單細胞測序技術在發育與育種研究的新進展

耿肖涵

福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117

1 單細胞測序技術

以第二代、第三代為主要研究的基礎：混合細胞測序（Bulk cell Sequencing）技術，是一項檢測細胞群體信息的整體技術，無法準確定位到每一細胞的具體變化[1]。于是，單細胞技術隨之誕生。單細胞測序技術是從細胞水平上對生物體的細胞遺傳物質進行擴增與測序。

2 單細胞分離與獲取

目前，獲取單細胞的技術種類較多，其中有限稀釋技術（Limited dilution technology）和顯微分離操作技術（Micromanipulator technology），在組織學與個體發育的研究中發揮重要的作用。但隨著計算機的引入，上述兩種技術的使用率已經下降。激光顯微切割（Laser capture microdissection，LCM）是在顯微鏡下發射高激光，利用細胞群與轉運膜緊密結合而特異性地捕獲細胞，從而獲得一定范圍內同種來源的細胞。熒光激活細胞分選（Fluorescence activated cell sorting，FACS）是在流式細胞技術的基礎上，使用光學系統對具有可識別抗體的細胞進行定位，將異質性的細胞收集到不同的裝置中，此技術準確度高、通量高。微流控技術（Microfluidics）是在細胞級尺度下對細胞流體進行操控，在小體積封閉系統內將細胞分離，是生物學、計算機、物理學等多學科交叉形成的技術，因其操作簡單、成本與技術難度低、樣品消耗小、獲得效率高和通量高等多項優點而被廣泛應用[2]。

3 單細胞測序類型

由于細胞類群與研究目的的不同，研究者需要從不同角度與層面揭示細胞類群的差異，這就要求使用不同的手段進行實驗研究。其中，單細胞測序包括單細胞全基因組測序（Whole -genome amplification，WGA）、單細胞轉錄組測序（Single cell RNA sequencing, scRNA-seq）、單細胞表觀組測序（Single cell epigenome sequencing）和單細胞多組學研究（single cell multi-omics sequencing）。這些不同的測序技術基本上可以滿足目前對生物組織和細胞生命的研究。

3.1 單細胞全基因組測序

WGA 技術常用來證明細胞類群的不同，分析單個細胞的點突變位置與其他基因突變，可以精準地獲取單細胞的突變來源及基因突變的頻率，解釋類細胞在生命體內的功能、細胞類群演化及發育過程，可以準確地測出細胞的全部遺傳物質，但難以有效獲取高保真的細胞基因擴增產物。WGA 技術是研究細胞遺傳信息最為基礎的一個手段，所延伸的方法類型也相對較多，包括簡并寡核苷酸引物PCR（Degenerate Oligonucleotide -Primed Polymerase Chain Reaction ，DOP-PCR），原理是在引物的3’末端插入6 bp 的隨機核酸序列，與細胞遺傳物質結合[3]；多位點置換擴增（Multiple Displacement Amplification ，MDA）使用phi29DNA 聚合酶，在體系中與外源性的六聚體發生結合，反應可以得到50～100 kb 大小的DNA 片段。除此之外，在MDA 技術的基礎上與傳統的PCR 技術結合形成MALBACs（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycle），原理是利用堿基的簡并性，設計特異性的引物片段與DNA 模板結合，在DNA 鏈置換酶的環境下進行體外擴增，在3’端產生具有特異性標記的中間產物，隨后在新一輪的擴增中，于5’端產生與3’端互補的末端，在一輪擴增結束后單鏈成環，最終不斷擴增得到產物。

3.2 單細胞轉錄組測序

scRNA-seq 指從組織器官或生物體液中分離出細胞，進行高精度、無偏差、高分辨率的轉錄組測序，獲得信息并建庫，最終對整個細胞的數據進行分析[4]。單細胞轉錄組測序技術在生殖系統、組織器官發育、動物育種，以及神經系統、腫瘤生物等多個領域被廣泛運用。

3.2.1 生殖系統發育研究

單細胞轉錄組測序最早應用于對生殖系統的研究，主要包括生殖腺體與生殖細胞，同時也包括受精卵細胞，但迄今為止仍然有較多的結論需要被證實。研究人員對小鼠的新生雌性胎鼠（P0.5）卵巢中單個生殖細胞進行RNA-seq 分析，建立卵母細胞發育的整體通路。

3.2.2 組織、器官發育研究

Seow 等人利用單細胞轉錄組測序分析了5 種不同類型的肝細胞的近30 萬個單細胞，從而確定COVID-19 在肝臟中的入侵類型，報道COVID-19在進入肝臟組織后，TROP2+肝祖細胞的一系列癥狀與反應。Jia 等人[5]利用單細胞組測序技術檢測分離出糖尿病成年小鼠腎臟中腎小球細胞，并實時關注和記錄動態變化。同時測定多種類型的腎臟細胞，驗證腎小球細胞的特異性基因，也發現多個腎小球的內在標志基因。scRNA-seq 技術在腎臟中的大量研究，推動了人類疾病模型的建模和損傷系統修復研究的進程，對現今的研究有著重要的意義[6]。

3.2.3 神經系統方面

Lake 等人[7]針對人腦的特異性結構，對微流體單細胞核測序技術（snDrop-seq）及單細胞轉座體超敏性位點測序技術（scTHS-seq）進行技術革新，并對人大腦中的視覺皮層細胞群和額葉皮層細胞群進行細胞分析，鮮明地展示了組成人腦不同位置的細胞的共同點和差異，其中包括轉錄因子與多種轉錄元件，同時將人腦不同的細胞群與相關疾病相互映射，為人腦的相關疾病提供依據。

3.2.4 動物育種方面

種公畜在種群的遺傳性狀與種群優勢中發揮著較大的作用。因此，需要對種公畜的生殖能力與精子以及生殖器官的質量進行特別關注。在公畜的生殖組織上進行單細胞測序，以對其發育過程和生殖細胞發生的機制進行探究，這對選取高價值、高產能的畜種具有較為關鍵的作用。高源等[8]利用scRNA-seq技術對性功能發育完成前、后的牛睪丸細胞群進行測序，并通過差異分析，把牛睪丸分為12 個差異類群，其中有9 類體細胞與3 類生殖細胞，同時篩查出牛睪丸的特異性基因，如Ccl21、Esx1 和Gas1 等。

4 展望

單細胞多組學測序是目前展示生物體發育的關鍵技術，從多維度、多層面直接反映細胞的基本特性。相比傳統的組織學、腫瘤等領域，目前單細胞測序技術在畜牧科學、物種培育與轉基因物種的篩查中的應用相對較少，這也是未來發展不可忽視的一個部分。

對于細胞的生命歷程及異質性細胞在生物發展的不同階段所承擔的功能的研究正處于快速發展時期。隨著技術的創新和進步，計算機與更多學科相融。要想決定哪種測序技術最有利于實現研究目標，應更多地分析不同測序技術與測序平臺的優缺點。獲得單細胞信息的方法沒有“一刀切”的標準，每種技術都有優點和局限性。目前，用于冷凍或固定標本的樣品處理方法，或用于單細胞轉錄組的原位或體內分析的技術模式亟待開發。