銀杏內酯B調控miR-155-5p對高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡的影響

秦美靈,吳春麗,陳延玲,廉波,尚海玉,韓英

(濟南市中西醫結合醫院,1.內分泌科;2.治未病中心;3.財務科,山東 濟南 271100)

腎小管上皮細胞損傷與糖尿病腎病密切相關,長期的高糖刺激可引發過量活性氧產生,誘導腎細胞氧化應激和炎癥反應,促進腎小管上皮細胞凋亡,導致腎小管損傷[1-4]。銀杏內酯B(ginkgolide B,GB)是從銀杏葉中提取的活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[5]。GB對糖尿病腎病具有保護作用,可降低糖尿病腎病小鼠的高血糖、血清總膽固醇和甘油三酯濃度,減少尿白蛋白排泄,改善腎臟損傷,是糖尿病腎病的有效治療選擇[6];但其作用機制尚不明確。微小RNA(microRNA,miRNA)屬于短鏈非編碼RNA分子,可通過靶向調控靶基因表達而參與多種生理病理過程。miR-155-5p是一種與炎癥反應有關的miRNA,在糖尿病腎病中表達上調,可能與患者的疾病分期或糖尿病腎病的發病機制有關,是糖尿病腎病診斷和治療的重要靶點[7]。本研究通過高糖(high glucose,HG)誘導腎小管上皮細胞損傷模型,擬探討GB能否通過調控miR-155-5p抑制HG誘導的腎小管上皮細胞凋亡及炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

上海詩丹德提供GB(純度≥98%);上海通派生物提供人腎小管上皮細胞HK-2;美國Thermo Fisher提供Trizol試劑;美國Invitrogen提供Lipofectamine2000;北京天根生化提供反轉錄、SYBR Green試劑盒;廣州銳博生物提供anti-miR-NC、anti-miR-155-5p、miR-NC、miR-155-5p mimics;北京索萊寶提供凋亡檢測試劑盒;上海酶聯生物提供IL-6、TNF-α檢測試劑盒;美國Abcam提供兔抗人Bcl-2相關X蛋白(BCL2-associated X protein,Bax)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體;美國CST提供內參GAPDH抗體、山羊抗兔IgG二抗。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組與轉染 將HK-2細胞在25 mmol/L 葡萄糖的DMEM培養基培養24 h[8],取對數生長期細胞記為HG組。加入含有濃度為5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養24 h,記為NG組。HG+低劑量GB組(HG+GB-L組,25 μmol/L GB[9]與25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養24 h)、HG+中劑量GB組(HG+GB-M組,50 μmol/L GB與25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養24 h)、HG+高劑量GB組(HG+GB-H組,100 μmol/L GB與25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養24 h)、HG+anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC后用25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基處理24 h)、HG+anti-miR-155-5p組(轉染anti-miR-155-5p后用25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基處理24 h)、HG+GB+miR-NC組(轉染miR-NC后用100 μmol/L GB與25 mmol/L葡萄糖的 DMEM培養基共同處理24 h)、HG+GB+miR-155-5p組(轉染miR-155-5p mimics后用100 μmol/L GB與25 mmol/L葡萄糖的 DMEM培養基共同處理24 h)。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將1.2.1中各組HK-2細胞離心取上清,按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測凋亡情況。

1.2.3 ELISA法檢測炎性因子水平 將1.2.1中各組HK-2細胞取上清液,按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α的水平。

1.2.4 RT-qPCR檢測miR-155-5p的表達水平 將1.2.1中各組HK-2細胞用Trizol試劑盒提取總RNA,并用逆轉錄試劑盒得到cDNA,隨后進行qRT-PCR,采用2-△△Ct法計算miR-155-5p相對表達水平。

1.2.5 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達量 將1.2.1中各組HK-2細胞破碎后提取總蛋白,用BCA試劑盒進行濃度定量,按步驟將蛋白SDS-PAGE電泳、轉膜,5 %脫脂奶粉封閉2 h,在4 ℃下加入一抗Bcl-2、Bax、(1∶1 000)和GAPDH過夜孵育,清洗,在4 ℃下加入二抗(1∶3 000),孵育2 h。用ECL發光顯影,觀察拍照,各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 GB對HG誘導的HK-2細胞凋亡情況比較

與NG組比較,HG組細胞凋亡率、Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);與HG組比較,GB不同劑量組細胞凋亡率、Bax水平降低,Bcl-2升高,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1。

2.2 GB對HG誘導的HK-2細胞炎性因子比較

與NG組比較,HG組細胞培養上清液中IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05);而GB不同劑量組細胞培養上清液中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05),且呈劑量依賴性。見圖2。

2.3 GB對HG誘導的HK-2細胞中miR-155-5p表達的影響

與NG組比較,HG組HK-2細胞中miR-155-5p的表達量升高(P<0.05),而GB不同劑量組HK-2細胞中miR-155-5p表達降低(P<0.05),且呈劑量依賴性。見圖3。

2.4 miR-155-5p轉染效率的檢測

與anti-miR-NC組比較,anti-miR-155-5p組miR-155-5p的表達量降低(P<0.05);與miR-NC組比較,miR-155-5p組miR-155-5p的表達量升高(P<0.05)。見圖4。

2.5 抑制miR-155-5p對HG誘導的HK-2細胞凋亡、炎性因子的影響

與HG+anti-miR-NC組比較,HG+anti-miR-155-5p組細胞凋亡率、Bax蛋白水平和細胞培養上清液中IL-6、TNF-α水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見圖5。

2.6 過表達miR-155-5p對GB處理的HG誘導的HK-2細胞凋亡、炎性因子的影響

與HG+GB+miR-NC組比較,HG+GB+miR-155-5p組細胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05),表明過表達miR-155-5p可減弱GB對HG誘導的HK-2細胞凋亡、炎性因子的影響。見圖6。

3 討論

高血糖誘發的腎小管細胞損傷在糖尿病腎病的發病機制中起關鍵作用[10]。此外,糖尿病腎病的發生發展與高血糖引起的炎癥和細胞凋亡有關,調節炎癥和細胞凋亡是減輕高糖誘導的腎細胞損傷的重要途徑[11]。本研究中,HG誘導的腎小管上皮細胞凋亡率升高,IL-6、TNF-α水平增加,且Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低,與既往的研究[12-13]結果一致,表明腎小管上皮細胞損傷模型構建成功。

GB是一種植物來源的萜類化合物,是銀杏葉提取物中的天然生物活性成分之一,具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、清除自由基等多種藥理活性[14-16]。Li等[17]以高糖培養的大鼠腎小管上皮細胞為對象,使用高效液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)對銀杏葉提取物的生物活性成分進行分析發現,GB是銀杏葉提取物中對糖尿病腎病具有預防作用的潛在生物活性成分之一。本研究中,GB能抑制HG誘導的腎小管上皮細胞凋亡,并降低HG刺激下腎小管上皮細胞中IL-6、TNF-α水平,表明GB可抑制HG誘導的腎小管上皮細胞炎癥因子表達和細胞凋亡,對高糖誘導的腎小管上皮細胞發揮保護作用。

糖尿病腎病患者腎臟組織中可見豐富的miRNA表達,且表達量可在一定程度上反映患者的病情,miRNA與糖尿病腎病進展密切相關[18-19]。其中炎癥相關的多功能基因miR-155-5p在糖尿病腎病患者腎組織、血清和尿液中均呈高表達[20-21];其高表達與糖尿病腎病患者的嚴重程度有關[22]。此外,miR-155-5p在糖尿病腎病腎小管損傷中發揮重要作用,其表達敲低可減輕HG誘導的腎小管上皮細胞損傷[23]。本研究中,HG誘導的腎小管上皮細胞中miR-155-5p的表達量升高,抑制miR-155-5p表達可抑制HG誘導的腎小管上皮細胞凋亡,并可降低IL-6、TNF-α水平;表明下調miR-155-5p表達可減輕HG誘導的腎小管上皮細胞損傷,與既往的研究[23]結果一致。Guo等[24]發現,在糖尿病腎病大鼠模型和HG誘導的大鼠腎小管上皮細胞中miR-155-5p表達增加,二氫楊梅素可通過下調miR-155-5p的表達來抑制糖尿病腎病大鼠腎間質纖維化和HG誘導的腎小管上皮細胞纖維化,提示miR-155-5p可能為糖尿病腎病診斷和治療的重要靶點。本研究中,GB可降低HG誘導的腎小管上皮細胞中miR-155-5p的表達量,過表達miR-155-5p可減弱GB對HG誘導的腎小管上皮細胞損傷的改善作用,提示GB可能通過抑制miR-155-5p的表達來減輕HG誘導的腎小管上皮細胞損傷。

綜上,GB可通過抑制細胞凋亡及炎癥因子表達來減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷,其作用機制可能與抑制miR-155-5p的表達有關。