微生物肥料菌種篩選及優(yōu)化

曹 熙，王恩彪，任曉珍，趙 歡

沈陽(yáng)科技學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110167

植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指在植物根系土壤中生存的有益菌，不僅可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還具有防病害和提高作物收成的作用。目前發(fā)現(xiàn)的具有防病促生潛能的多個(gè)種類(lèi)和屬性的根系微生物包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、農(nóng)桿菌屬（A grobacterium）以及埃文氏菌屬（Eriwinia）等[1-2]。

在農(nóng)作物生產(chǎn)中應(yīng)用微生物肥料可以明顯起到增加產(chǎn)量和提高品質(zhì)的效果。研究表明，施用微生物肥料可以明顯促進(jìn)水稻、玉米等糧食作物植株的生長(zhǎng)和產(chǎn)量的增加，同時(shí)減少化肥的使用[3]。植物根際促生細(xì)菌能夠通過(guò)多種途徑促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。因此，對(duì)PGPR 植物的生長(zhǎng)促進(jìn)機(jī)理和促進(jìn)微生物肥料產(chǎn)業(yè)化的詳細(xì)研究，已然成為當(dāng)前對(duì)資源合理利用和環(huán)境保護(hù)具有重要意義的研究熱點(diǎn)。

通過(guò)前期對(duì)菌株進(jìn)行分離純化、篩選及培養(yǎng)，得到了13 株具有高效解磷作用的菌株。本研究通過(guò)對(duì)試驗(yàn)菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗作用及與玉米大斑病病原菌拮抗作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出制備微生物肥料的目標(biāo)菌種。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

LB 培養(yǎng)基、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌鑷子、無(wú)菌牛津杯、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機(jī)、分光光度計(jì)。

1.1.1 試驗(yàn)菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗作用評(píng)價(jià)方法[4]

無(wú)菌培養(yǎng)皿底部倒一層已滅菌的LB 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后，在距平皿中心2.5 cm 處放置經(jīng)180 ℃干熱滅菌1 h 的牛津杯，每皿放3 個(gè)，呈等邊三角形。將滅好菌的LB 固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約20 mL，紫外燈下開(kāi)蓋冷卻后將牛津杯拔出，使固體平板上形成菌液池。

取100 μL 于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h 的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液，加入制作好的平皿中央，涂布均勻。每個(gè)菌液池內(nèi)加100 μL 于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h 的試驗(yàn)菌株發(fā)酵液，每皿的3 個(gè)菌液池互為對(duì)照，以接種等量無(wú)菌培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待解淀粉芽孢桿菌長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平皿后，觀察菌液池周?chē)欠癞a(chǎn)生抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.1.2 試驗(yàn)菌株與玉米大斑病病原菌拮抗作用評(píng)價(jià)方法[5-6]

無(wú)菌培養(yǎng)皿底部倒一層已滅菌的LB 固體培養(yǎng)基，待LB 培養(yǎng)基凝固后，在距平皿中心2.5 cm 處放置經(jīng)180 ℃干熱滅菌1 h 的牛津杯，每皿放3 個(gè)，呈等邊三角形。將滅好菌的PDA 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，每皿約20 mL，紫外燈下開(kāi)蓋冷卻后將牛津杯拔出，使固體平板上形成菌液池。

平皿中心接種玉米大斑病病原菌菌餅，在菌液池內(nèi)加入100 μL 試驗(yàn)菌株發(fā)酵液，每皿的3 個(gè)菌液池互為對(duì)照，以接種等量無(wú)菌培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至空白板上，菌絲生長(zhǎng)至菌液池邊緣。測(cè)量抑菌帶寬度（細(xì)菌菌落邊緣至病原菌菌絲邊緣的距離）及玉米大斑病原菌菌落半徑（玉米大斑病菌餅邊緣至菌絲邊緣的距離），并計(jì)算抑菌率：（空白對(duì)照玉米大斑病病原菌菌落半徑-接種實(shí)驗(yàn)菌的平皿上玉米大斑病原菌菌落半徑）×100%/空白對(duì)照玉米大斑病病原菌菌落半徑。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗作用評(píng)價(jià)結(jié)果

試驗(yàn)菌株與解淀粉芽孢桿菌拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

將解淀粉芽孢桿菌及試驗(yàn)菌株培養(yǎng)24 h 后，觀察到其中8 個(gè)平皿上出現(xiàn)抑菌圈，說(shuō)明13 株菌中有8 株菌與解淀粉芽孢桿菌存在不同程度的拮抗作用。其中，HF47.0 及HF48.1 兩株菌于解淀粉芽孢桿菌拮抗作用最強(qiáng)，HF40.0 次之。HF34.0、HF36.0、HF43.1、HF43.2、HF48.2 五株菌與解淀粉芽孢桿菌不存在拮抗作用，可作為備選菌株加入微生物肥料。

2.2 試驗(yàn)菌株與玉米大斑病病原菌拮抗作用評(píng)價(jià)結(jié)果

試驗(yàn)菌株與玉米大斑病病原菌拮抗作用評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)菌株與玉米大斑病病原菌拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

除HF34.0 菌株外，13 株試驗(yàn)菌中其余12 株菌對(duì)玉米大斑病病原菌均有拮抗作用。其中，HF29.0及HF36.0 兩株菌對(duì)玉米大斑病抑菌率達(dá)到70.0%，抑菌效果最好。其次，解淀粉芽孢桿菌及HF45.0、HF48.1、HF48.2、HF48.3、HFTY 等6 株菌的抑菌率達(dá)到60 %以上。

3 總結(jié)

在分離純化得到的13 株具有解磷作用的菌株中，5 株與解淀粉芽孢桿菌不存在拮抗作用，11 株對(duì)玉米大斑病病原菌的抑菌率達(dá)到50 %以上。其中，HF29.0 及HF36.0 兩株菌對(duì)玉米大斑病病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)到70 %。

通過(guò)前期評(píng)價(jià)，初步選定HF36.0、HF43.1、HF48.2 三株菌作為目標(biāo)菌劑添加至微生物肥料中。