氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法（GC-MS/MS）測定茶葉中19種鄰苯二甲酸酯*

林柏緯

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

0 引言

我國作為茶葉之鄉，自唐宋以來在國際上一直享有很高的聲譽。福建茶種植悠久歷史，擁有得天獨厚的自然條件，作為國內重要茶產品供應地之一，福建茶自古就暢銷國內外。然而，近年來隨著經濟不斷地發展，茶葉產地不斷擴大，茶葉質量安全事件也隨之增加，進而嚴重影響了我省茶葉產業發展。其中環境污染物，特別是有機污染物中的鄰苯二甲酸酯（Phthalate esters,PAEs）越來越受到專家學者們的重視[1]。

PAEs 是由鄰苯二甲酸同醇發生酯化反應所產生的，有著無色、易揮發、難溶于水等特性。PAEs在全球產量大、應用面廣，常作為一種增塑劑使用，且在我國的使用率高達84%[2]。PAEs被添加到塑料中，能使塑料材料具有更好的拉伸性和延展性，此外，部分還用作化妝品的定香劑等[3]。但由于PAEs與塑料材料之間連接不穩定（兩者間由氫鍵或范德華力連接）[4-7]，從而使得其易發生遷移，雖急性毒性不大，但在體內積累會干擾人們體內激素的分泌，會對人體內的生殖系統造成傷害以及導致體內激素分泌功能失調、免疫力功能減退、兒童性早熟、心血管疾病、肝臟和其他泌尿系統傷害等[8-11]。近年來“塑化劑”事件層出不窮，如2011年產生惡劣影響的臺灣“塑化劑”事件，“起云劑”被用于一些食品的生產和加工中，“起云劑”中含有化學成分酞酸雙(2-乙基己基)酯（DEHP）對人體有害，“起云劑”的添加導致大量的食品受到污染。

目前常見的檢測方法有液相法（HPLC）[12-14]、液-質法[15]、氣相法（GC）[16-17]、氣-質法（GCMS）[17-21]、氣-質-質法（GC-MS/MS）[22-24]等。GCMS/MS相較其他方法具有高速、高效分離的特點，同時還具有提高效率、縮短檢測周期，準確定性，降低檢測成本等優點。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

正己烷(色譜級，回流重蒸），丙酮色（色譜級，回流重蒸），二氯甲烷(色譜級，回流重蒸)；MIPs/SPE (CNW BOND，0.1 g/mL，德國CNW公司)；MgSO4（分析純，西隴化學試劑有限公司）；PSA[粒度4 μm，技爾（上海）商貿有限公司]；MWCNTS(粒徑5 nm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；19種PAEs基本信息（見表1）。

表1 19種PAEs基本信息

1.2 儀器與設備

氣質聯用儀（美國Agilent公司，Agilent 7000D）；高速冷凍離心機（Sigma公司，SIGMA 3-18KS）；超聲波振蕩器(日本avio,SW-D600S-48)；旋渦混勻器（德國IKA公司，MS 3 basic）；K600粉碎機(德國Braun)。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

標準儲備液的配制：使用移液管移取1 mL的19種鄰苯二甲酸酯（PAEs）混合標準品（濃度為100 μg/mL），定容到25 mL（定容溶劑為正己烷），獲得4 μg/mL的標準儲備液，冷藏保存。

標準工作溶液的配制：從標準儲備液中逐級稀釋，得到0.005、0.01、0.05、0.5、2.5 μg/mL的標準工作溶液。

1.3.2 前處理步驟

將25 g茶葉粉碎成均勻粉末，取2.50 g粉末放入離心塑料管中，加入10 mL正己烷，超聲震蕩提取30 min。以12000 r/min的速率離心5 min，收集上層清液，將清液氮吹至近干，用正己烷定容至2.0 mL，渦旋混合后待凈化。

依次使用正己烷(色譜級）及二氯甲烷(色譜級)活化MIPs/SPE柱，然后加入3 mL正己烷。取上述復溶清液至活化好的分子印記柱內凈化，等待液面緩慢下降至最低處，然后用5 mL二氯甲烷淋洗柱子，再用5 mL二氯甲烷洗脫，將洗脫的液體氮吹至近干，用正己烷定容到1.0 mL，渦旋混勻，然后將混合液轉移至進樣瓶中，等待進行氣質聯用儀測定。

1.3.3 儀器條件

色譜柱選擇：DB-5ms 低流失氣相色譜柱（規格：長度30 m，內徑0.25 mm，膜厚度0.25 μm）。

進樣口溫度：260 ℃，升溫模式為程序控制，進樣方式采取不分流進樣，到分流出口吹掃流量60 mL/min，吹掃時間1 min；進樣量1 μL，載氣流量1 mL/min。程序升溫設置詳見表2。

表2 升溫程序

離子源參數：EI(電子轟擊型離子源)，源溫度280 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度290 ℃，碰撞氣為氮氣；溶劑延遲時間4.5 min；MRM模式。質譜參數見表3。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的選擇

QuEchERS 提取效率主要受溶劑種類、濃度等因素影響[25]。

⑴ 溶劑種類——不同溶劑的極性和溶解度不同，會對PAEs的提取效率產生影響。極性較高的溶劑可以更好地溶解PAEs，從而提高提取效率。常用的提取溶劑正己烷、丙酮或者二氯甲烷等[26]。我們按照前面方法處理了不含PAEs的茶樣，并進一步加入了0.100 mg/kg的混合標準溶液，測得各種PAEs的回收率平均值（見表4），實驗結果表明正己烷的提取回收率最高，且在實驗中發現丙酮和二氯甲烷提取液中含有大量色素雜質，顏色較深。

表4 提取條件對平均回收率的影響

⑵ 提取溫度——提取的溫度也會影響PAEs的提取效率。溶劑濃度越高，提取效率也會相應提高。

⑶ 提取時間——提取時間也會影響PAEs的提取效率。時間過短可能會導致提取不充分，時間過長回收率增長不明顯。實驗發現正己烷提取時間為10、30、60 min時，回收率分別為81.9%、93.7%、97.2%。

綜合上述因素，故選用正己烷作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

文獻報道中QuEchERS凈化方法和固相萃取凈化法較為常見，有機酸、茶多酚和兒茶素類物質能夠被PSA有效去除，但PSA去除非極性物質效果不好，例如脂肪類物質、色素以及維他命類化合物等。此外，添加多壁碳納米管、弗羅里硅土和石墨化碳都可以吸附色素類物質，其中多壁碳納米管在色素吸附方面的效果最為優秀，但實驗過程中嘗試使用弗羅里硅土、C18、乙二胺基-N-丙基、多壁碳納米管、石墨化碳等填料進行凈化[27]。結果表明，若未使用多壁碳納米管和石墨化碳，對樣品中的大量色素雜質的去除效果很差，且在使用多壁碳納米管和石墨化碳的情況下，19種PAEs的無法得到一個滿意回收率，因此QuEchERS凈化法不適用于凈化19種PEAs提取液。經過綜合考慮，我們選擇了CNWBOND分子印跡固相萃取凈化法[21]。實驗結果表明，19種PAEs的平均回收率區間為80%～102.4%，且凈化效果良好。分子印跡-固相萃取法對目標化合物的特異選擇性強，對于茶葉這種基質相對復雜的提取液，能夠很好地從中分離出PAHs，同時具有較強的富集能力，能吸附低濃度的目標化合物[2]。

2.3 質譜條件的選擇

根據歐盟2002/657/EC指令規定，質譜確證方法必須達到4個定性點（一個質譜離子為一個確證點），低分辨GC-MS除了確定母離子，還需要2個以上的子離子，在識別出PAEs的母離子后，對子離子進行全掃描（Full Scan）分析二級質譜。我們選取了2個豐度較強的離子，將其作為定量子離子；豐度弱一點的離子，用于協助定性。

為提升質譜的分析效果，通過調整CE（碰撞能量）、電子能量、Resolution（分辨率）等質譜參數進行優化調節，確保PAEs的特征離子對強度達到最大。為優化質譜的參數，母離子的選擇是基于豐度高和質量數大的離子，因此對19種目標化合物進行Full Scan。經查閱相關文獻[16]，此原理在50～500質荷比(m/z)的范圍內能較好地選擇最佳的監測離子和碰撞能量，有助于消除雜質的干擾。在選定的色譜條件下，通過全掃描的方式，得到加標濃度為0.10 mg/kg的基質加標樣品提取溶液的19種PAEs總離子流（TIC）色譜圖（圖1），目標化合物之間基本不存在干擾且采集的靈敏度高。

圖1 EI-MRM總離子流色譜圖

2.4 線性范圍與相關系數

基質匹配標準溶液和純溶劑標準溶液的工作曲線濃度為0.005、0.010、0.050、0.250、2.500 mg/L，目標物的質量濃度(X,mg/kg)和峰面積（Y）分別為線性回歸方程的橫坐標和縱坐標，得到19種PAEs的線性方程Y=aX-b，常數a和b相關系數、檢出限及定量限見表5，相關系數(r)在0.9989～0.9999范圍內，線性相關性強。因此，在標準曲線線性范圍內，19種目標物化合物線性較好，計算得到檢出限在0.0001～0.002 mg/kg范圍內（3倍的信噪比，按稱樣2.50 g，定容1.0 mL）。

2.5 方法的準確度和精密度

經過優化后以綠茶空白樣品為基質，進行加標回收試驗，加標回收濃度水平為0.020、0.100、0.500 mg/kg，每個水平做3個平行，得到的結果見表6。在不同水平添加條件下，19種PAHs的加標回收率在89.4%～109.2%區間，相對標準偏差為1.6%～7.2%，可以看出該方法有著良好的準確度和精密度。

表6 綠茶樣品在0.020、0.100、0.500 mg/kg加標水平下19種PAEs的回收率和精密度

2.6 實際樣品分析

使用本文建立的檢測方法對70份茶葉樣品中的19種PAEs進行了測定，樣品包括壽眉、貢眉、鐵觀音、茉莉花茶、烏龍茶、正山小種等常見茶葉，結果發現所有樣品均檢測出含有PAEs（見表7），表明茶葉中存在一定的PAEs污染，19種PAEs的平均含量范圍為4.7～841.2 μg/kg，這說明不同PAEs化合物的含量存在差異。因此，可以認為PAEs污染在茶葉中是普遍存在的，應該引起足夠的重視和關注。

表7 實際樣品中PAEs的檢出率、最小值、最大值和平均值

3 結論與討論

本研究建立了茶葉中19種多環芳烴的氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法(GC-MS-MS)。采用超聲提取和MIPs/SPE凈化的方式進行樣品前處理，可以有效地提高同時處理樣品的批次數，極大地縮短了試驗時間，且能得到準確的定量結果。總之，該方法具有試驗時間短、靈敏度高和定量準確等優勢，對加強市場茶葉監管，提升茶葉品質水平，保障消費者食品安全等都有著積極促進作用。