川芎揮發油對雷公藤甲素體外透皮性能及細胞毒性的影響Δ

蔣成 ，臧振中 ，陳麗華 ，朱海婷 ，傅世華 ，朱衛豐 ，吳文婷 ，施韡 ，管詠梅 #（.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 0004；.江西中醫藥大學藥學院，南昌 0004；.福建中醫藥大學附屬康復醫院藥學部，福州 5000）

雷公藤別名黃藤、斷腸草，為衛矛科植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.的根、葉及花，始載于《神農本草經》，具有祛風除濕、通絡止痛、解毒殺蟲的功效[1]。現代臨床研究表明，雷公藤可用于治療類風濕性關節炎、紫癜性腎炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，療效顯著[2-4]。雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分和毒性成分，其活性強、毒性大、生物利用度低、難溶于水、藥物吸收性差，長期服用不僅會刺激胃腸道，引起中樞神經損傷，還會造成嚴重的肝腎毒性[5-6]，因此雷公藤甲素是目前所有雷公藤制劑質量控制和安全標準的主要指標性成分[7]。有研究顯示，雷公藤制劑經皮給藥可以在發揮藥效的同時很好地降低雷公藤甲素的毒性[1]。配伍減毒增效是中醫藥特色之一，通過配伍可促進毒性藥物代謝、拮抗毒性藥物的峻烈之性并協同發揮療效，起到增效減毒的作用。本課題組前期通過數據挖掘雷公藤外用治療類風濕性關節炎的用藥規律發現，雷公藤外用時常與乳香、沒藥、川芎等配伍發揮增效減毒作用[8]。川芎揮發油是川芎的主要成分之一，由苯酞類、烯萜醇類、脂肪酸類等成分組成，具有較好的抗炎、抗氧化、調節細胞凋亡與細胞自噬等作用[9]，同時其還可以作為一種透皮促滲劑來促進藥物的透皮吸收[10]。基于此，本研究探討了川芎揮發油對雷公藤甲素體外透皮性能和細胞毒性的影響，以期為后續川芎揮發油配伍雷公藤甲素的體內實驗和配伍減毒作用機制研究，以及相關外用制劑的開發奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260型高效液相色譜儀、6890N-5973N型氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀（美國Agilent公司），XD-202型倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司），Incubator型CO2培養箱（上海力申科學儀器有限公司），TECAN Spark型多功能酶標儀（西安昊興生物科技有限公司），TT-6D Franz型擴散池（天津正通科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

川芎揮發油（批號20220711）購自頗黎芳香醫藥科技（上海）有限公司；雷公藤甲素對照品（批號20150813，純度≥98%）購自成都普菲德生物技術有限公司；單硬脂酸甘油酯（批號0210220）購自福晨（天津）化學試劑有限公司；輕質液體石蠟購自西安天正藥用輔料有限公司；羊毛脂（批號1902172）、三乙醇胺（批號21090101）、無水乙醇（批號161217）均購自西隴科學股份有限公司；硬脂酸（批號RH252437）購自上海易恩化學技術有限公司；DMEM高糖培養基（批號20220726）購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 實驗動物與細胞

雄性KM小鼠30只，體重（23±2）g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，生產許可證號為SCXK（京）2019-0010；所有動物實驗遵循江西中醫藥大學動物實驗倫理委員會有關實驗動物管理和使用的規定，符合3R原則。人永生化角質形成細胞（HaCat）購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，目錄號為SCSP-5091。

2 方法與結果

2.1 川芎揮發油主要成分的鑒定

采用GC-MS法。參照文獻[11-12]中川芎揮發油的GC-MS鑒定方法，精密量取川芎揮發油50 μL，置于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，充分混勻后過0.22 μm微孔濾膜，待測。GC-MS條件如下：Agilent HP-5 MS色譜柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；程序升溫（60 ℃保持3 min；以4 ℃/min升至120 ℃，保持5 min；以6 ℃/min升至210 ℃，保持5 min；以8 ℃/min升至280 ℃，保持5 min）；載氣為高純氮氣；流速為1 mL/min；分流比為20∶1；進樣口溫度為200 ℃；火焰離子化檢測器溫度為250 ℃；進樣量為1 μL。質譜條件如下：離子源為電子轟擊離子源；電子能量為70 eV；接口溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃；質量掃描范圍為29～550 mAU。

結果，本研究共鑒定出川芎揮發油中的62個化學成分，通過美國國家標準與技術研究所數據庫20.L（https：//www.sisweb.com/software/ms/nist.htm）匹配化合物，并采用峰面積歸一化法計算各化合物的相對百分含量。川芎揮發油中相對百分含量排前10位的化學成分及其相關信息見表1。

表1 川芎揮發油中相對百分含量排前10位的化學成分及其相關信息

2.2 雷公藤甲素透皮接收液的含量測定方法

含量測定采用高效液相色譜法。

2.2.1 對照品、供試品溶液的制備

取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，置于棕色瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL含雷公藤甲素0.25 mg的溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得對照品溶液。

按“2.3.1”項下方法制備乳膏，再按“2.4”項下方法進行體外透皮實驗，取各組Franz擴散池中的透皮接收液1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.2 色譜條件

采用Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈-水（42∶58，V/V），流速為0.8 mL/min，檢測波長為218 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2.2.3 方法學考察

（1）專屬性考察：取“2.2.1”項下對照品、供試品溶液及20%乙醇生理鹽水（空白透皮接收液）各適量，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，相同時間下對照品與供試品溶液存在相同色譜峰，空白透皮接收液不干擾雷公藤甲素的檢測（圖1）。（2）線性關系考察：取“2.2.1”項下對照品溶液，以甲醇稀釋，配制質量濃度為30.75、20.5、12.3、6.15、0.82、0.615 μg/mL的雷公藤甲素對照品系列溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以雷公藤甲素峰面積為縱坐標（A）、質量濃度為橫坐標（C）進行回歸分析，得回歸方程為A＝26.615C+13.300，R2＝0.999 8（n＝6）。結果表明，雷公藤甲素質量濃度在0.615～30.75 μg/mL線性范圍內與峰面積呈良好線性關系。（3）精密度考察：取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，雷公藤甲素峰面積的RSD為0.51%（n＝6），表明儀器精密度良好。（4）重復性考察：取雷公藤甲素組擴散24 h后的透皮接收液6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。結果顯示，雷公藤甲素峰面積的RSD為0.73%（n＝6），表明該方法重復性良好。（5）穩定性考察：取雷公藤甲素組擴散24 h后的透皮接收液，分別于放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD值為1.08%（n＝8），表明該樣品在24 h內穩定。（6）加樣回收率試驗：取雷公藤甲素組擴散24 h后的透皮接收液，測定其質量濃度，然后分別加入0.8、1、1.2倍該質量濃度的雷公藤甲素對照品，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，計算其加樣回收率。結果顯示，雷公藤甲素的平均加樣回收率為102.3%，RSD為4.05%（n＝3），表明該方法準確度良好。

圖1 專屬性考察的高效液相色譜圖

2.3 乳膏的制備及質量評價

2.3.1 乳膏的制備

根據本課題組前期研究結果[13-14]及制備乳膏的經驗，并結合預實驗結果，分別制備空白乳膏、雷公藤甲素乳膏、雷公藤甲素配伍川芎揮發油質量比為1∶10、1∶50、1∶100（以下分別簡稱“配伍1∶10”“配伍1∶50”“配伍1∶100”）的乳膏。

2.3.2 乳膏質量評價

（1）離心穩定性：稱取空白乳膏和雷公藤甲素乳膏及配伍乳膏各1 g，以3 500 r/min離心30 min，結果顯示，該條件下空白乳膏和雷公藤甲素乳膏及配伍乳膏均未見分層破乳現象。（2）耐寒、耐熱性評價：分別稱取空白乳膏和雷公藤甲素乳膏及配伍乳膏各1 g，置于EP管中，分別在45、4、－20 ℃的條件下放置24 h，結果顯示，上述寒熱條件均不會對乳膏產生影響。（3）含藥量：稱取雷公藤甲素乳膏和配伍1∶10、配伍1∶50、配伍1∶100乳膏各1 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容后渦旋、超聲使溶解，過0.22 μm微孔濾膜后按“2.2.2”項下色譜條件進行含量測定，每份樣品平行制樣3份。結果顯示，雷公藤甲素乳膏和配伍1∶10、配伍1∶50、配伍1∶100乳膏中雷公藤甲素的含藥量分別為（211.0±9.2）、（209.8±7.8）、（213.6±6.8）、（217.5±10.3）μg/g（n＝3）。

2.4 川芎揮發油對雷公藤甲素體外透皮性能的影響

2.4.1 小鼠離體皮膚的制備

取雄性KM小鼠30只，適應性喂養3 d，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉，脫毛后取下腹皮，用生理鹽水和棉球去除皮膚上多余的脂肪和淋巴組織，用螺旋測微儀測量皮膚厚度后迅速放入－20 ℃冰箱中保存備用。

2.4.2 乳膏體外透皮實驗

從－20 ℃冰箱中取出小鼠離體皮膚，置于37 ℃生理鹽水中解凍10 min，沖洗干凈后用濾紙吸干水分，將小鼠皮膚固定于Franz擴散池中的供給池和接收池之間，再向接收池中注入20%乙醇生理鹽水作為接收液，排盡氣泡后用封口膜密封，調節擴散池溫度為（37.0±0.2）℃，以350 r/min平衡30 min。將小鼠皮膚分為雷公藤甲素組和配伍1∶10、配伍1∶50、配伍1∶100組，分別取雷公藤甲素乳膏和配伍1∶10、配伍1∶50、配伍1∶100乳膏各0.2 g置于供給池中并確保乳膏和各組皮膚充分接觸（每組平行6份），分別于4、6、8、10、12、24 h時抽取接收液1 mL，并補充同體積同溫度的空白接收液。將取出的接收液按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，并按照如下公式計算各時間點的單位面積累計透皮量（Qn）：Qn＝，式中，A為擴散池的有效擴散面積，V為接收液總體積，Cn為第n次取樣時接收液中的藥物濃度，Ci為第i次取樣時接收液中的藥物濃度，Vi為第i次取樣體積。以Qn對時間（t）作線性回歸，所得斜率即為雷公藤甲素的透皮吸收速率（Jss）。分別采用零級動力學、一級動力學、Higuchi方程對釋放過程進行擬合，并計算決定系數（R2）。采用Graph Pad Prism 5.0和SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量數據以±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較時采用LSD-t檢驗，檢驗水準α＝0.05。

結果顯示，24 h內雷公藤甲素組和配伍1∶10、配伍1∶50、配伍1∶100組雷公藤甲素的Qn分別為（21.98±0.13）、（26.87±0.36）、（31.46±1.08）、（18.51±1.95）μg/cm2（n＝6），Jss分別為1.058、1.171、2.950、0.748/[μg/（cm2·h）]。與雷公藤甲素組比較，配伍1∶10組和配伍1∶50組24 h內雷公藤甲素的Qn（P＜0.01）和Jss有所升高；配伍1∶100組的Qn（P＜0.05）和Jss有所下降。各組雷公藤甲素的24 h累計滲透曲線見圖2。以Q24h對t進行擬合，結果顯示雷公藤甲素組的體外透皮釋放過程符合零級方程和Higuchi方程，配伍1∶10組和配伍1∶100組的體外透皮釋放過程更符合一級動力方程，而配伍1∶50組中雷公藤甲素的體外透皮釋放過程則更符合Higuchi方程。擬合結果見表2。

圖2 各組雷公藤甲素24 h累計滲透曲線

表2 各組經皮滲透實驗數據擬合結果（±s，n＝6）

表2 各組經皮滲透實驗數據擬合結果（±s，n＝6）

組別雷公藤甲素組配伍1∶10組配伍1∶50組配伍1∶100組零級方程擬合方程Q＝1.06t－2.94 Q＝1.17t－1.04 Q＝2.95t＋1.24 Q＝0.75t＋0.02 R 2 R 2 R 2 0.992 0.992 0.945 0.996一級方程擬合方程Q＝65.32（1－e－0.015t）Q＝84.66（1－e－0.015t）Q＝56.40（1－e－0.034t）Q＝269.92（1－e－0.003t）0.911 0.997 0.982 0.997 Higuchi 方程擬合方程Q＝7.47t1/2－15.08 Q＝8.25t1/2－14.40 Q＝8.94t1/2－11.83 Q＝5.27t1/2－8.51 0.992 0.984 0.991 0.988

2.5 川芎揮發油配伍雷公藤甲素對HaCat細胞毒性的影響

2.5.1 細胞培養

用含10%胎牛血清和含青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養基在37 ℃含5% CO2的培養箱中培養，待細胞生長至狀態穩定后，取對數生長期、生長狀態穩定的細胞進行后續實驗。

2.5.2 細胞毒性實驗

細胞毒性采用CCK-8法進行檢測。

（1）川芎揮發油和雷公藤甲素對HaCat細胞毒性的影響：取生長狀態穩定的對數生長期HaCat細胞，制備成密度為9×104個/mL的懸液，以S型接種于96孔板中，每孔200 μL，待細胞融合至80%～90%，棄去完全培養液，用不含鈣鎂的Hanks’平衡鹽溶液清洗2遍，根據課題組前期實驗和預實驗結果，分別用質量濃度為10、18、20、36、72、144、272、544 ng/mL的雷公藤甲素和1.155、5.75、11.55、115.5、1 150 μg/mL的川芎揮發油溶液處理細胞24 h，每個濃度設置6個復孔，另設不加藥物但加細胞的對照組和不加藥物、不加細胞的空白組。處理24 h后，吸去96孔板中的藥物，用不含鈣鎂的Hanks’平衡鹽溶液清洗，加入含10%CCK-8的基礎培養基溶液，每孔100 μL，將細胞置培養箱中孵育2 h后，置于酶標儀中檢測其在450 nm波長處的光密度（OD）值，并按公式計算細胞存活率：細胞存活率＝（給藥組OD值－空白組OD值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%。結果顯示，當雷公藤甲素質量濃度為20 ng/mL時、川芎揮發油質量濃度為11.55 μg/mL時，細胞存活率均大于90%，說明該濃度下二者單獨給藥均不會對HaCat細胞產生毒副作用，但隨著給藥濃度增大，HaCat細胞的存活率逐漸降低，結果見圖3。

圖3 雷公藤甲素和川芎揮發油對HaCat細胞毒性的影響

（2）川芎揮發油和雷公藤甲素配伍對HaCat細胞毒性的影響：按“2.5.2”（1）項下方法鋪板及培養細胞，再以雷公藤甲素質量濃度為18、36、72、144 ng/mL分別配伍川芎揮發油1∶10、1∶50、1∶100處理細胞并測定OD值后計算細胞存活率。結果，與雷公藤甲素組比較，雷公藤甲素質量濃度在36、72、144 ng/mL時，配伍1∶10組和配伍1∶50組可以顯著提高HaCat細胞的存活率（P＜0.05或P＜0.01），而配伍1∶100組細胞的存活率反而降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖4。

圖4 川芎揮發油和雷公藤甲素配伍前后對HaCat細胞毒性的影響

3 討論

雷公藤甲素作為雷公藤的主要活性成分，雖然臨床口服治療疾病的效果確切、療效顯著，但嚴重的肝腎毒性使其開發利用受到了極大的限制。本課題組前期制備雷公藤甲素外用制劑時發現，采用經皮給藥方式可以在發揮療效的同時顯著降低雷公藤甲素的肝腎毒性，但用于大鼠時出現了一定的皮膚毒性和皮膚屏障問題[15]。為進一步開發雷公藤甲素外用制劑并降低皮膚毒性，本課題組通過制備不同的載雷公藤甲素納米制劑進行經皮滲透性和皮膚毒性研究，結果發現，納米制劑雖然可以促進雷公藤甲素的透皮吸收，但外用給藥時會造成一定的皮膚損傷[16-17]。川芎揮發油作為川芎的主要活性成分，其不僅可以提高皮膚抗氧化能力，減少皮膚氧化損傷，還常作為藥物促滲劑與藥物協同發揮療效[18]。本次體外透皮實驗研究顯示，配伍1∶10和1∶ 50組的雷公藤甲素的Jss和Qn均高于雷公藤甲素組，表明配伍川芎揮發油可以顯著提高雷公藤甲素的經皮滲透性，其原因可能是川芎揮發油通過改變皮膚角質層有序致密的結構和角質層脂質來增加其流動性，進而降低皮膚屏障功能。但當配伍比例提高至1∶100時，川芎揮發油又會對雷公藤甲素的透皮吸收產生一定的抑制作用，原因可能是雷公藤甲素在高劑量川芎揮發油中的親和性增加，使藥物在皮膚的接觸界面（角質層）和藥物進入角質層后的活性表皮界面的分配系數發生改變，使皮膚表面濃度下降，導致Jss和Qn下降。

本研究在細胞毒性研究中發現，隨著藥物濃度的增加，單獨給予川芎揮發油和雷公藤甲素均會使HaCat細胞的存活率降低；而與雷公藤甲素比較，配伍1∶10和1∶50可以顯著提高HaCat細胞的存活率（P＜0.05），原因可能是川芎揮發油可通過介導內質網和線粒體功能來發揮氧化損傷保護作用；當配伍比例達到1∶100時，細胞存活率略低于單獨給予雷公藤甲素組，推測原因可能是當川芎揮發油和雷公藤甲素同時達到一定濃度后，二者會協同損傷細胞。

本實驗仍存在諸多不足，例如只參考了文獻和課題組前期經驗，選擇小鼠下腹皮和20%乙醇生理鹽水作為透皮接收介質來進行實驗，并未對其他動物皮膚進行比較研究，也沒有系統地進行接收介質的篩選[19-20]。同時，在乳膏的制備及評價中，本研究只參考了前期的制備經驗，并未進行系統的理化性質評價，后續本課題組將重點進行在體皮膚刺激性研究。

綜上所述，雷公藤甲素與川芎揮發油的配伍比例為1∶10和1∶50時可以促進雷公藤甲素的透皮吸收，降低雷公藤甲素對HaCat細胞的毒性。