mRNA 治療用納米載體研究新進(jìn)展

石立旺，張楠，祝綸宇，王穎，郭敏，杜超

基因藥物治療是以 mRNA 作為橋梁，將 DNA 的遺傳密碼傳輸?shù)胶颂求w中進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，恢復(fù)人體內(nèi)缺失的蛋白質(zhì)或創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)來(lái)達(dá)到治療疾病的目的。理論上，mRNA 擁有能夠合成“任意一種蛋白質(zhì)”的潛力，將mRNA 制成疫苗或者藥物，相當(dāng)于送出一張可以在人體內(nèi)生成藥物工廠的“施工圖紙”，根據(jù)這張“圖紙”，mRNA 可以在細(xì)胞內(nèi)翻譯表達(dá)而無(wú)需進(jìn)入細(xì)胞核，因此相比于 DNA藥物或傳統(tǒng)的功能性生物分子，mRNA 療法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，mRNA 不會(huì)整合到宿主的基因組中，避免基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。其次，mRNA 免疫源性低，不易觸發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，半衰期短、代謝產(chǎn)物純天然，沒(méi)有持續(xù)累積毒性的風(fēng)險(xiǎn)。再次，負(fù)載 mRNA 的疫苗可以誘導(dǎo) T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞，還能夠激活 toll 樣受體和視黃酸誘導(dǎo)基因 I，在體內(nèi)產(chǎn)生免疫腫瘤的微環(huán)境[1-2]。最后，mRNA很容易通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程合成，這個(gè)過(guò)程相對(duì)廉價(jià)，并且可以快速應(yīng)用于各種療法。因此，從制藥行業(yè)的角度來(lái)看，mRNA 是一種非常有潛力的候選藥物，可以滿足基因治療、癌癥治療以及開(kāi)發(fā)疫苗等需求。盡管 mRNA 在治療疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但由于其很容易被酶降解，不容易被靶細(xì)胞攝取，因此如何高效穩(wěn)定地將其進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)傳遞是臨床應(yīng)用中面臨的主要問(wèn)題。為了克服這一障礙，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出病毒載體和非病毒載體用于遞送 mRNA。病毒載體可能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)甚至死亡，臨床應(yīng)用十分有限。而非病毒載體，包括脂質(zhì)納米顆粒、病毒樣顆粒、聚合物納米顆粒、無(wú)機(jī)納米顆粒和外泌體，具有安全性高、靶向性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是臨床研究的熱點(diǎn)（圖 1）。本文介紹了 mRNA 藥物的發(fā)展歷程、治療過(guò)程、設(shè)計(jì)原則、遞送體系及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的研究熱點(diǎn)，討論了基于 mRNA 的治療方法存在的種種挑戰(zhàn)和應(yīng)用前景。

圖1 目前基因治療常用的非病毒載體（脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒和無(wú)機(jī)納米顆粒先進(jìn)入核內(nèi)體，然后進(jìn)入溶酶體和細(xì)胞。病毒樣顆粒先進(jìn)入核內(nèi)體，再進(jìn)入細(xì)胞。外泌體和仿生納米顆粒通過(guò)膜融合和各種內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞[3]）

1 mRNA 療法的發(fā)展歷程

從 1961 年首次發(fā)現(xiàn) mRNA 到 mRNA 藥物或疫苗首次在臨床應(yīng)用歷經(jīng)了半個(gè)世紀(jì)。1978 年，Dimitriadis 成功地用脂質(zhì)體將外源性 mRNA 轉(zhuǎn)染到小鼠淋巴細(xì)胞中[4]。同年，Ostro 等[5]將 mRNA 轉(zhuǎn)染到人細(xì)胞。1984 年，Krieg和 Melton[6]成功合成具有生物活性的 mRNA 并將其注射到青蛙卵中，證實(shí)了人造 mRNA 的功能與內(nèi)源性 mRNA相似。Malone 等[7]于 1989 年首次提出 mRNA 疫苗的概念。與此同時(shí)，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體為載體的 mRNA 遞送系統(tǒng)“l(fā)ipofectin”被商業(yè)化。1995 年，科研人員首次將 mRNA編碼的癌癥抗原注射到體內(nèi)，以進(jìn)行癌癥免疫治療研究，但是基于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，mRNA 的安全性、穩(wěn)定性以及藥物遞送等方面需進(jìn)一步驗(yàn)證，臨床試驗(yàn)并沒(méi)有取得太大的進(jìn)展[8]。到了 21 世紀(jì)，隨著醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)步，mRNA 的合成、修飾和遞送技術(shù)有了新的進(jìn)展，mRNA 療法得到研究人員和一些生物制藥公司的關(guān)注。2011 年，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)被開(kāi)發(fā)用于基因編輯[9]，為 mRNA工程提供了強(qiáng)有力的工具。此外，SARS-COV-2 的爆發(fā)加速了 mRNA 疫苗的開(kāi)發(fā)。2020 年 12 月 11 日，輝瑞公司的疫苗 BNT162b2 獲得了 FDA 的緊急授權(quán)，成為首個(gè)用于人類的 mRNA 藥物。

2 mRNA 療法的治療過(guò)程

mRNA 藥物在體內(nèi)發(fā)揮作用大體可分成六個(gè)步驟：第一步，注射的 mRNA 藥物被抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)吞；第二步，mRNA 進(jìn)入胞質(zhì)后，由核糖體翻譯成蛋白質(zhì)，翻譯的抗原蛋白通過(guò)多種途徑激活免疫系統(tǒng)；第三步，細(xì)胞內(nèi)抗原被蛋白酶體復(fù)合物分解成較小的片段，片段通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I 類分子遞送給細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞；第四步，活化的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞通過(guò)分泌穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞因子殺死感染細(xì)胞；此外，分泌的抗原可被細(xì)胞攝取，在核內(nèi)體降解，并通過(guò) MHC II 類分子遞送給輔助 T 細(xì)胞；最后，輔助 T 細(xì)胞刺激 B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并通過(guò)炎性細(xì)胞因子激活吞噬細(xì)胞，清除病原體（圖 2）。

圖2 mRNA 療法的治療過(guò)程[10]

3 mRNA 的設(shè)計(jì)原則

mRNA 疫苗或藥物是用合成的 mRNA 分子生產(chǎn)抗原，從而引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。mRNA 分子的序列設(shè)計(jì)主要模仿了內(nèi)源性 mRNA 的五個(gè)結(jié)構(gòu)部分，分別是：5' 帽子、5' 非翻譯區(qū)（5'UTR）、開(kāi)放閱讀框（ORF）、3' 非翻譯區(qū)（3'UTR）和多尾 A（圖 3）。如果是自我擴(kuò)增的 mRNA，還會(huì)含有 RNA 聚合酶的基因，這種 RNA 聚合酶在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增 mRNA，從而生產(chǎn)較多的抗原。

圖3 體外轉(zhuǎn)錄 mRNA 的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)：5' 帽子、5'UTR、ORF、3'UTR 和多尾 A[11]

科研人員根據(jù) 5' 末端第一個(gè)或第二個(gè)核苷酸的羥基上是否有甲基化的核糖，把 5' 帽子分為 O 型、I 型和 II型。5' 帽子不僅可以阻止細(xì)胞質(zhì)傳感器的識(shí)別，從而防止錯(cuò)誤的免疫反應(yīng)，而且能夠在空間上保護(hù) mRNA 不被核酸外切酶降解。另外，5' 帽子可以和多尾 A、多尾 A 結(jié)合蛋白以及翻譯起始因子協(xié)同工作，從而環(huán)化 mRNA 并募集核糖體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

5'UTR 的主要功能是幫助 mRNA 與核糖體結(jié)合。早期研究表明，鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶含量高的 5'UTR 可以抑制mRNA 翻譯。因此，在設(shè)計(jì) 5'UTR 時(shí)應(yīng)減少鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的數(shù)量。此外，由于 AUG 會(huì)破壞 ORF 的翻譯，在設(shè)計(jì) 5'UTR 時(shí)應(yīng)避免使用 AUG 作為起始密碼子[12]。

ORF 作為抗原-蛋白編碼區(qū)，其翻譯效率至關(guān)重要。富含鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的 ORF 具有更高的翻譯效率。有研究表明，在不改變編碼蛋白氨基酸序列的情況下，將宿主體內(nèi)罕見(jiàn)的密碼子改變?yōu)槌Ｒ?jiàn)的密碼子，可以提高蛋白的表達(dá)水平[13]。此外，科研人員有時(shí)會(huì)通過(guò) ORF 區(qū)的內(nèi)部修飾（N6-腺苷酸甲基化、胞嘧啶羥基化、尿苷酸甲基化或假尿苷）來(lái)加強(qiáng)翻譯。這是因?yàn)樗性?mRNA 都包含修飾核苷，所以免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別無(wú)修飾的單鏈 RNA，然后產(chǎn)生干擾素，阻止 mRNA 翻譯。使用修飾核苷可以防止被識(shí)別，從而保證翻譯足夠的蛋白質(zhì)。

3'UTR 和多尾 A 是 mRNA 必需的序列，長(zhǎng)度與翻譯效率成正比。3'UTR 具有調(diào)節(jié) mRNA 翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位的功能。多尾 A 的長(zhǎng)度大于 100 bp 是治療性mRNA 的最佳選擇；長(zhǎng)度在 100 ～ 150 bp 能夠與多尾 A 結(jié)合蛋白形成起始轉(zhuǎn)錄的復(fù)合體，保護(hù) 5' 帽子不被酶降解。

4 非病毒載體遞送系統(tǒng)

mRNA 必須進(jìn)入宿主細(xì)胞并表達(dá)才能發(fā)揮功能，帶負(fù)電荷的 mRNA 很難穿過(guò)細(xì)胞膜上的陰離子磷脂雙分子層，且容易被免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞吞噬和核糖核酸酶降解。因此，mRNA 遞送系統(tǒng)不僅要提高宿主細(xì)胞的攝取，還要保護(hù)mRNA 不被降解。目前，能夠達(dá)成這個(gè)目標(biāo)并且臨床效果較好的是非病毒載體。下面將介紹非病毒載體遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

4.1 脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)

脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）通常由四種成分組成：可電離脂質(zhì)、膽固醇、聚乙二醇化磷脂和輔助脂質(zhì)，它們共同包裹mRNA，保護(hù)其不被降解。可電離脂質(zhì)能夠促進(jìn) mRNA 的封裝和釋放。膽固醇嵌入磷脂分子之間，調(diào)節(jié)磷脂膜的流動(dòng)性，降低膜的滲透性，減少 mRNA 滲漏。此外，它可以保持脂質(zhì)膜的柔韌性，調(diào)節(jié)磷脂的相變，防止氧化，增強(qiáng) LNPs抵抗外部條件變化的能力。聚乙二醇化磷脂可以使 LNPs表面覆蓋親水性保護(hù)膜，防止其被免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞清除。輔助磷脂可以提高 LNPs 整體的相變溫度和穩(wěn)定性。飽和輔助脂質(zhì)（例如二硬酯酰磷脂酰膽堿）最適合遞送短鏈RNA（例如 siRNA），不飽和輔助脂質(zhì)（例如二油酰磷脂酰乙醇胺）最適合遞送 mRNA。

LNPs 作為 mRNA 的載體有非常廣泛的應(yīng)用。例如，根特大學(xué)的研究人員制備了在生理?xiàng)l件下可降解的 1,2,4-三唑啉-3,5-二酮綴合物并成功包裹 mRNA，用于提高多種細(xì)胞的 mRNA 轉(zhuǎn)染效率[14]。COVID-19 mRNA LNPs 疫苗在不同人群中顯出優(yōu)異的保護(hù)效果[15]。盡管 LNPs 作為遞送 mRNA 的平臺(tái)表現(xiàn)出優(yōu)異的預(yù)防和治療疾病效果，但LNPs 有潛在的毒理學(xué)作用，會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致炎癥。此外，已有報(bào)道 LNPs 能夠引起疼痛、紅腫和發(fā)燒等副作用[16]。因此，LNPs 給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性和免疫原性尚有待進(jìn)一步探索。

4.2 病毒樣顆粒遞送系統(tǒng)

病毒樣顆粒（VLP）是由一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白通過(guò)自組裝而形成的納米級(jí)顆粒，直徑 20 ～ 200 nm，形態(tài)上類似于天然病毒，但通常不包含親代病原體遺傳物質(zhì)。通過(guò)病毒工程技術(shù)將 mRNA 與 VLP 衣殼蛋白特異性識(shí)別，可以形成 VLP-mRNA，再利用 VLP 的粒徑優(yōu)勢(shì)和衣殼蛋白，使 mRNA 很容易地進(jìn)入相關(guān)免疫細(xì)胞中，瞬時(shí)感染細(xì)胞，有效降低脫靶效應(yīng)（圖 4）[17]。上海交通大學(xué)的研究人員使用攜帶 mRNA 的慢病毒顆粒直接靶向 I 型單純皰疹病毒（HSV-1）基因組，該顆粒有效地阻止了 HSV-1 復(fù)制和皰疹性基質(zhì)性角膜炎的發(fā)生[18]。霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所設(shè)計(jì)了一種人鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒樣蛋白，并將其制作成 VLP 用來(lái)遞送特定的 mRNA，極大地拓展了核酸治療的應(yīng)用范圍[19]。作為一種天然可生物降解納米材料，VLP 避免了由逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的基因組缺失。隨著基因技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，VLPs 作為安全有效的疫苗和基因編輯傳遞工具逐漸得到研究開(kāi)發(fā)。

圖4 病毒樣顆粒遞送系統(tǒng)（病毒樣顆粒從血管進(jìn)入體內(nèi)，在躲避巨噬細(xì)胞吞噬的同時(shí)觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)吞，然后釋放 mRNA 藥物[17]）

4.3 仿生納米顆粒遞送系統(tǒng)

仿生納米顆粒（CM-NPs）主要由功能性納米顆粒和具有生物活性的細(xì)胞膜涂層組成，其中功能性納米顆粒攜帶化療藥物、基因藥物等，發(fā)揮治療作用。細(xì)胞膜涂層包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌以及各類工程化細(xì)胞，發(fā)揮包封、遞送、保護(hù)、靶向和長(zhǎng)循環(huán)作用（圖 5）。鑒于腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌表面的特定蛋白質(zhì)能夠激活免疫系統(tǒng)和提高黏附性，CM-NPs 在 mRNA 藥物的功能傳遞上比傳統(tǒng)納米載體更加多樣化。例如，甲型流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白在體內(nèi) pH 值下將病毒包膜與周圍膜融合，輕松地將其遺傳物質(zhì)傳遞到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。受此啟發(fā)，加州大學(xué)圣地亞哥分校的研究人員使用細(xì)胞膜涂層制造能夠體內(nèi)逃逸的仿生納米顆粒，并使其表達(dá) HA。在體內(nèi)和體外評(píng)估中，這些納米顆粒能夠?qū)?mRNA 有效傳遞到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，并顯著提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平[21]。此外，利用細(xì)胞膜上的特異性識(shí)別蛋白可以實(shí)現(xiàn)靶向給藥，從而大大改善治療效果。同濟(jì)醫(yī)院的研究人員設(shè)計(jì)了一種腫瘤靶向肽（cRGD）修飾的癌細(xì)胞膜包被的碳酸鈣納米顆粒，用于遞送 IL-12 mRNA。cRGD 修飾的 CM 作為外殼可以賦予納米顆粒在腦腫瘤微環(huán)境中的靶向作用。載有 IL-12 mRNA 的碳酸鈣納米顆粒可以治療由壞死性凋亡誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)[22]。盡管 CM-NPs 在遞送 mRNA 方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但現(xiàn)有的制備技術(shù)仍然不完善。因此，在實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用前仍有許多工作需要開(kāi)展。

圖5 通過(guò)共擠壓法獲得多種仿生納米顆粒[20]

4.4 聚合物納米顆粒遞送系統(tǒng)

聚合物納米顆粒遞送體系由陽(yáng)離子聚合物、樹(shù)枝狀聚合物或多糖聚合物組成。陽(yáng)離子聚合物易于合成和改性，可以通過(guò)靜電吸引和疏水相互作用與 mRNA 締合，有助于形成更穩(wěn)定的多聚體[23]。經(jīng)化學(xué)改性的聚乙烯亞胺毒性低，傳遞效率高，是常用的陽(yáng)離子聚合物。

樹(shù)枝狀聚合物是一種柔性大分子，直徑在 2 ～ 20 nm，由中心分子和樹(shù)突狀的側(cè)鏈部分組成，側(cè)鏈中的官能團(tuán)可以被修飾以改善聚合物的溶解度、組織結(jié)合和藥代動(dòng)力學(xué)等性質(zhì)。德克薩斯州立大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了基于樹(shù)枝狀聚合物的納米遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以成功將多種 mRNA 運(yùn)送到腫瘤組織，并通過(guò)近紅外成像標(biāo)志腫瘤區(qū)域，同時(shí)發(fā)揮診斷、檢測(cè)和治療作用[24]。

多糖包括殼聚糖、海藻酸鹽、右旋糖苷和透明質(zhì)酸，主要來(lái)源于高等植物、動(dòng)物、微生物、地衣和海藻中，具有毒性低，生物相容性高的特性，經(jīng)化學(xué)改性后可作為載體材料。天津大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了一種殼聚糖納米機(jī)器，它具有程序化捕獲、無(wú)需冷凍條件長(zhǎng)期儲(chǔ)存以及在細(xì)胞中有效遞送mRNA 的功能[25]。勃蘭登堡再生治療中心的研究人員用膠原蛋白-透明質(zhì)酸水凝膠封裝血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的mRNA 來(lái)調(diào)節(jié) VEGF 和促血管生成素的分泌[26]。

這三種聚合物可以結(jié)合使用以獲得更高的遞送效率和安全性。此外，有些聚合物不屬于上述三種類型。例如，伊朗大不里士醫(yī)科大學(xué)的科研人員開(kāi)發(fā)了聚乳酸-羥基乙酸共聚物/聚乙烯亞胺納米顆粒遞送編碼綠色熒光蛋白的mRNA[27]。東京大學(xué)的科研人員設(shè)計(jì)了由 PEG 和 mRNA組成的遞送體系。該遞送系統(tǒng)顯示出強(qiáng)大的 RNA 酶抗性和優(yōu)秀的蛋白表達(dá)效率[28]。

4.5 無(wú)機(jī)納米顆粒遞送系統(tǒng)

無(wú)機(jī)納米顆粒具有良好的存儲(chǔ)穩(wěn)定性、優(yōu)異的生物相容性和易于制備等特點(diǎn)。目前，常用的無(wú)機(jī)納米顆粒包括量子點(diǎn)、二氧化硅納米顆粒、磁性氧化鐵納米顆粒和金納米顆粒。首爾大學(xué)的研究人員合成了 N 摻雜石墨烯量子點(diǎn)，用于轉(zhuǎn)染多種 mRNA 和質(zhì)粒脫氧核糖核酸[29]。中科院納米所的研究人員開(kāi)發(fā)了介孔二氧化硅納米顆粒，能夠在小鼠體內(nèi)傳遞熒光素酶 mRNA 的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)胞攝取[30]。氧化鐵納米顆粒是一種以鐵基氧化物為主要成分的納米級(jí)磁性材料，具有超順磁性，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。華盛頓大學(xué)的研究人員將 mRNA 和超順磁性氧化鐵納米顆粒復(fù)配在一起，開(kāi)發(fā)了一種用于預(yù)防新冠病毒（SARS-CoV-2）的mRNA 疫苗。該疫苗在 4 ～ 25 ℃ 能穩(wěn)定存在長(zhǎng)達(dá) 3 個(gè)月，臨床試驗(yàn)結(jié)果良好，有望成為 SARS-CoV-2 病毒疫苗[31]。盡管這些無(wú)機(jī)納米材料具有優(yōu)異的載體特性，但是其在體內(nèi)無(wú)法降解或清除，因此需要開(kāi)展詳細(xì)的毒理學(xué)研究，以評(píng)估體內(nèi)積累而導(dǎo)致的毒性問(wèn)題。

4.6 外泌體納米顆粒遞送系統(tǒng)

外泌體是由細(xì)胞產(chǎn)生的一種進(jìn)行細(xì)胞間通訊的胞外小泡，直徑為 30 ～ 150 nm，能夠攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂類和酶，并在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞（圖 6）。天然外泌體遞送 mRNA具有兩個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)。第一，由于外泌體體積小，可減少免疫系統(tǒng)的清除作用，從而將更多的藥物運(yùn)輸?shù)讲∽儾课?。北卡羅萊納州立大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了可吸入外泌體，將 mRNA遞送至嚙齒動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的肺部[32]。第二，外泌體可以輕易穿過(guò)血腦屏障，將藥物輸送到大腦。俄亥俄州立大學(xué)的研究人員制備了大量含有治療性 mRNA 的外泌體，用于腦膠質(zhì)瘤治療。將靶向肽修飾到外泌體膜蛋白 CD47的 N 端，可以增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取，減少對(duì)其他組織的副作用[33]。此外，外泌體的表面功能化可以實(shí)現(xiàn)靶向傳遞。例如，通過(guò)在外泌體表面蛋白 Lamp2b 的 N 端融合軟骨細(xì)胞親和肽構(gòu)建靶向軟骨細(xì)胞的外泌體，用于封裝CRISPR/Cas9 質(zhì)粒并遞送至嵌入關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細(xì)胞，減輕軟骨損傷[34]。由于外泌體表面的抗原能夠增強(qiáng)患者的細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此，外泌體可以作為腫瘤和新冠病毒疫苗的載體。在疫苗的研發(fā)中，外泌體疫苗能夠裝載和遞送更多的 mRNA，顯著誘導(dǎo)人體長(zhǎng)期免疫應(yīng)答并且沒(méi)有任何毒副作用[35]。

圖6 外泌體將基因藥物遞送至靶細(xì)胞，通過(guò)翻譯蛋白質(zhì)、RNA 干擾和基因組編程治療疾病[3]

5 研究熱點(diǎn)

mRNA 分子量大，帶負(fù)電荷，在到達(dá)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)位點(diǎn)前必須跨越多個(gè)組織和細(xì)胞屏障。因此，需要用載體將mRNA 保護(hù)起來(lái)，使其更易進(jìn)入目標(biāo)位點(diǎn)。目前常用的載體有 LNPs、VLP、CM-NPs、聚合物納米顆粒、無(wú)機(jī)納米顆粒和外泌體。這些載體在臨床應(yīng)用及科學(xué)研究中往往存在以下問(wèn)題：①LNPs、聚合物納米顆粒和無(wú)機(jī)納米顆粒在注射入體內(nèi)后主要積聚在肝臟中，不能精確地將足夠的mRNA 遞送到靶細(xì)胞；②生產(chǎn)外泌體的主要方法是細(xì)胞培養(yǎng)和生物反應(yīng)器，但其生產(chǎn)規(guī)模較小，經(jīng)濟(jì)成本較高，不適合臨床應(yīng)用。以下將探討目前所面臨的主要問(wèn)題及可能的解決方案。

5.1 靶向納米顆粒

靶向納米顆粒能夠?qū)?mRNA 選擇性地運(yùn)送到目標(biāo)位點(diǎn)，減少運(yùn)送過(guò)程中損耗，提升傳遞效率，加強(qiáng)免疫反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，因而廣泛受到研究人員的青睞。目前，制備靶向顆粒的主要方法有：優(yōu)化納米顆粒配方、添加選擇性器官靶向（SORT）分子、修飾能夠與細(xì)胞膜受體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。例如，在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中，季銨比伯胺表現(xiàn)出更強(qiáng)的質(zhì)子海綿效應(yīng)，長(zhǎng)鏈烷基的不飽和雙鍵使膜具有更高的流動(dòng)性，這有助于改善 mRNA 體內(nèi)逃逸，增加 mRNA 的翻譯?；谏鲜鲈?，麻省理工大學(xué)的研究人員用含有季銨和炔烴的二油酰磷脂酰膽堿與脂質(zhì)、膽固醇、DMG-PEG 共同制備了靶向肝臟的 LNPs[36]。德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的研究人員通過(guò)添加選擇性 SORT 分子，系統(tǒng)設(shè)計(jì)了選擇性靶向肺、脾臟和肝臟的無(wú)機(jī)納米顆粒，以選擇性編輯和治療多種細(xì)胞[37]。塔爾圖大學(xué)的研究人員將細(xì)胞穿透肽修飾到聚合物納米顆粒表面，從而將 mRNA 選擇性遞送到脾臟中[38]。

5.2 外泌體的工業(yè)化生產(chǎn)

外泌體具有較高的生物相容性、生物利用率和跨生物屏障能力，因此被認(rèn)定為極具作為 mRNA 藥物遞送載體的潛力。隨著未來(lái)對(duì)外泌體載體的研究更加全面透徹，其需求量也會(huì)逐漸增加。俄亥俄州立大學(xué)的科研人員報(bào)道了一種細(xì)胞納米穿孔方法，用于生產(chǎn)大量含有治療性 mRNA 和靶向肽的外泌體。他們用質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞，并施加局部和瞬時(shí)電刺激，促進(jìn)其釋放攜帶 mRNA 和靶向肽的外泌體。與其他外泌體生產(chǎn)策略相比，細(xì)胞納米穿孔法可產(chǎn)生高達(dá) 50 倍以上數(shù)量的外泌體[39]。此外，來(lái)自于紅細(xì)胞的外泌體不含有細(xì)胞核和線粒體，不會(huì)傳遞基因，但仍能夠參與大部分病理過(guò)程，而來(lái)自于植物的外泌體不會(huì)引起細(xì)胞毒性，能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群，刺激腸道組織更新。因此，紅細(xì)胞外泌體和植物外泌體特別適合作為低成本的商品化外泌體來(lái)滿足市場(chǎng)需求[40-41]。

6 結(jié)論與展望

雖然 mRNA 藥物或疫苗在預(yù)防和治療腫瘤、自身免疫疾病和呼吸系統(tǒng)疾病方面取得了重大進(jìn)展，但研究仍然處于早期階段，多重困難阻礙了 mRNA 療法的發(fā)展。例如，LNPs 易氧化、降解，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，LNP 遞送系統(tǒng)中的脂質(zhì)成分會(huì)導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生炎癥和過(guò)敏反應(yīng)[16]。病毒樣顆粒、仿生納米顆粒、聚合物納米顆粒和無(wú)機(jī)納米顆粒也由于各種原因，沒(méi)有被 FDA 批準(zhǔn)用于臨床。理想的遞送系統(tǒng)應(yīng)該具有高轉(zhuǎn)染效率、足夠的安全性、保護(hù) mRNA，避免快速降解和靶向遞送，這些功能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有實(shí)現(xiàn)。

mRNA 療法被列為 2022 年全球十大最具影響力的科學(xué)突破。引起了眾多科學(xué)家和投資者的高度關(guān)注，這表明mRNA 藥物具有十分廣闊的應(yīng)用前景。特別是各種新興的仿生納米載體體系開(kāi)發(fā)有望成為 mRNA 遞送的重要手段，將對(duì) mRNA 治療產(chǎn)生更深遠(yuǎn)的影響。外泌體作為天然細(xì)胞分泌的納米顆粒，具有生物相容性好、免疫原性低、不易被吞噬、介導(dǎo)免疫逃逸、存留時(shí)間長(zhǎng)、能穿透深層組織，裝載各類基因治療物質(zhì)等眾多優(yōu)點(diǎn)。相信未來(lái)，基于外泌體的mRNA 納米工程技術(shù)將實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的精準(zhǔn)治療，對(duì)藥物開(kāi)發(fā)模式產(chǎn)生顛覆性影響。