山茱萸新苷對糖尿病腎病模型小鼠的保護作用及機制Δ

王威，甘嘯陽，許惠琴 ，朱逸暉，束安梅，富瑩雪，喻斌，呂高虹（南京中醫藥大學藥學院/江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，南京 210023）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，也是許多患者進展至終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因。DN由多種因素相互作用所致，其中高血糖、高血壓和遺傳因素是關鍵[1]。DN的主要特征包括腎小球肥大、超濾，基底膜增寬，腎小管間質纖維化和腎小球硬化等，臨床主要表現為不同程度的蛋白尿[2]。近年來，我國DN發病率大幅上升，常規療法雖然有效，但仍有大部分患者會進展為ESRD，給其家庭和社會帶來了巨大的醫療負擔。因此，提高對DN發病機制的認識并開發有效的治療藥物十分必要。

腎臟功能障礙和炎癥反應是DN的2個主要發病機制，蛋白尿及腎小球間質纖維化是DN的重要標志[3]。晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）在DN的病理生理過程中具有重要作用[4]。研究指出，AGEs與其受體（the receptor of advanced glycation end products，RAGE）結合而引發的氧化應激和炎癥反應最終會導致腎功能喪失[5]。由于腎臟是一種生物能量需求較高的器官，高血糖可使其小動脈和微血管發生玻璃樣變性和纖維蛋白樣變性，從而導致腎線粒體受損、腎小管上皮細胞生物能量缺失，最終造成間質纖維化伴腎小管萎縮和腎小球硬化[6]；同時，單核-巨噬細胞浸潤及活化產生的炎癥因子又可進一步引起腎臟固有細胞損傷，進而加速DN的進展[7-8]。

山茱萸新苷（cornuside，分子式C24H30O14）是一種山茱萸環烯醚萜苷類化合物，可抑制大鼠輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）浸潤中樞神經系統，從而改善自身免疫性腦脊髓炎[9]；同時，該化合物可抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）向核內轉移，降低其轉錄活性，并減少其下游炎癥因子[如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）]分泌，從而抑制肥大細胞參與的炎癥變態反應[10]。本課題組前期實驗發現，山茱萸新苷可抑制AGEs誘導的小鼠腎系膜細胞增殖，但其能否改善DN尚不明確。基于此，本研究以DN模型小鼠為對象，基于AGEs/RAGE信號通路初步探討山茱萸新苷對DN模型小鼠的保護作用及潛在機制，以期為山茱萸新苷在DN治療中的應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Contour TS型血糖儀購自拜耳醫藥保健有限公司；Bio-Rad 164-5050型凝膠電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Image Quant LAS 4000 mini型凝膠成像儀購自美國GE公司；BX41型顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；BioTek Synergy-HT型酶標儀購自美國BioTek公司；Direct-Q型超純水儀購自美國Millipore公司。

1.2 主要藥品與試劑

山茱萸新苷對照品（批號S-125-190404，純度＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；氨基胍原料藥（陽性對照，批號079K1734V，純度100%）購自美國Sigma公司；小鼠尿蛋白檢測試劑盒（批號20190619）、小鼠血清肌酐（serum creatinine，Scr）檢測試劑盒（批號20191008）均購自南京建成生物工程研究所；血糖試紙購自拜耳醫藥保健有限公司；小鼠血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、IL-12和IL-10酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號均為201909）均購自上海酶聯生物科技有限公司；兔源RAGE、Ⅳ型膠原（collagen typeⅣ，COL-Ⅳ）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）多克隆抗體（批號分別為GR316801-2、GR269410-2、GR3174950-9）均購自英國Abcam公司；兔源β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號AA1217B8088 ZJ2）購自美國BioWorld公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號7074P2）購自美國CST公司；ECL發光液（批號1819702）購自美國Millipore公司；RIPA組織/細胞裂解液、2.5%Gluta固定液、10%中性福爾馬林固定液（批號分別為R0020、20190820、20190822）均購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化檢測試劑盒（批號PH1698）購自上海邁新生物技術有限公司；二甲苯（批號CB0130912）購自南京化學試劑有限公司。

1.3 實驗動物與飼料

SPF級雄性KK-Ay小鼠18只[8～10周齡，體重（28±2）g]、SPF級雄性C57BL/6J小鼠6只[8～10周齡，體重（22±2）g]和高脂高糖飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0008。普通飼料購自南京青龍山動物繁殖場。本實驗方案經南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（申請號201903A019）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

取KK-Ay小鼠，用高脂高糖飼料喂養2周，以空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）≥10 mmol/L、24 h尿蛋白較C57BL/6J小鼠升高超過10倍為DN模型建立成功的判定標準[11]。將造模成功的小鼠隨機分為模型組、氨基胍組（陽性對照，100 mg/kg）、山茱萸新苷組（100 mg/kg），并以C57BL/6J小鼠作為正常組，每組6只。各藥物組劑量參考本課題組前期研究結果設置，并以10 mL/kg的容積灌胃[12]；正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水；每天1次，連續8周。

2.2 小鼠FBG和24 h尿蛋白水平檢測

分別在給藥后第0、4、8周，禁食12 h后采集各組小鼠尾靜脈血適量，使用血糖儀檢測其FBG；通過代謝籠收集其24 h尿液，離心，取上清液，參照尿蛋白試劑盒說明書方法以酶標儀檢測其24 h尿蛋白水平。

2.3 小鼠血清中IL-12、IL-10、BUN、Scr水平檢測

在給藥后第8周，于小鼠眼眶取血，靜置0.5 h后，以3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，參照相應試劑盒說明書方法以酶標儀檢測小鼠血清中炎癥因子（IL-12、IL-10）和腎功能指標（BUN、Scr）水平。

2.4 小鼠腎臟病理損傷形態學和纖維化水平觀察

于眼眶取血后，脫頸椎處死各組小鼠，分離腎臟并橫切左側腎皮質適量，置于10%中性福爾馬林固定液中固定，脫水，用石蠟常規包埋后切片，分別進行蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色，置于顯微鏡下觀察其腎皮質的病理損傷和纖維化改變。

2.5 小鼠腎小球微觀結構觀察

采用透射電鏡進行觀察。取各組小鼠左側腎皮質適量，在2.5%Gluta固定液中固定，分別用50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，用環氧樹脂包埋后切片，再進行枸櫞酸鉛-醋酸鈾染色，置于透射電鏡下觀察其腎小球微觀結構。

2.6 小鼠腎皮質中RAGE蛋白陽性表達檢測

采用免疫組化法進行檢測。取“2.4”項下各組小鼠的腎皮質切片，置于二甲苯中固定20 min×2次以脫蠟，再依次用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇脫水，每次5 min；用水沖洗，采用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復；用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗5 min×3次，用3%過氧化氫溶液覆蓋切片20 min進行內源性過氧化物酶滅活，再以牛血清白蛋白室溫封閉1 h；加入RAGE一抗（稀釋度1∶100），于4 ℃下孵育過夜；用PBS清洗2 min×3次，加入相應二抗（稀釋度1∶100），于室溫下孵育1 h；用PBS清洗5 min×3次，加入DAB顯色；用水沖洗，蘇木精復染2 min；用水沖洗，經乙醇脫水、二甲苯透明后，使用中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察RAGE蛋白陽性表達（呈棕黃色）情況，利用Image J軟件對其熒光強度進行定量分析。

2.7 小鼠腎皮質中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。在冰上剪取各組小鼠的腎皮質適量，置于10 mL離心管中，加入裂解液1 mL，勻漿裂解多次后，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，收集上清液，以BCA法進行定量；將上清液與5×蛋白上樣緩沖液以體積比4∶1混合后，于95 ℃煮沸變性5 min；取變性蛋白適量，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，以含5%牛血清白蛋白的封閉液室溫封閉2 h；加入RAGE、COL-Ⅳ、iNOS、β-actin一抗（稀釋度1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；用PBST緩沖液清洗3次，加入相應二抗（稀釋度1∶2 000），室溫孵育2 h；以ECL發光液顯色后，置于凝膠成像儀下成像。以β-actin為內參，利用Image J軟件分析各目標蛋白的表達量。

2.8 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。數據以±s表示，多組間采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 山茱萸新苷對DN模型小鼠FBG和24 h尿蛋白水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠給藥后第0、4、8周的FBG和24 h尿蛋白水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，各藥物組小鼠給藥后第4、8周的FBG（氨基胍組給藥后第4周除外）、24 h尿蛋白均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 山茱萸新苷對DN模型小鼠FBG和24 h尿蛋白水平的影響（±s，n＝6）

表1 山茱萸新苷對DN模型小鼠FBG和24 h尿蛋白水平的影響（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組氨基胍組山茱萸新苷組FBG/（mmol/L）24 h尿蛋白/mg給藥后第8周0.06±0.11 1.23±0.23a 0.54±0.14c 0.36±0.11c給藥后第0周5.5±0.5 18.1±3.8a 17.1±3.9 17.9±4.7給藥后第4周5.3±0.7 19.9±3.4a 21.0±4.0 16.9±4.1b給藥后第8周5.0±0.8 21.1±6.7a 13.6±5.2b 10.9±3.5c給藥后第0周0.06±0.08 1.37±0.04a 1.19±0.10 1.30±0.06給藥后第4周0.11±0.15 1.52±0.42a 1.05±0.28b 1.16±0.16b

3.2 山茱萸新苷對DN模型小鼠血清中IL-12、IL-10、BUN、Scr水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清促炎因子IL-12、BUN、Scr水平均顯著升高，抗炎因子IL-10水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠血清IL-12、BUN、Scr水平均顯著降低，IL-10水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

表2 山茱萸新苷對DN模型小鼠血清中IL-12、IL-10、BUN、Scr水平的影響（±s，n＝6）

表2 山茱萸新苷對DN模型小鼠血清中IL-12、IL-10、BUN、Scr水平的影響（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組氨基胍組山茱萸新苷組IL-12/（pg/mL）42.84±1.54 57.31±7.39a 46.47±3.82b 44.08±2.45b IL-10/（pg/mL）290.15±24.16 233.79±10.93a 290.15±11.62b 285.30±12.42b BUN/（mmol/L）13.59±2.19 28.81±2.45a 20.32±1.51b 17.45±1.39b Scr/（μmol/L）17.42±5.81 65.61±14.91a 41.03±11.68b 48.20±6.64b

3.3 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質病理損傷和纖維化改變的影響

與正常組比較，模型組小鼠腎皮質中腎小球系膜基質明顯增厚并出現空泡變性，部分間質區域可見明顯的炎癥細胞浸潤。與模型組比較，各藥物組小鼠腎皮質中腎小球結構較為完整，腎小球系膜基質增生程度減輕，間質內炎癥細胞浸潤有所減少。結果見圖1。

圖1 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質病理損傷影響的顯微圖（HE染色）

與正常組比較，模型組小鼠腎皮質纖維陽性染色細胞明顯增加，提示小鼠腎皮質膠原沉積增多，間質纖維化水平升高。與模型組比較，各藥物組小鼠腎皮質纖維陽性染色細胞有所減少，表明小鼠腎皮質膠原沉積減少，間質纖維化水平降低。結果見圖2。

圖2 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質纖維化改變影響的顯微圖（Masson染色）

3.4 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎小球微觀結構的影響

與正常組比較，模型組小鼠腎小球系膜增生嚴重且基質增多，基底膜增厚并可見大量不規則塊狀暗色致密物沉積。與模型組比較，各藥物組小鼠腎小球系膜細胞增生減少，基底膜增厚現象有所緩解，不規則塊狀致密物沉積有所減少。結果見圖3。

圖3 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎小球微觀結構影響的顯微圖（透射電鏡）

3.5 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質中RAGE蛋白陽性表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠腎皮質中RAGE蛋白陽性表達明顯增多，其熒光強度顯著增強（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組小鼠腎皮質中RAGE蛋白陽性表達明顯減少，其熒光強度均顯著減弱（P＜0.05）。結果見圖4、表3。

圖4 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質中RAGE蛋白陽性表達影響的顯微圖（免疫組化法）

表3 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白表達的影響（±s，n＝6）

表3 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白表達的影響（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組氨基胍組山茱萸新苷組免疫組化實驗（RAGE）3.176±0.571 10.029±1.813a 5.663±0.680b 5.380±0.517b Western blot實驗iNOS 0.169±0.050 0.556±0.106a 0.371±0.020c 0.344±0.012c RAGE 0.172±0.034 0.457±0.057a 0.272±0.047b 0.262±0.068b COL-Ⅳ0.223±0.010 0.676±0.151a 0.386±0.160b 0.306±0.139b

3.6 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠腎皮質中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白的表達量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組小鼠腎皮質中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白的表達量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖5、表3。

圖5 山茱萸新苷對DN模型小鼠腎皮質中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白表達影響的電泳圖

4 討論

隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，DN的發病率逐年增高。DN的典型病理特征是蛋白尿，其發生、發展與腎小球濾過屏障的結構完整性和腎功能的改變密切相關[13]。COL-Ⅳ是一種主要分布在基底膜區域內的膠原蛋白，其在腎小球和系膜沉積中表達增加所導致的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）堆積可能與腎損傷程度呈正相關[14-15]。長期高血糖環境會引起腎小管細胞、腎小球內皮細胞等發生炎癥反應，其表現包括分泌單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），激活、促進巨噬細胞向腎臟募集，分泌IL-12、TNF-α、iNOS等炎癥因子，最終誘發DN炎癥損傷；同時，腎功能受損與炎癥反應共同作用，進一步加速了DN的進展[16-17]。

中醫藥在DN的治療中具有悠久的歷史和顯著的療效，以滋陰清熱、補腎健脾、益氣養陰為主要治則。山茱萸味酸澀、性微溫，具有平補腎陰陽、澀精固脫的功效，在《金匱要略》“腎氣丸”、《醫學衷中參西錄》“滋膵飲”等方中均有使用，可主治“消渴證”。本課題組前期研究發現，山茱萸環烯醚萜苷類成分馬錢苷可通過抑制AGEs/RAGE信號通路來保護腎功能，并可減少ECM堆積和糖原沉積，抑制足細胞凋亡[18]；同時，本課題組前期也初步證實了另一山茱萸環烯醚萜苷類成分山茱萸新苷對AGEs的抑制作用。氨基胍是一種非酶糖基化AGEs抑制劑，可通過阻礙AGEs的形成來延緩DN進展，可改善DN模型大鼠腎臟炎癥反應和纖維化水平[19]，故本研究將其作為陽性對照藥物。基于對DN發病機制和山茱萸新苷抗炎特性的認識，本研究以C57BL/6J小鼠為對照，以KK-Ay小鼠（C57BL/6J小鼠與KK輕度肥胖型2型糖尿病小鼠雜交并近親繁殖所得）構建DN小鼠模型，評價該成分對小鼠的保護作用。結果顯示，山茱萸新苷可下調模型小鼠體內促炎因子IL-12的分泌和iNOS的表達，上調抗炎因子IL-10的分泌，減輕其腎臟炎癥反應；除發揮抗炎作用外，山茱萸新苷還可顯著減少模型小鼠的尿蛋白水平和COL-Ⅳ在腎皮質中的沉積，下調Scr、BUN水平，緩解腎纖維化，減輕腎病理損傷。

AGEs/RAGE信號通路在DN的發病機制中具有核心作用[20]。其中，RAGE蛋白參與多條通路（磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素、絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調節激酶等通路）的信號轉導，可通過刺激各種信號級聯而促進促炎因子的產生，繼而造成腎小球肥大、系膜基質積聚、足細胞丟失和蛋白尿發生，促進腎臟炎癥和纖維化的發生發展，導致腎結構扭曲，最終導致腎功能喪失[21]。為了進一步探討山茱萸新苷能否通過影響AGEs/RAGE信號通路干預DN，本研究檢測了DN模型小鼠腎皮質中RAGE蛋白的表達情況。結果顯示，山茱萸新苷可下調DN模型小鼠腎皮質中RAGE蛋白的表達，初步驗證其對DN模型小鼠的保護作用可能是通過抑制AGEs/RAGE信號通路激活實現的。

綜上所述，山茱萸新苷對DN模型小鼠具有一定的保護作用，可抑制其體內炎癥反應，降低小鼠尿蛋白水平，緩解腎臟纖維化；上述作用可能與抑制AGEs/RAGE信號通路有關。