用于乳腺腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)的纖維-水凝膠復(fù)合支架的制備及表征

傅思佳，劉星星，胡夢(mèng)博，李超婧，1b，王富軍，1b，王 璐，1b

(1.東華大學(xué) a.紡織學(xué)院,b.紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科, 上海)

乳腺癌是女性最常見的癌癥,僅2020年就有230萬新病例,已成為全球主要新發(fā)癌癥類型[1]。正常乳腺組織非常柔軟,而乳腺腫瘤組織的機(jī)械剛度通常高于周圍正常組織,較高的組織硬度會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、表型和對(duì)藥物的敏感性[2-3]。乳腺腫瘤學(xué)研究通常在傳統(tǒng)的二維(2D)結(jié)構(gòu)中進(jìn)行培養(yǎng),但這忽略了細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)與細(xì)胞相互作用的復(fù)雜性,導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為的改變并高估藥物療效[4-5]。與2D培養(yǎng)相比,在模擬ECM三維(3D)結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出與體內(nèi)更接近的生長(zhǎng)形態(tài)和化學(xué)敏感性特征,能夠更準(zhǔn)確地概括復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境和預(yù)測(cè)藥物治療效果[6]。

大部分人體正常組織或腫瘤組織的ECM均是由兩種不同形態(tài)的組分構(gòu)成的3D大分子網(wǎng)絡(luò)。其一是由膠原蛋白、彈性蛋白等糖蛋白組成的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng),起到構(gòu)建細(xì)胞微環(huán)境中機(jī)械特質(zhì)的作用;其二是由糖胺聚糖組成的凝膠狀基質(zhì),能夠指導(dǎo)細(xì)胞遷移、基質(zhì)沉積和降解[7-8]。因此,ECM可被視為一種纖維-水凝膠復(fù)合結(jié)構(gòu)[9]。為了仿生天然ECM結(jié)構(gòu),將靜電紡絲纖維與水凝膠結(jié)合以提高與天然ECM結(jié)構(gòu)的相似性、力學(xué)性能和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)能力[10]。其中,水凝膠是高度親水的3D聚合物網(wǎng)絡(luò),具有與天然ECM相似的物理和生化特性,可為細(xì)胞擴(kuò)散和物質(zhì)交換提供支持[11]。海藻酸鈉(sodium alginate,SA)是一種從褐藻中提取的天然陰離子多糖,可作為ECM中糖胺聚糖的替代物,已用作封裝和固定多種類型細(xì)胞[12]。然而,SA力學(xué)性能較差且缺乏細(xì)胞黏附位點(diǎn),阻礙了其作為細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)支架的應(yīng)用[13]。將具有優(yōu)異生物相容性和可降解性的聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)纖維納入水凝膠基質(zhì),兩者表面在互鎖效應(yīng)下發(fā)生機(jī)械結(jié)合,纖維通過調(diào)整應(yīng)力分布可以改善水凝膠的力學(xué)性能[14]。此外,纖維還可以引導(dǎo)細(xì)胞聚集并影響細(xì)胞行為[15]。

本研究制備了一個(gè)結(jié)構(gòu)均勻的靜電紡絲-水凝膠3D細(xì)胞培養(yǎng)支架。在靜電紡絲過程中加入SA粉末,支架在水溶液中潤(rùn)濕的過程中,SA粉末迅速向各方向發(fā)生溶脹,使PLGA纖維層間膨脹并改善致密的纖維排列。SA與PLGA纖維形成互穿網(wǎng)絡(luò),經(jīng)凍干后留下高度多孔的纖維-水凝膠復(fù)合支架三維結(jié)構(gòu)如圖1所示。為改善支架對(duì)腫瘤細(xì)胞的引導(dǎo)效果,在纖維-水凝膠復(fù)合支架中負(fù)載富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)以提高支架的生物活性。PRP是從全血中提取的富含高濃度血小板的血液衍生產(chǎn)品,是生長(zhǎng)因子(growth factor,GFs)、細(xì)胞因子和纖維蛋白原的天然來源,因此已被用于組織工程和3D細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的開發(fā)[16]。乳腺腫瘤周圍存在高濃度的纖維蛋白,在Ca2+/凝血酶作用下,PRP中的纖維蛋白原重新聚合形成具有微納米尺度和黏彈性的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)[17]。本研究將支架用作體外腫瘤模型來培養(yǎng)和評(píng)估乳腺腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,并比較2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)所導(dǎo)致的藥物敏感性差異。

圖1 纖維-水凝膠復(fù)合支架的制備方法Fig.1 Fabrication of the fiber-hydrogel composite scaffold

1 材料和方法

1.1 材料

PLGA(mPLA/mPGA=50：50,Mw=105 000 g·mol-1)購自濟(jì)南岱罡生物工程有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)、三氯甲烷(chloroform,CF)、海藻酸鈉、無水氯化鈣(CaCl2)均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;凝血酶購自羅恩試劑;兔富血小板血漿(PRP)均購自廣州鴻泉生物科技有限公司;人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、最低必須培養(yǎng)基(minimum essential medium,MEM)、胰酶、雙抗均購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;4′,6-二脒基-2苯基吲哚(4,6-diqmino-2-phenyl indde, DAPI)溶液、異硫氰酸熒光素酯(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記鬼筆環(huán)肽均購自北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒購自翌圣生物科技上海有限公司;阿霉素(DOX)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 支架制備

為了比較支架的結(jié)構(gòu)及組分對(duì)3D腫瘤模型性能影響,本研究構(gòu)建了3種3D腫瘤支架,分別為純SA水凝膠支架,SA與PRP雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(sodium alginate-PRP,SAP)支架,以及負(fù)載富血小板血漿的纖維-水凝膠(sodium alginate-PRP-PLGA,SPP)復(fù)合支架。具體制備方法如下：

SA水凝膠支架的制備是以去離子水配置10 mg/mL的SA溶液,20 mmol的 CaCl2作為交聯(lián)劑并進(jìn)行冷凍干燥得到的。

SAP水凝膠支架是通過將10 mg/mL的SA溶解在稀釋2倍后的PRP中,以0.5 U/mL凝血酶和20 mmol的CaCl2作為交聯(lián)劑并進(jìn)行冷凍干燥得到的。

制備SPP支架需在進(jìn)行PLGA靜電紡絲的同時(shí)添加SA粉末,隨后以20 mmol的CaCl2進(jìn)行交聯(lián)并冷凍干燥成型以形成PLGA-SA互穿結(jié)構(gòu)。再將其充分浸潤(rùn)在PRP中,通過0.5 U/mL凝血酶和10 mmol的CaCl2誘導(dǎo)形成纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)并激活血小板,冷凍干燥后得到SPP支架。

1.3 支架表征

1.3.1 支架的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

支架的化學(xué)結(jié)構(gòu)和元素組成通過傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet6700,Thermo Fisher Scientific,美國(guó))、X射線光電子能譜儀(Escalab 250Xi,Thermo Fisher Scientific,美國(guó))、能量分散譜儀(EDS)確定。用傅里葉變換紅外光譜測(cè)試支架的化學(xué)鍵,記錄波數(shù)為4 000～400 cm-1。使用X射線光電子能譜儀(Escalab 250Xi,Thermo Fisher Scientific,美國(guó))分別分析測(cè)試3種支架的所含元素。EDS能譜分析通過使用配備有EDS檢測(cè)器的FESEM在10 kV加速電壓下進(jìn)行,以獲得大面積和隨機(jī)選擇的樣品區(qū)域內(nèi)元素組成的平均分布圖。

1.3.2 形貌分析

使用場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡(SU8010,Hitachi,日本)觀察各支架表面和截面的微觀形貌。使用多孔材料孔徑分析儀(CFP-1100AI,Porous Materials,美國(guó))測(cè)定3D支架的孔徑尺寸。每種支架選取50個(gè)孔以計(jì)算平均孔徑。

孔隙率的測(cè)量是通過將支架浸入無水乙醇中,使乙醇充分滲透到支架中,支架在溫度為25 ℃條件下保持隔夜[18]。支架的孔隙率通過式(1)計(jì)算而得。

P=(m1-m0)/(ρV0)×100%

(1)

式中：P為支架孔隙率,%;m0為干燥支架的質(zhì)量;m1為乙醇滲透后支架的質(zhì)量;ρ為25 ℃下乙醇的密度;V0為干燥支架的體積。

1.3.3 溶脹性能

將凍干支架在PBS中于37 ℃溫育。以固定的時(shí)長(zhǎng)間隔取出溶脹的支架并用濾紙吸收表面上的過量水后稱重m2[19]。根據(jù)式(2)計(jì)算溶脹率(%)：

R=(m2-m0)/m0×100%

(2)

式中：R為支架溶脹率,%。

1.3.4 水接觸角

使用接觸角測(cè)試儀(OCA15EC,Dataphysics,德國(guó))對(duì)3種支架進(jìn)行靜態(tài)水接觸角測(cè)試。采用微量注射器滴加4 μL超純水至支架試樣表面,拍攝表面形成的液滴,并用水接觸角測(cè)試軟件處理捕獲的成像液滴。每種試樣隨機(jī)選取4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量并取平均值。

1.3.5 力學(xué)特性

將3種支架在PBS中徹底再水合作用后,使用人體內(nèi)生物管道壓縮彈性測(cè)試儀測(cè)量支架的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變行為。使用直徑為20 mm的圓柱形壓頭,以5 mm/min 的速率壓縮樣品,直到其應(yīng)變達(dá)50%。每種類型的支架至少測(cè)試3個(gè)樣本,數(shù)據(jù)記錄為平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)。彈性模量由壓縮試驗(yàn)得到的應(yīng)力-應(yīng)變曲線的初始斜率計(jì)算[20]。

1.4 乳腺腫瘤細(xì)胞增殖

采用人源乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7評(píng)估在2D培養(yǎng)板,SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養(yǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。MCF-7在補(bǔ)充有FBS(體積分?jǐn)?shù)為10%)和青霉素-鏈霉素(體積分?jǐn)?shù)為1%)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在具有CO2(體積分?jǐn)?shù)為5% )的加濕培養(yǎng)箱中于溫度為37 ℃條件下生長(zhǎng)。

使用CCK-8試劑盒量化細(xì)胞的增殖能力。將3種支架均在酒精缸中滅菌24 h后,在超凈臺(tái)中通風(fēng)12 h并進(jìn)行紫外線照射滅菌。分別在傳統(tǒng)2D培養(yǎng)板、 SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架上以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種。每2 d更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d后,向每孔中加入1 mL工作液(培養(yǎng)基與CCK-8體積比為9∶1),孵育2 h后,將溶液轉(zhuǎn)移到96孔板中以測(cè)量450 nm處的光密度(OD)值(每組n=8)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

通過DAPI/FITC鬼筆環(huán)肽染色評(píng)估細(xì)胞在支架中的分布和形態(tài)。培養(yǎng)7 d后,用PBS洗滌各支架,用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,并采用體積分?jǐn)?shù)為0.1% 的TritonX-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化。細(xì)胞骨架用FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色60 min,細(xì)胞核用DAPI避光孵育10 min。使用激光共聚焦顯微鏡(CLSM,ZEISS,德國(guó))觀察細(xì)胞形態(tài)和分布。

1.6 化療藥物敏感性的體外評(píng)估

為評(píng)估在2D培養(yǎng)板、SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架中培養(yǎng)的細(xì)胞的耐藥性差異,將2×104個(gè)MCF-7細(xì)胞分別接種在2D培養(yǎng)板、SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架上,培養(yǎng)5 d后去除培養(yǎng)基,加入含質(zhì)量濃度為100 μg/mL的DOX的新鮮培養(yǎng)基,處理細(xì)胞48 h。

用上述CCK-8測(cè)定法測(cè)定藥物治療后的細(xì)胞活力,根據(jù)式(3)計(jì)算細(xì)胞活力(%)：

(3)

式中：MCF-7(處理)為藥物治療組;MCF-7(未處理)為不加藥物組。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行,至少重復(fù)3次,并計(jì)算平均值以確保重現(xiàn)性。使用單因素方差分析(ANOVA) 檢驗(yàn),然后使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行事后成對(duì)比較,顯著性差異水平p<0.05表示數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 支架的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖2 支架的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征Fig.2 Chemical structure of the scaffolds

XPS元素分析證明SAP水凝膠支架和SPP支架中N元素的存在,如圖2(b),且N元素在SPP支架中分布均勻,如圖2(c)所示。在PLGA靜電紡絲纖維、SA水凝膠支架中未檢測(cè)到N元素,證實(shí)PRP在SPP支架中成功負(fù)載,如圖2(d)所示。

2.2 支架的形貌分析

腫瘤支架的孔徑和孔隙率影響細(xì)胞的滲透以及氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的轉(zhuǎn)運(yùn),并與支架的溶脹性能和力學(xué)性能有關(guān)。為探索各支架的微觀結(jié)構(gòu),使用掃面電鏡進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)分析支架的形貌和孔徑表征,如圖3所示。由圖3可知,SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架均呈現(xiàn)出互連的大孔結(jié)構(gòu)。其中SA水凝膠支架具有最大的平均孔徑(169.77±11.30)μm,但孔徑大小分布不均(圖3(a)～(c)藍(lán)色虛線為SA孔隙)[9]。增加的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和柔性的纖維蛋白聚合物鏈?zhǔn)筍AP水凝膠支架具有孔徑較小但更均勻的孔隙,孔徑為(41.70±16.46)μm。已有研究[23-24]指出,孔徑過大將不利于細(xì)胞黏附且損害支架的力學(xué)性能。此外,在SAP水凝膠支架和SPP支架的表面和內(nèi)部都能觀察到互連的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)(見圖3(b)、(c)黃色箭頭指示),這些蛋白網(wǎng)絡(luò)連接在SA形成的大孔和PLGA纖維間,豐富的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)能夠?yàn)榧?xì)胞提供黏附表面,促進(jìn)細(xì)胞增殖。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),SPP支架中微納米級(jí)的PLGA纖維存在于SA孔隙中,支架中存在的多孔(平均孔徑為(25.83±7.38)μm)和纖維使細(xì)胞黏附在孔壁上,并通過相鄰層間懸垂的纖維(見圖3(e))進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用[15]。測(cè)試的3種支架的孔隙率均高于80%,能為細(xì)胞的浸潤(rùn)、增殖提供充分的空間和渠道(見圖3(f))。

圖3 支架的形貌和孔徑表征Fig.3 Morphology and pore size of the scaffolds

2.3 溶脹性能和水接觸角

支架表面潤(rùn)濕性對(duì)細(xì)胞的附著、增殖、遷移和活力具有重要意義。支架的水接觸角和溶脹性能如圖4所示,通過水接觸角測(cè)試表征加入PLGA纖維后對(duì)支架表面潤(rùn)濕性的影響。由圖4(a)可知,SA水凝膠支架顯示出高親水性,水滴在接觸表面0.14 s后立即被吸收到水凝膠中。相比之下,SAP水凝膠支架的水滴吸收速度略慢(為0.72 s)。這是因?yàn)槔w維蛋白原在轉(zhuǎn)變成纖維蛋白時(shí)疏水性略有增加,導(dǎo)致SAP水凝膠支架的親水性略有下降,但當(dāng)纖維蛋白為凝膠狀時(shí),其是完全親水的[25]。PLGA靜電紡絲纖維的接觸角為126.83°±2.70°,表明PLGA纖維是疏水的,與文獻(xiàn)[21]研究結(jié)果一致。將PLGA纖維加入支架體系,水滴仍能在0.65 s內(nèi)迅速滲透到SPP支架內(nèi),說明引入水凝膠后,支架由疏水轉(zhuǎn)為親水,具有較好的表面潤(rùn)濕性。細(xì)胞膜具有親水的寡糖鏈,SPP支架的表面親水性將有助于細(xì)胞在支架上黏附,適用于細(xì)胞培養(yǎng)[26-27]。

圖4 不同支架的水接觸角和溶脹性能Fig.4 Swelling properties and water contact angles of the scaffolds

吸收液體后的溶脹能力是用于3D支架細(xì)胞培養(yǎng)的支架的另一個(gè)重要特性,主要取決于其微觀結(jié)構(gòu)和親水性。溶脹性能有效地反映水凝膠對(duì)養(yǎng)分和代謝物的滲透和運(yùn)輸能力,并影響水凝膠的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。本研究測(cè)量了支架在PBS中水合24 h后的溶脹率,如圖4(b)所示。由圖4(b)可知,3種支架均表現(xiàn)出優(yōu)異的溶脹性能,其中,SA水凝膠支架的溶脹率最高為(3 468±14)%,但試驗(yàn)中觀察到,SA水凝膠支架在溶脹過程中逐漸失去穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。由于交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的增加,SAP水凝膠支架溶脹率低于SA水凝膠支架,為(2 733±43)%。SPP支架溶脹率為(2 234±81)%略有降低但與SAP水凝膠支架無顯著性差異,由此可知纖維的存在不會(huì)影響水凝膠的溶脹。纖維組分均勻分布在水凝膠中,其在溶脹過程中始終保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu),如圖4(c)所示。這是因?yàn)槔w維的存在會(huì)限制水凝膠的過度溶脹,這將有助于支架維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以適用于細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)。

2.4 支架的力學(xué)性能

3D支架的力學(xué)性能應(yīng)能支持腫瘤細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的生長(zhǎng)和增殖。支架壓縮應(yīng)變達(dá)50%時(shí)(L0為支架高度,圖5(a)),應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖5(b)所示。應(yīng)變?yōu)?～10%時(shí),添加纖維對(duì)支架的彈性模量無顯著性影響(見圖5(c))。這是因?yàn)槔w維-水凝膠復(fù)合支架在壓縮過程中承載壓縮載荷時(shí)有兩個(gè)階段的變形。在壓縮過程中,水凝膠基質(zhì)在載荷的方向上被壓縮,導(dǎo)致垂直于作用力方向的膨脹。第一階段,纖維先被拉直,這需要較小的變形力[28]。第二階段,當(dāng)應(yīng)變?cè)黾拥?0%～15%時(shí),SPP支架的彈性模量為(4.79±0.45)kPa,顯著高于SAP水凝膠支架(見圖5(d))。這時(shí)需要更大的力使拉直的纖維持續(xù)變形,且隨著壓縮過程中纖維密度的增加,纖維和水凝膠互連引起負(fù)載轉(zhuǎn)移,從而顯著增加變形力[29]。此外,SPP支架與乳腺腫瘤組織的模量((4～23)kPa)相當(dāng),可以為乳腺癌細(xì)胞提供生理相關(guān)的微環(huán)境[14]。

圖5 支架的力學(xué)性能Fig.5 Mechanical properties of scaffolds

2.5 細(xì)胞增殖和形態(tài)表征

MCF-7細(xì)胞在2D培養(yǎng)板、SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養(yǎng)下的增殖結(jié)果,如圖6所示。由圖6可知,培養(yǎng)時(shí)間為7 d以內(nèi),2D培養(yǎng)和3D支架組的吸光度值均增加,表明MCF-7在SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架上均能增殖,證實(shí)支架適合細(xì)胞生長(zhǎng)。與2D培養(yǎng)下的快速增殖相比,在3D支架上培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增值速度較慢,與自然腫瘤的生長(zhǎng)速度更接近,這一結(jié)果與已有研究[30]一致。SAP水凝膠支架與SA水凝膠支架的比較表明,加入PRP能提高M(jìn)CF-7增殖,且這種促進(jìn)作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸顯著。在細(xì)胞培養(yǎng)第三天時(shí),SAP水凝膠支架比SA水凝膠支架的細(xì)胞增殖率高3.6%;在第七天時(shí),SAP水凝膠支架比SA水凝膠支架的細(xì)胞增殖率高4.4%。這是因?yàn)镻RP中的纖維蛋白能與細(xì)胞非特異性結(jié)合且不溶于水,為細(xì)胞提供更穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。纖維蛋白通常存在于晚期腫瘤的ECM中,且與惡性腫瘤有關(guān),其為腫瘤生長(zhǎng)提供初始結(jié)構(gòu)支持,以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌形成細(xì)胞外基質(zhì)[31]。

圖6 MCF-7細(xì)胞在2D和3D培養(yǎng)下的增殖結(jié)果Fig.6 MCF-7 proliferation in 2D monolayer culture and 3D scaffolds

培養(yǎng)7 d后,添加PLGA纖維的SPP支架細(xì)胞增殖能力比SAP水凝膠支架高33.1%(p<0.01),這可能是因?yàn)镾PP支架的彈性模量((4.79±0.45)kPa)與乳腺腫瘤組織的ECM剛度更相近且具備纖維和水凝膠這兩種ECM必要結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻(xiàn)[2]研究表明,增加的基質(zhì)剛度可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞-ECM相互作用并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Jabbari等[32]的研究表明,在模量為5 kPa的水凝膠中培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞生成的最好。此外,靜電紡絲形成的PLGA纖維能夠高度模仿天然ECM的纖維網(wǎng)絡(luò),靜電紡絲纖維基質(zhì)已被證明可提供形態(tài)學(xué)線索,從而改善細(xì)胞黏附和增殖[33]。上述研究結(jié)果證明SPP支架從化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)兩方面促進(jìn)了乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

進(jìn)一步觀察MCF-7細(xì)胞在2D培養(yǎng)板和3D支架中的形態(tài)差異,使用DAPI和鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞核與肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色,共聚焦觀察細(xì)胞在2D和3D培養(yǎng)下的形態(tài)如圖7所示。2D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在第七天時(shí)形成密集的單層,細(xì)胞呈現(xiàn)出三角形或多邊形擴(kuò)散形態(tài)(見圖7(a))。在3D培養(yǎng)中,細(xì)胞則表現(xiàn)為圓形梭狀的聚集形態(tài)。在SA水凝膠支架中細(xì)胞聚集但并未形成多細(xì)胞腫瘤球(見圖7(b))。這是由于SA水凝膠支架的孔過大,細(xì)胞更傾向于沿著孔壁生長(zhǎng)而無法聚集成球體[34]。SAP水凝膠支架和SPP支架都促進(jìn)細(xì)胞聚集并形成腫瘤多細(xì)胞球。不同的是,細(xì)胞在SAP水凝膠支架中更傾向于形成獨(dú)立的多細(xì)胞腫瘤球且存在更多單個(gè)分布的細(xì)胞(見圖7(c)),而在SPP支架中觀察到形成了兩個(gè)連接的多細(xì)胞腫瘤球(見圖7(d)),細(xì)胞分布更緊密,這是由于纖維的存在限制了細(xì)胞的下沉。此外,2個(gè)多細(xì)胞腫瘤球體間肌動(dòng)蛋白的分布表明細(xì)胞可能通過纖維交換生化信號(hào)以促進(jìn)細(xì)胞交流[35]。

圖7 細(xì)胞在2D和3D培養(yǎng)下的形態(tài)Fig.7 Morphological of cells in 2D monolayer culture and 3D scaffolds

2.6 化療藥物敏感性的體外評(píng)估

研究2D培養(yǎng)板以及SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養(yǎng)下對(duì)抗腫瘤藥物的化學(xué)敏感性。培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞5 d后,使用100 μg/mL DOX藥物處理細(xì)胞48 h,經(jīng)處理后的細(xì)胞活力如圖8所示。由圖8可知,SA水凝膠支架、SAP水凝膠支架和SPP支架培養(yǎng)下的細(xì)胞均具有更低的化學(xué)敏感性,細(xì)胞活力均顯著高于2D培養(yǎng)。其中2D培養(yǎng)板細(xì)胞活力為15.91%,SA水凝膠支架細(xì)胞活力為77.27%,SAP水凝膠支架細(xì)胞活力為79.91%,SPP支架細(xì)胞活力為88.51%。與SA水凝膠支架和SAP水凝膠支架相比,SPP支架上培養(yǎng)的細(xì)胞受到的抑制作用最小,表明SPP支架上培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞具有更高的耐藥性。這一結(jié)果與較高的基質(zhì)剛度會(huì)提高腫瘤細(xì)胞耐藥性的研究[36]一致。這是因?yàn)樵黾拥幕|(zhì)剛度會(huì)通過改變腫瘤細(xì)胞的蛋白和基因表達(dá)(例如,提高ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞存活促進(jìn)因子Bcl-2表達(dá))來提高腫瘤細(xì)胞的耐藥性。另外,纖維促使細(xì)胞聚集得更緊密,這種較高的細(xì)胞堆積密度會(huì)導(dǎo)致藥物更難擴(kuò)散和滲透到中央細(xì)胞團(tuán)中。綜上所述,SPP支架通過模擬乳腺腫瘤基質(zhì)的剛度和物理結(jié)構(gòu)來提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性,表明其具有藥物篩選的應(yīng)用潛力。

圖8 DOX藥物處理48 h后的細(xì)胞活力Fig.8 Cell viability after 48 h of DOX drug treatment

3 結(jié) 語

本研究成功構(gòu)建了負(fù)載富血小板血漿的纖維-水凝膠復(fù)合支架,模擬天然乳腺腫瘤ECM微環(huán)境。纖維的加入一方面使水凝膠支架的彈性模量提高了2.18倍,制備的SPP支架具有與乳腺癌腫瘤組織相似的彈性模量;另一方面,加入纖維還提高了支架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,使其更適用于細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)。負(fù)載PRP為細(xì)胞黏附和增殖提供了額外的蛋白網(wǎng)絡(luò)和生長(zhǎng)因子,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。相比于無纖維增強(qiáng)水凝膠支架,SPP支架上的細(xì)胞增殖率提高了33.1%。支架內(nèi)部乳腺腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)促進(jìn)多細(xì)胞球體。在SPP支架上培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有更低的化學(xué)敏感性。研究表明該支架是一種合適的臨床前模型,可作為腫瘤生物學(xué)研究和藥物篩選的體外平臺(tái)。