將水分、總灰分、酸不溶性灰分3個指標進行倒數轉換[10]。統一標準后，得到最優參考序列{Xsk}和最差參考序列{Xtk}（k＝1，2，3……m），其中最優參考序列的各指標為n個樣品對應指標的最大值，最差參考序列的各指標為n個樣品對應指標的最小值。

（2）原始數據標準化處理。按公式（5）對原始數據進行標準化處理。式中，Xik為原始數據，Xk為樣品第k個指標的均值。

（3）關聯系數計算。按公式（6）計算相對于最優參考序列{Ysk}的關聯系數，按公式（7）計算相對于最差參考序列{Ytk}的關聯系數，式中分辨系數（ρ）為“2.4.1”項下計算所得權重，即Wk。

2.4.3 灰色關聯度的計算

30批魚腥草藥材相對于最優參考序列的關聯度ri（s）和最差參考序列的關聯度ri（t）分別按公式（8）和（9）計算。結果見表3。

表3 30批魚腥草藥材樣品的相對關聯度與藥材質量排序結果

2.4.4 相對關聯度計算

按公式（10）計算評價單元序列的相對關聯度（ri），ri越大表示質量越好[11]。結果見表3。

2.4.5 30批魚腥草藥材樣品的質量排序

結果顯示，30批魚腥草藥材的ri為0.233 2～0.673 9，有12批樣品的ri＞0.45，主要來自廣西壯族自治區全州縣、資源縣、靈川縣。廣西壯族自治區全州縣和資源縣產樣品的ri值分別為0.638 3（0.614 6～0.673 9）、0.598 7（0.523 8～0.649 5），表明這兩地所產魚腥草藥材質量較好且穩定；湖南省中方縣、湖南省懷化市鶴城區、云南省彌渡縣、云南省保山市隆陽區、貴州省都勻市、貴州省麻江縣產樣品ri分別為0.379 6（0.289 7～0.467 3）、0.367 5（0.341 9～0.385 8）、0.339 7（0.327 9～0.352 8）、0.333 7（0.293 5～0.379 0）、0.299 5（0.233 2～0.386 8）、0.298 5（0.261 3～0.342 7），藥材質量總體較差；廣西壯族自治區靈川縣、云南省建水縣產樣品的ri分別為0.556 1（0.456 2～0.628 9）、0.452 8（0.426 6～0.467 2），藥材質量居中。結果見表3、圖2。

圖2 30批魚腥草藥材樣品相對關聯度的柱形圖

3 討論

本研究基于單一指標對30批魚腥草藥材樣品的質量進行了評價。結果顯示，總黃酮等5個指標含量存在較大的差異，因此需采取多個指標綜合評價魚腥草藥材的質量。

相對關聯度分析結果顯示，30批魚腥草藥材樣品的ri為0.233 2～0.673 9，表明不同產地魚腥草藥材的質量差異較大；其中有12批藥材的ri＞0.45，以廣西壯族自治區全州縣產的藥材整體質量最優，廣西壯族自治區資源縣、靈川縣以及云南省建水縣產樣品排名靠前，其原因可能為這些產地建立了藥用魚腥草的規范化栽培基地，通過規范種植、采收、加工，從總體上提升了魚腥草藥材的質量；有18批藥材的ri＜0.45，主要集中在湖南省懷化市鶴城區、云南省彌渡縣、貴州省麻江縣等地，藥材樣品整體質量較差，其中貴州省麻江縣產魚腥草質量最差，這可能與當地土壤特性、環境和地理位置有關[12]。此外，本研究發現，總黃酮、總灰分含量兩個指標的權重系數排名靠前，是影響魚腥草藥材質量的重要指標，建議將總黃酮和總灰分納入魚腥草藥材質量的控制標準中。

綜上所述，熵權法結合灰色關聯度分析法可用于綜合評價魚腥草藥材的質量；廣西壯族自治區全州縣產的魚腥草藥材整體質量最優。