“易層”貼敷對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜纖維化的改善作用及機制Δ

魏義保 ，馬振源 ，廖太陽 ，楊楠 ，吳鵬 ，王培民 ，2，黃正泉 #（.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院骨傷科，南京 20029；2.江蘇省中醫(yī)外用藥開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心，南京 20023）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見的慢性退行性疾病，好發(fā)于中老年人群，且致殘率較高。隨著人口老齡化的加劇，全球癥狀性KOA的患病率已達3.8%，成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一[1]。KOA是一種全關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病與關(guān)節(jié)軟骨及軟骨周圍組織的病理變化（如關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨改變和骨贅形成等）有關(guān)[2]。研究表明，滑膜病變在KOA的發(fā)病過程中具有重要作用。滑膜炎癥可能是KOA的始動環(huán)節(jié)，在滑膜炎癥的晚期通常伴隨著滑膜纖維化（synovial fibrosis，SF）的發(fā)生，后者以膠原異常重塑、纖維結(jié)締組織聚集和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為主要表現(xiàn)，被認為是患者膝關(guān)節(jié)僵硬、功能障礙的重要原因[3]。

“易層”貼敷是由全國名老中醫(yī)諸方受教授在傳統(tǒng)中醫(yī)貼敷療法的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗研制出的新型中醫(yī)外治方法。該貼敷共有兩層，第1層復方三黃油膏含黃柏、黃芩、大黃3味涼性中藥，可直接敷于患者皮膚；第2層三色散則由當歸、川牛膝等溫經(jīng)活血類中藥組成，性溫燥，具有活血、通絡(luò)、止痛之功；兩層中藥相輔相成，且可根據(jù)患者寒熱證型靈活調(diào)整用量，改善KOA患者的膝關(guān)節(jié)疼痛和活動受限等癥狀的療效較好[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“易層”貼敷不僅能夠緩解KOA模型大鼠的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)疼痛，還具有抑制SF的作用，上述作用可能與該貼敷能夠抑制高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）表達、維持促炎-抑炎因子動態(tài)平衡有關(guān)[6]。HMGB1是一種參與炎癥反應(yīng)的多功能蛋白，HMGB1/Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路與炎癥及纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[7]，故本課題組推測“易層”貼敷抑制KOA患者SF的作用可能與該通路有關(guān)。基于此，本研究擬基于HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路探討“易層”貼敷對KOA模型動物SF的干預機制，旨在為“易層”貼敷的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ABI 7500型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）、170-3930型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）、LAS 4000型凝膠成像發(fā)光系統(tǒng)（美國GE公司）、ELX 800型酶標儀（美國BioTek公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

“易層”貼敷由三色散（由當歸、獨活、川芎、秦艽、紫荊皮、馬錢子、丹參、赤芍、天花粉、防風、連翹、片姜黃、羌活、蔓荊子、白芷、木瓜、川牛膝、威靈仙、防己、甘草等組方而成，蘇藥制字Z04000566，每貼20 g，相當于生藥總量16 g）和復方三黃油膏（由黃芩、黃柏、大黃、東丹、滑石粉等組方而成，蘇藥制字Z04000388，每貼10 g，相當于生藥總量8 g）組成，兩者均由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院提供。

兔源轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（貨號分別為3711S、19245S）均購自美國CST公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、HMGB1、TLR4、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）、金屬蛋白酶組織抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ）抗體（貨號分別為AF7021、AF7020、AF7017、AF5006、AF2006、AF7007、AF7001）均購自美國Affinity公司；辣根過氧化物酶標記的親和純化山羊抗兔IgG（H+L）二抗（貨號K1223）購自美國APExBIO公司；5×蛋白上樣緩沖液（貨號P0015L）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA快速提取試劑盒（貨號AG21024）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒（貨號分別為R223-01、Q331-02）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；無蛋白快速封閉液（貨號PS108P）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號分別為YJ102828、F15810、YJ002859）均購自上海源桔生物科技中心。

1.3 實驗動物

本實驗選用2月齡SPF級雄性SD大鼠24只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2021-0011。所有動物均飼養(yǎng)于室溫（25±2）℃、相對濕度（60±5）%、每12 h晝夜交替的動物房內(nèi)，自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本動物實驗方案由南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核批準，申請?zhí)枮?02205A046。

2 方法

2.1 KOA模型制備與分組、給藥

將24只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、KOA組、易層組，每組8只。KOA組和易層組大鼠采取前交叉韌帶離斷法復制KOA模型：大鼠經(jīng)腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉，于膝關(guān)節(jié)處常規(guī)備皮消毒，打開膝關(guān)節(jié)腔并切斷前交叉韌帶（通過前抽屜實驗判斷模型是否復制成功）后，逐層縫合。假手術(shù)組大鼠僅切開膝關(guān)節(jié)處皮膚后縫合。術(shù)后，每只大鼠每天肌內(nèi)注射青霉素鈉1次，連續(xù)3 d，以預防感染。

造模14 d后，易層組大鼠于膝關(guān)節(jié)處備皮，皮膚表面先后均勻涂抹糊狀的三色散（每100 cm2涂抹8 g，按成品質(zhì)量計）和復方三黃油膏（每100 cm2涂抹5 g，按成品質(zhì)量計），隨后用紗布包裹并用膠帶固定，每天貼敷8 h，連續(xù)28 d[6]；假手術(shù)組和KOA組大鼠僅于膝關(guān)節(jié)備皮處用紗布包裹。

2.2 組織樣本的提取和保存

末次給藥后，所有大鼠于麻醉狀態(tài)下采集腹主動脈血，血樣靜置1.5 h后，于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上層血清于－80 ℃下凍存，備用。于膝關(guān)節(jié)處備皮，自髕骨上緣打開關(guān)節(jié)腔，用眼科鑷牽起髕骨及其周圍組織并翻開，暴露髕下脂肪墊及附著在上面的滑膜，小心切取滑膜組織。隨機選取每組3只大鼠的滑膜組織放入4%多聚甲醛中保存，其余5只大鼠的滑膜組織放入凍存管中于－80 ℃下保存，備用。

2.3 大鼠滑膜組織病理形態(tài)學觀察

取“2.2”項下固定于4%多聚甲醛中的各組大鼠滑膜組織，行常規(guī)石蠟包埋、切片，分別用蘇木精-伊紅（HE）、Masson試劑染色后，使用顯微鏡觀察各組大鼠的滑膜炎癥程度及纖維化程度。采用Krenn評分評價滑膜炎癥程度，評分標準為：無炎癥，記0～1分；有輕度炎癥，記2～4分；有重度炎癥，記5～9分[8]。

2.4 大鼠滑膜組織中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65蛋白陽性表達檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.3”項下各組大鼠滑膜組織的石蠟切片，脫蠟至水，并進行抗原修復；以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗5 min×3次，加入30 g/L的過氧化氫溶液適量，于室溫下孵育20 min；以PBS清洗5 min×3次，以封閉液于室溫下封閉30 min；棄去封閉液，滴加collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65一抗（稀釋比例均為1∶100），于4 ℃下孵育過夜；以PBS清洗5 min×3次，滴加相應(yīng)二抗（稀釋比例1∶500），于室溫下孵育60 min；以PBS清洗5 min×3次，以DAB復染細胞核，再經(jīng)脫水后封片，使用Image J軟件分析陽性表達細胞（呈棕色）的平均光密度值，并計算陽性表達細胞面積占比以表示上述蛋白的相對表達量。

2.5 大鼠血清中炎癥因子含量檢測

取“2.2”項下各組大鼠的血清樣品，嚴格參照相應(yīng)試劑盒說明書操作，采用ELISA法以酶標儀于450 nm波長處檢測其IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.6 大鼠滑膜組織中纖維化及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達檢測

采用Western blot法檢測。取“2.2”項下凍存的各組大鼠滑膜組織適量，研磨、裂解，以12 000 r/min離心15 min，取上清液。經(jīng)BCA法測定濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液適量，煮沸變性。取變性蛋白適量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，于室溫下封閉20 min；加入內(nèi)參（GAPDH）、纖維化相關(guān)蛋白（TGF-β、collagenⅠ、TIMP1、α-SMA）和HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白（HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65）一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；以TBST洗膜10 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶5 000），于室溫下孵育60 min；以TBST洗膜10 min×3次，用ECL顯色曝光并置于凝膠成像發(fā)光系統(tǒng)下成像。以GAPDH為內(nèi)參，分析并計算各目的蛋白的灰度值比值，用以表示各目的蛋白的相對表達量。

2.7 大鼠滑膜組織中纖維化及HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達檢測

采用實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time PCR）法檢測。取“2.2”項下凍存的各組大鼠滑膜組織適量，按照Trizol法常規(guī)提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后嚴格按照試劑盒說明書操作，進行PCR擴增。反應(yīng)體系包括：上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)包括預變性階段（95 ℃，30 s）、循環(huán)反應(yīng)階段（95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；共40個循環(huán)）和熔解曲線階段（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s）。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算各目的基因mRNA的相對表達量（結(jié)果以假手術(shù)組為參照進行歸一化處理）。各目的基因的引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 各目的基因的引物序列及產(chǎn)物大小

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 “易層”貼敷對大鼠滑膜組織病理形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，KOA組大鼠滑膜襯里細胞（以成纖維樣滑膜細胞為主）大量增生且排列不規(guī)則，炎癥細胞浸潤明顯增加；經(jīng)“易層”貼敷干預后，模型大鼠的滑膜表面相對光滑，滑膜襯里細胞排列有序，炎癥細胞浸潤較少。Masson染色結(jié)果顯示，KOA組大鼠可見大量膠原纖維沉積，提示SF發(fā)生；經(jīng)“易層”貼敷干預后，易層組大鼠SF程度明顯減輕。結(jié)果見圖1。此外，與假手術(shù)組[（0.33±0.52）分]比較，KOA組大鼠的Krenn評分[（5.83±0.75）分]顯著升高（P＜0.01）；與KOA組大鼠比較，易層組大鼠的Krenn評分[（2.50±0.84）分]顯著降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠滑膜組織病理形態(tài)學觀察的顯微圖（HE和Masson染色法）

3.2 “易層”貼敷對大鼠滑膜組織中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65陽性表達的影響

與假手術(shù)組比較，KOA組大鼠滑膜組織中collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65陽性表達細胞明顯增多，其表達均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與KOA組比較，易層組大鼠滑膜組織中上述蛋白的陽性表達細胞均有所減少，其表達均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖2、表2。

圖2 各組大鼠滑膜組織中collagenⅠ、HMGB1、p-NFκB p65蛋白陽性表達的顯微圖（免疫組化法）

表2 各組大鼠滑膜組織中collagenⅠ、HMGB1、p-NFκB p65蛋白的相對表達量比較（±s，n＝3）

表2 各組大鼠滑膜組織中collagenⅠ、HMGB1、p-NFκB p65蛋白的相對表達量比較（±s，n＝3）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b：與KOA組比較，P＜0.01；c：與KOA組比較，P＜0.05。

p-NF-κB p65/%10.37±1.40 16.32±0.39a 12.90±1.10c組別假手術(shù)組KOA組易層組collagenⅠ/%4.89±0.83 18.52±0.97a 10.31±0.66b HMGB1/%4.15±0.36 12.76±0.65a 10.17±1.32c

3.3 “易層”貼敷對大鼠血清炎癥因子含量的影響

與假手術(shù)組比較，KOA組大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01）；與KOA組比較，易層組大鼠血清中上述指標含量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（±s，n＝8，pg/mL）

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（±s，n＝8，pg/mL）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b：與KOA組比較，P＜0.01。

組別假手術(shù)組KOA組易層組TNF-α 36.21±0.89 87.47±0.89a 56.86±1.09b IL-1β 5.33±0.11 12.89±0.09a 6.56±0.15b IL-6 23.90±1.19 41.04±0.63a 30.41±0.84b

3.4 “易層”貼敷對大鼠滑膜組織中纖維化相關(guān)蛋白及mRNA表達的影響

與假手術(shù)組比較，KOA組大鼠滑膜組織中TGF-β、collagenⅠ、TIMP1、α-SMA蛋白及mRNA的表達均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與KOA組比較，易層組大鼠滑膜組織中上述指標的表達均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖3、表4。

圖3 各組大鼠滑膜組織中纖維化相關(guān)蛋白表達的電泳圖

表4 各組大鼠滑膜組織中纖維化相關(guān)蛋白及mRNA表達比較（±s，n＝5）

表4 各組大鼠滑膜組織中纖維化相關(guān)蛋白及mRNA表達比較（±s，n＝5）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b：與KOA組比較，P＜0.05；c：與KOA組比較，P＜0.01。

組別假手術(shù)組KOA組易層組蛋白mRNA α-SMA 1 2.19±0.26a 1.48±0.35b TGF-β 0.21±0.04 0.52±0.12a 0.35±0.08b collagenⅠ0.15±0.01 0.61±0.05a 0.38±0.02c TIMP1 0.40±0.01 0.83±0.05a 0.56±0.01c α-SMA 0.33±0.06 1.19±0.10a 0.55±0.08c TGF-β 1 5.33±0.37a 1.15±0.08c collagenⅠ1 4.10±0.41a 1.12±0.17c TIMP1 1 5.12±0.07a 1.17±0.01c

3.5 “易層”貼敷對大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及mRNA表達的影響

與假手術(shù)組比較，KOA組大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR4蛋白及mRNA，p-NF-κB p65蛋白及NFκB p65 mRNA的表達均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與KOA組比較，易層組大鼠滑膜組織中上述指標的表達均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。而各組大鼠滑膜組織中NFκB p65蛋白的表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖4、表5。

表5 各組大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及mRNA表達比較（±s，n＝5）

表5 各組大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白及mRNA表達比較（±s，n＝5）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b：與KOA組比較，P＜0.01；c：與KOA組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組KOA組易層組蛋白mRNA HMGB1 0.11±0.01 0.68±0.11a 0.21±0.04b TLR4 0.40±0.03 1.42±0.24a 0.68±0.10b NF-κB p65 0.39±0.02 0.38±0.19 0.37±0.03 p-NF-κB p65 0.55±0.07 1.56±0.05a 0.75±0.10b HMGB1 1 2.20±0.37a 1.56±0.33c TLR4 1 4.81±0.97a 1.70±0.31b NF-κB p65 1 3.06±0.20a 1.86±0.95b

4 討論

KOA晚期患者膝關(guān)節(jié)滑膜通常會發(fā)生以ECM沉積、纖維結(jié)締組織聚集等為主要特征的纖維化病變，從而引發(fā)炎癥和組織損傷[9]，這也是導致患者膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和功能障礙的首要原因。中醫(yī)把纖維化病機歸為風、寒、濕、邪侵襲所導致的經(jīng)脈瘀阻、筋骨屈伸不利[10]。現(xiàn)代中醫(yī)理論認為，溫經(jīng)活血類中藥可針對其虛、寒、瘀的病機特點，經(jīng)多靶點、多途徑發(fā)揮對纖維化病變的干預作用，在各種纖維化疾病的治療領(lǐng)域中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢[11]。“易層”貼敷作為一種新型的中醫(yī)外治療法，其方中含有當歸、丹參、川牛膝等溫經(jīng)活血類中藥，同時具有安全性高、副作用少等優(yōu)點，在KOA的臨床治療方面取得了良好的效果[4，12]。

研究指出，SF的發(fā)生與滑膜炎癥密切相關(guān)，KOA患者大多伴有滑膜炎癥，膝關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥環(huán)境較為復雜，且長期的慢性炎癥可能會導致上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，這種轉(zhuǎn)化也是各種纖維化疾病的常見誘因之一[13]；此外，纖維化是機體內(nèi)一種過度的修復反應(yīng)，炎癥環(huán)境是誘發(fā)纖維化的潛在因素之一[14]。可見，滑膜炎癥的嚴重程度可反映SF的進展情況。本研究通過ELISA法檢測了大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，結(jié)果顯示，KOA大鼠血清中上述炎癥因子的含量均較假手術(shù)組大幅增加，而易層組大鼠的上述指標含量則顯著降低。HE染色結(jié)果顯示，相較于假手術(shù)組，KOA組大鼠滑膜襯里細胞（以成纖維樣滑膜細胞為主）增生明顯且排列紊亂，炎癥細胞浸潤增加，Krenn評分顯著升高；而易層組大鼠滑膜病變明顯改善，且Krenn評分顯著降低，表明“易層”貼敷可顯著改善KOA大鼠的滑膜炎癥。

纖維化的形成與膠原蛋白表型的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，纖維狀膠原蛋白collagenⅠ的表達與纖維化的嚴重程度呈正相關(guān)，是經(jīng)典的纖維化標志物[15]。TGF-β、TIMP1、α-SMA均為纖維化相關(guān)因子，參與調(diào)節(jié)ECM的組成和介導多種纖維化的發(fā)生[16]。本研究檢測了各組大鼠滑膜組織中纖維化相關(guān)蛋白及mRNA的表達情況，結(jié)果顯示，KOA組大鼠滑膜組織中纖維化相關(guān)指標TGF-β、collagenⅠ、TIMP1、α-SMA蛋白及mRNA的表達均顯著上調(diào)，而易層組大鼠上述蛋白及mRNA的表達均顯著下調(diào)。Masson染色結(jié)果顯示，相較于假手術(shù)組，KOA組大鼠的滑膜組織存在大量的膠原纖維增生；而經(jīng)“易層”貼敷干預后，大鼠的SF程度明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示，KOA組大鼠滑膜組織中collagenⅠ沉積較假手術(shù)組顯著增多，而易層組大鼠上述指標得以逆轉(zhuǎn)。這提示，“易層”貼敷很可能通過抑制各種炎癥因子的表達而抑制纖維化的發(fā)生，從而改善KOA。

HMGB1是一種參與炎癥反應(yīng)的多功能蛋白，在組織修復和纖維化中具有關(guān)鍵作用，可參與各種器官纖維化疾病的發(fā)生[17]。通常情況下，HMGB1存在于細胞核中；在感染或損傷期間，HMGB1會發(fā)生遷移，逐漸從細胞核轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)，再移動到細胞外[18]。HMGB1/TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導與炎癥的發(fā)生及ECM的合成密切相關(guān)：釋放到細胞膜外的HMGB1與靶細胞的TLR4結(jié)合后，可激活下游NF-κB信號通路，進而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)并誘發(fā)纖維化，因此抑制HMGB1可顯著減少組織炎癥反應(yīng)并改善纖維化[19]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)“易層”貼敷干預后，大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白（HMGB1、p-NF-κB p65）的表達均較KOA組顯著下調(diào)；此外，Western blot、real-time PCR實驗結(jié)果也顯示，易層組大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR4蛋白及mRNA，p-NF-κB p65蛋白及NF-κB p65 mRNA的表達均較KOA組顯著下調(diào)，提示“易層”貼敷改善KOA大鼠SF的作用可能與其抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，“易層”貼敷可改善KOA模型大鼠的SF，降低炎癥及纖維化相關(guān)指標的含量/表達，抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路可能與這一作用的發(fā)揮有關(guān)。然而，本研究僅設(shè)置了“易層”貼敷單一劑量組，后續(xù)本課題組將進一步考察不同劑量的干預效果，并進一步明確“易層”貼敷對KOA SF的改善作用及機制。