大田玉米接種禾谷鐮刀菌的不同方法比較

劉 建 陳 旭 李新新 鄒文玉 唐國來 張東鶴 蘇培森 徐瑞斌 葉海龍

（1 上海市農業技術推廣服務中心，上海 201103；2 上海航育種子有限公司，上海 201100；3 聊城大學農學與農業工程學院，山東聊城 252000；4 北京市農林科學院玉米研究所，北京 100097）

玉米是我國最重要的農作物之一，用途非常廣泛，不僅是深受人民喜愛的口糧作物，而且由于其富含淀粉和脂肪，也是重要的飼料作物[1-2]。同時，由于玉米的高產和適應性強，還是人類在生產中利用最多的谷類作物，加工制成的淀粉以及發酵成的酒精是醫藥、化工、能源和紡織等產業的重要原料[3-4]。目前我國玉米種植面積和總產已經超過了水稻和小麥，成為種植面積和總產最高的農作物[3]，因此玉米種植安全是我國農業和工業發展的重要保障。

禾谷鐮刀菌是一種田間危害非常廣泛的真菌病原菌，主要危害玉米、水稻和小麥等多種禾谷類作物，在玉米中會引起青枯病、莖基腐病和穗粒腐病等多種病害，是玉米中發生最普遍、危害最嚴重和防治最困難的真菌性病害[5-8]。關于禾谷鐮刀菌接種方法的研究相對較少，目前主要是通過菌絲埋根法和牙簽法插入等方法接種，但是往往不能取得較好的接種效果，所以研究玉米禾谷鐮刀菌的接種時期和接種方法，了解玉米禾谷鐮刀菌的接種規律，對于抗禾谷鐮刀菌玉米新品種的培育以及抗禾谷鐮刀菌農藥的研制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料禾谷鐮刀菌菌絲和孢子液由上海市農作物種子質量檢測中心繁殖。玉米材料為目前玉米研究應用最廣泛的源自美國的純合自交系B73，該自交系是玉米最早全基因組測序的品系，由上海市農業科學院作物育種栽培研究所提供。

1.2 試驗地點室內試驗于2023 年5 月在上海市農作物種子質量檢測中心進行，大田試驗于2023 年5-9 月在上海航育種子基地進行。

1.3 試驗方法

1.3.1 禾谷鐮刀菌孢子液培養方法取40g 完整綠豆于1L 純凈水中，加熱煮沸10min，無菌棉紡布過濾，取上清液于試劑瓶中得綠豆湯培養液，靜置放涼。取少許新鮮培養的禾谷鐮刀菌菌絲于綠豆湯培養液中，置于搖床在28℃和220r/min 條件下培養3d。取培養后的禾谷鐮刀菌孢子液進行4000r/min離心富集，并在顯微鏡下利用血球計數板對孢子進行計數，經無菌水稀釋后，調整禾谷鐮刀菌孢子達到104個/mL，得到禾谷鐮刀菌孢子接種液，現配現用。

1.3.2 玉米種植方法全部采用育苗移栽的方式進行種植，將B73 玉米種子置于苗床中培養，直至2葉1 心時，于傍晚進行大田移栽。田間小區種植應注意株距和行間距，便于大田接種試驗。本試驗采用田間小區行距0.7m，株距0.3m，行長10m，種植小區間隔2m，便于接種。每個處理種植3 個小區，每個小區移栽25 株，做好玉米防蟲和施肥工作。在傍晚進行病菌接種，并在接種后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天進行大水漫灌1 次（下雨天除外），接種24d 后，觀察大田玉米發病情況。

1.3.3 玉米移栽時間為保證在苗期、拔節期和抽穗期的玉米接種時間一致，消除不同時期天氣對禾谷鐮刀菌接種效果的影響，本試驗首先確定共同接種時間，通過查閱上海市往年氣象資料，確定7-8 月份平均溫度約為29℃，平均降水量在40mm 以上，適合禾谷鐮刀菌的自然生長繁殖；其次確定了3 次育苗移栽的時間，分別是5 月初、6 月初和7 月初，5 月初移栽玉米用于7 月上旬抽穗期玉米接種，6 月初移栽玉米用于7 月上旬拔節期玉米接種，7 月初移栽玉米用于本月上旬苗期玉米接種。

1.3.4 大田玉米苗期接種方法待玉米生長至第3片葉完全展開時進行接種。灌根法：用注射器吸取5mL 孢子液，打入根部土壤附近。注射法：用普通醫用注射器吸取1mL 孢子液，斜向下45°插入玉米中胚軸的中心，然后縮回打出針管內玉米組織后，再次沿插入軌跡插入注射。噴霧法：每株用針頭輕微劃傷最幼嫩的葉片，將孢子液噴于受傷葉片表面。

1.3.5 室內玉米苗期接種試驗每組根據《農作物種子檢驗規程》在30℃沙培條件下培養箱培養，待生長至第1 片葉完全長出時（播種3d 后）進行接種，每組均勻播種25 粒。采用灌根法、注射法和噴霧法3 組接種處理，每組3 個重復，接種方法參照大田玉米苗期接種方法。播種10d 后根據水分情況澆灌稀釋1000 倍的花無缺植物營養液，培養箱設置濕度100%，接種2 周后，觀察玉米發病情況。

1.3.6 大田玉米拔節期接種方法待玉米生長至第6 片葉完全展開時進行接種。灌根法：用注射器吸取5mL 孢子液，打入根部土壤附近。注射法：用獸用注射器吸取1mL 孢子液，斜向下45°插入玉米莖基部中心，然后縮回打出針管內玉米莖稈組織后，再次沿插入軌跡插入注射。噴霧法：每株用針頭輕微劃傷最幼嫩的葉片，將孢子液噴于受傷葉片表面。

1.3.7 大田玉米抽穗期接種方法待玉米生長至雄穗完全抽出時進行接種。灌根法、注射法及噴霧法操作同拔節期的接種方法。

1.3.8 玉米禾谷鐮刀菌田間鑒定標準接種24d 后進行田間性狀的鑒定，觀察是否有莖部褐色病斑、莖基部是否變軟、是否發生青枯、是否發生倒伏來作為田間判定玉米禾谷鐮刀菌發病情況的標準。

1.3.9 數據分析主要采用SPSS 22.0 和Microsoft Excel 2003 進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 禾谷鐮刀菌的鑒定為了確定所接種的真菌類型為禾谷鐮刀菌，本研究進行了禾谷鐮刀菌的形態學鑒定。首先通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA 培養基）接種禾谷鐮刀菌，3d 后正面可以看到氣生菌絲呈白色至淺黃色的絮狀物鋪滿整個PDA培養基（圖1A），反面呈現淺錦葵紅色（圖1B），符合禾谷鐮刀菌PDA 培養基生長特性；其次取禾谷鐮刀菌孢子液進行顯微鏡下觀察，發現大型分生孢子呈典型鐮刀型，孢子有2～7 個分格，頂細胞漸細，腹細胞平直（圖1C），符合禾谷鐮刀菌孢子典型性狀。綜上，本試驗所采用的真菌材料均為禾谷鐮刀菌。

圖1 禾谷鐮刀菌形態學鑒定

2.2 大田玉米苗期不同接種方法比較玉米苗期是指從播種發芽到拔節期前的生長期，本研究選擇第3 片葉完全展開時進行接種，一方面是由于移栽后長出的新葉可以保證玉米幼苗移栽成功，另一方面玉米種子生長到3 葉期的時間相對較短，如果篩選到有效的接種方法，將大大縮短試驗時間。通過灌根法、注射法和噴霧法對大田內玉米幼苗進行禾谷鐮刀菌的接種，24d 后對玉米植株進行莖部褐色病斑、莖基部是否變軟、青枯和倒伏情況的統計，發現3 種接種方法玉米發病率均較低，平均發病率低于6%，且沒有明顯差異（圖2），表明玉米苗期可能不適合禾谷鐮刀菌的接種。

圖2 大田玉米苗期不同接種方法發病率比較

2.3 室內玉米苗期不同接種方法比較以上研究表明大田條件下苗期玉米接種發病效果較差，但是大田苗期玉米的接種可能容易受到紫外線、溫度或濕度等自然條件的影響，為了更準確地排除外在條件的影響，采取了培養箱種植接種的方法進行鑒定，但是由于受到培養箱玉米生長條件的限制，只采取了苗期玉米培養箱接種鑒定的方法，并且在第1 片葉完全展開時進行了禾谷鐮刀菌的接種。研究發現，室內玉米苗期接種禾谷鐮刀菌的發病率仍然較低，發病率均低于6%，并且3 種禾谷鐮刀菌接種方法均沒有差異（圖3），這說明在本試驗確定的研究方法中，玉米苗期可能不適合禾谷鐮刀菌的接種鑒定。

圖3 室內玉米苗期不同接種方法發病率比較

2.4 大田玉米拔節期不同接種方法比較玉米拔節期是指玉米從第6 片葉完全展開到第11 片葉完全展開的階段，是玉米幼穗生長最旺盛的時期。本研究以玉米第6 片葉完全展開時通過注射法、噴霧法和灌根法對玉米幼苗進行禾谷鐮刀菌的接種，24d 后對玉米植株進行莖部褐色病斑、莖基部發病情況、青枯和倒伏情況的統計，發現3 種方法接種效果差異顯著，注射法顯著高于灌根法，灌根法顯著高于噴霧法。值得注意的是噴霧法和灌根法接種后的發病率較低，玉米發病率低于15%，注射法接種后玉米的發病率在25%左右，相對于灌根法和噴霧法的接種效果有一定程度的提高（圖4），表明如果要縮短試驗時間可以考慮在拔節初期采用注射法對玉米進行禾谷鐮刀菌接種。

圖4 玉米拔節期不同接種方法發病率比較

2.5 玉米抽穗期不同接種方法比較玉米抽穗期是指雄穗完全抽出的時期，是決定玉米產量的關鍵時期。本研究以玉米雄穗剛好完全抽出時進行接種，24d 后通過對玉米發病情況的統計，發現注射法的接種效果顯著高于噴霧法和灌根法，玉米的田間發病率接近50%，接種效果較好。噴霧法和灌根法接種后發病率較低，玉米的田間發病率低于15%（圖5），表明在抽穗期采用注射法對玉米進行禾谷鐮刀菌的接種效果較好。

圖5 玉米抽穗期不同接種方法發病率比較

2.6 玉米拔節期和抽穗期采用注射法接種禾谷鐮刀菌的田間性狀比較上述研究表明，在拔節期和抽穗期對玉米采用注射法接種禾谷鐮刀菌田間發病效果相對較好，所以本試驗對其田間發病的性狀進行了具體的統計，發現玉米抽穗期的田間接種效果明顯好于拔節期（圖6）。在拔節期進行注射接種玉米禾谷鐮刀菌后，超過20%的玉米植株莖部出現褐色病斑且莖基部變軟，約10%的玉米植株出現青枯和倒伏；在抽穗期進行注射接種玉米禾谷鐮刀菌后，超過40%的玉米植株發生莖部病斑且莖基部變軟，超過20%的玉米植株發生了青枯和倒伏（圖6）。結果表明，玉米抽穗期通過莖基部注射禾谷鐮刀菌孢子的方法各個指標均優于拔節期接種，是更適合玉米田間接種禾谷鐮刀菌的方法。

圖6 拔節期和抽穗期玉米注射法接種禾谷鐮刀菌的田間性狀比較

3 結論與討論

本試驗表明抽穗期玉米禾谷鐮刀菌接種的效果優于拔節期、拔節期的接種效果優于苗期，和前人的研究結果類似[9]。這可能與禾谷鐮刀菌的繁殖條件有關，禾谷鐮刀菌作為一種真菌更適合生長在富含糖類營養物質的條件下，玉米苗期和拔節期糖類等有機物合成相對較少，抽穗期及后期玉米屬于生殖生長，其莖稈含有大量可溶性糖類等營養物質用于籽粒的生長，所以玉米在抽穗期后可能更容易被禾谷鐮刀菌侵染，本研究關于室內苗期接種的數據也支持這一結果。但是目前關于禾谷鐮刀菌侵染玉米的生理機制研究還較少，并且玉米生長前期接種禾谷鐮刀菌不容易發病的詳細機制也有待進一步的研究。在玉米拔節期和抽穗期通過注射禾谷鐮刀菌孢子液的染病效果要顯著優于其他方法，這可能與禾谷鐮刀孢子入侵植物時需要傷口以及需要長時間保持較高濃度和活性有關。在大田進行禾谷鐮刀菌孢子的接種容易受到干旱、紫外線和溫度的影響，但是通過將禾谷鐮刀菌注射到玉米莖內，能較長時間地保持濕潤的入侵環境，且能較少受到其他不利因素的影響，有利于玉米植株感染禾谷鐮刀菌。所以，通過在玉米抽穗期進行莖基部注射禾谷鐮刀菌孢子的接種方法可能更有利于玉米發病。

近年來，我國玉米主要采用秸稈還田、密植栽培和綠色農藥防治等方式進行種植，秸稈還田大大增加了土壤病原菌的基數，特別是在小麥、水稻和玉米等禾谷類作物上都可繁殖的病菌，其還田秸稈成為了自然培養基，玉米再種植后極易染病。密植栽培又增加了病原菌在不同玉米植株之間傳播的速度。目前登記的在玉米上可以防治禾谷鐮刀菌的綠色農藥非常少，且防治效果較差，造成玉米莖基腐病和穗腐病等土傳病害逐年加重。玉米禾谷鐮刀菌接種試驗周期一般較長，發病率容易受溫度、濕度和光照等自然條件影響，目前關于玉米抗禾谷鐮刀菌生理及分子機理的研究相對較少。如果能從本研究確定的接種方法結合全基因組關聯分析或數量基因定位等生物信息學方法挖掘出玉米相關抗病基因，對于篩選抗病種質資源以及玉米抗禾谷鐮刀菌基因的快速鑒定將具有重要的意義。