高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定吸附無細胞百（三組分）白破滅活脊髓灰質炎和b 型流感嗜血桿菌（結合）聯合疫苗的多糖含量

楊柏峰，呂溪琳，吳麗潔，趙明，李世慧

目的 采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定吸附無細胞百（三組分）白破滅活脊髓灰質炎和 b 型流感嗜血桿菌（結合）聯合疫苗（以下簡稱 DTacP-sIPV-Hib）中多糖含量，并對方法進行驗證。

方法 在 1 ml 樣品中加入 0.02 g 檸檬酸鈉，振蕩混勻后，置于 37 ℃ 保溫 24 h，4000 × g 離心 5 min 收集上清液，稀釋后加入 6 mol/L 鹽酸，100 ℃ 下加熱 2 h，冰浴 10 min后加入 0.8 ml 氫氧化鈉（1 mol/L）溶液用于終止酸水解。采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法根據檢測信號峰面積計算對應水解莢膜多糖（PRP）含量，通過 PRP 占多糖含量干重的 41.3% 計算出總的多糖含量。

結果 核糖醇參考品濃度在 0.1 ～ 1.5 μg/ml 范圍內標準曲線 r2 ＞ 0.99，檢測下限可達 10 ng/ml。核糖醇加標回收率均在 95% ～ 105%；對高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法檢測多糖的重復性和中間精密度進行驗證，相對標準偏差（RSD）均小于 5%，方法專屬性和耐用性良好。

結論 使用檸檬酸鈉作為解吸附劑，與高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法相結合可用于 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib多糖的含量檢測，為產品的質量控制和穩定性研究提供參考。

b 型流感嗜血桿菌（Hib）在五歲以下兒童中可引起嚴重的侵襲性感染，包括腦膜炎、肺炎、敗血癥和心包炎[1]。Hib 疫苗顯著降低了與 Hib 疾病相關的兒童發病率和死亡率[2]。隨著我國免疫規劃的不斷推進，兒童接種疫苗的種類和頻率不斷增加。為了簡化免疫程序，提高疫苗接種的及時性，降低擴大免疫計劃的實施成本，并為兒童提供更好的保護，開發和推廣能夠同時預防多種疾病的聯合疫苗已成為新疫苗開發的一種趨勢。聯合疫苗的使用在簡化免疫程序、提高及時接種率和接種者的依從性以及降低疫苗管理成本方面具有巨大優勢，這是兒童疫苗計劃的目標[3]。總之，聯合疫苗的開發和應用已成為政府、制造商和研發機構關注的問題和優先事項。

Hib 多糖蛋白結合物可以與不同的疫苗抗原結合，如白喉（D）、破傷風（T）、無細胞百日咳、乙型肝炎（Hep B）和脊髓灰質炎病毒（IPV）[4-5]，其與這些抗原中的任何一種以及佐劑、防腐劑和其他賦形劑的結合都可能會干擾對 Hib 疫苗關鍵質量屬性的分析，如總糖或游離（未結合）多糖含量[6-7]。鑒于這類疫苗的復雜性，開發適宜的方法來跟蹤這些成分在聯合疫苗復雜基質中的含量變得越來越重要。疫苗是供健康人類使用的產品，因此需要對其進行嚴格的表征和分析，以確保最終產品的質量和批間一致性。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）是一種常用的碳水化合物分析技術[8-9]，用于監測多糖和多糖蛋白結合疫苗的質量和批間一致性，包括 Hib[7]、肺炎鏈球菌[10]、腦膜炎奈瑟菌[11]、B 組鏈球菌[12]，沙門氏菌多糖[13]以及相應的結合疫苗。該方法具有靈敏度高、分離效果好、重現性好、不需要樣品衍生化等優點，已逐漸成為碳水化合物分析的首選方法之一[8]。

Hib 疫苗以 5-核糖醇-(1-1)-β-d-核糖-3-磷酸重復序列制成的莢膜多糖（聚核糖基核糖醇磷酸，PRP）作為主要抗原，在 DTacP-sIPV-Hib 疫苗中，PRP 含量是評價疫苗有效性的關鍵指標之一。但聯合疫苗存在多種成分，這使得方法的開發和驗證變得復雜[14-15]。1994 年，美國食品藥品監督管理局疫苗研究與評估中心首次發表了使用 HPAEC-PAD方法檢測 Hib 疫苗多糖含量（結合和未結合）[7]。該方法使用氫氧化鈉水解產生 Hib 亞基，將其在 CarboPac PA1 柱上用 25 mmol/L NaOH 和150 mmol/L 乙酸鈉的流動相分離，并將葡萄糖-1-磷酸作為內標。默克公司的研究人員對該方法進行了一些修改，將分析柱改為 CarboPac PA10，并添加超速離心[16]。上述實驗結果表明，HPAEC-PAD法能穩定地檢測 Hib 結合疫苗中多糖的含量。然而，DTacP-sIPV-Hib 尚未納入《中國藥典》，對于聯苗中 Hib 含量的檢測缺乏相應的指導方法。使用 Hib 單苗中用于測定 Hib 多糖含量的地衣酚法檢測聯合疫苗中的 Hib 多糖含量時，測定值與理論值有很大差異。因此，尋找一種在不受其他抗原干擾的情況下檢測聯合疫苗中各成分含量的合適方法已成為一個熱門話題。本研究將解吸附劑與離子色譜法結合用于 DTacP-sIPV-Hib 疫苗成品中Hib 多糖含量的檢測，并進行方法學驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗及參考品 DTacP-sIPV-Hib 樣品購自北京生物制品研究所有限責任公司，批號202111S04、202111S05、202111S06；Hib-TT 偶聯疫苗原液購自蘭州生物制品研究所有限責任公司，批號 B-20210801；核糖醇參考品購自美國 Sigma公司，批號：BCCC2962，純度 ≥ 99%。

1.1.2 試劑 50% 氫氧化鈉溶液（色譜純）購自美國 Fisher 化學公司；鹽酸溶液購自北京化工廠；檸檬酸三鈉（純度 ≥ 99%）購自美國 Alfa Aesar公司。通過 Milli-Q 系統（Millipore，USA）制備超純水。

1.1.3 色譜柱及儀器 色譜柱 DionexCarboPac MA-1（250 mm × 4 mm）、色譜柱 DionexCarboPac MA-1 保護柱（50 mm × 4 mm）和 ICS-5000 離子色譜儀均為美國戴安公司產品；變色龍 6.8 色譜工作站和 Sorvall ST4R Plus 離心機為美國 Thermo公司產品；15 ml 超濾離心管（10 kD）、精密分析天平（BS224S）和超純水儀（arium?pro）購自美國 Sartorius 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品和定量參考品制備

1.2.1.1 含鋁佐劑疫苗樣品預處理 吸取 1 ml DTacP-sIPV-Hib，加入 0.02 g 檸檬酸鈉，振蕩混勻后，置于 37 ℃ 保溫 24 h，以 4000 ×g離心 5 min收集上清液，稀釋適宜倍數至標準曲線范圍，作為待檢樣品。

1.2.1.2 核糖醇參考品制備 先配制 300 μg/ml的核糖醇參考品儲備液，然后用超純水稀釋核糖醇儲備液，得到核糖醇參考品工作液。標準曲線包含六個點，范圍為 0.1 ～ 1.5 μg/ml。

1.2.1.3 鹽酸水解 將所有稀釋好的待檢樣品、濃度范圍在 0.1 ～ 1.5 μg/ml 的核糖醇參考品工作液和空白對照（超純水）轉移至 2 ml 玻璃試管中，加入 0.1 ml 鹽酸（6 mol/L），100 ℃ 下加熱 2 h，冰浴 10 min，加入 0.8 ml 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）終止水解。所有樣品均通過 0.22 μm 膜過濾收集，用于 HPAEC-PAD 分析。

1.2.1.4 離子色譜檢測 流動相：580 mmol/L 氫氧化鈉溶液；流速：0.3 ml/min；安培檢測器，檢測器溫度 30 ℃；柱溫：30 ℃；進樣體積：25 μl，進樣 2 次；洗脫方式：等度洗脫，使用具有金工作電極和 Ag/AgCl 參比電極的脈沖安培模式監測流出物。用流動相平衡色譜系統，待基線穩定后，將參考品及待檢樣品分別注入色譜柱。使用Chromeleon 6.8 軟件（Dionex）對所得色譜數據進行整合和處理。

1.2.2 方法驗證

1.2.2.1 專屬性 確認 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib多糖含量檢定方法在規定條件下，所測目標物為Hib 而非其他物質，證明該方法對 Hib 的檢測具有專屬性。取“1.2.1.3”溶液，按“1.2.1.4”所述條件上機檢測，記錄色譜峰保留時間。

1.2.2.2 線性與范圍 每個核糖醇參考品濃度（0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 和 1.5 μg/ml）按“1.2.1.4”所述條件重復測定 6 次，以峰面積（x）為橫坐標，核糖醇參考品濃度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，統計相關系數、各濃度平均值、標準偏差（standard deviation，SD）及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.2.3 檢測限（LOD） 將 0.1 μg/ml 核糖醇參考品稀釋至約 5 ng/ml，按“1.2.1.4”色譜條件檢測多糖含量，以信噪比（S/N）3:1 為檢測限。

1.2.2.4 準確度 取按“1.2.1.1”處理后的樣品溶液（批號：202111S04），稀釋至 0.1929 μg/ml，取 1 ml 分別加入 1 ml 的高（1.2 μg/ml）、中（0.6 μg/ml）、低（0.2 μg/ml）三個濃度的核糖醇參考品，按“1.2.1.3”進行供試品水解，按“1.2.1.4”色譜條件進行檢測，計算供試品多糖含量的平均加標回收率（%）、均值及 RSD。

回收率（%）=（加標樣品檢測值 - 供試品加入值）/核糖醇理論加值 × 100%

1.2.2.5 精密度

⑴重復性：按“1.2.1.4”色譜條件重復檢測DTacP-sIPV-Hib（批號：202111S04）6 次，統計峰面積、多糖含量和塔板數的 RSD。

⑵中間精密度：同一操作人員、不同操作人員檢測高（1.4 μg/ml）、中（0.8 μg/ml）、低（0.2 μg/ml）質量濃度的核糖醇參考品，每個濃度平行檢測3 次，統計各濃度測定的平均值、標準差 SD 及RSD。

1.2.2.6 耐用性 測試在不同流動相濃度、柱溫和流速下，實驗的耐受程度。每次實驗保證其他條件不變情況下，確定為單一變量（流動相濃度從580 mmol/L 改變為 450 mmol/L、柱溫從 30 ℃ 改變為 32 ℃、流速從 0.3 ml/min 改變為 0.4 ml/min），按“1.2.1.4”所述條件上機檢測，分別記錄不同條件下三批五聯苗中 Hib 多糖含量，考察方法的耐用性。

1.2.2.7 方法初步應用 采用建立的方法測定三批 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib 多糖的總含量。按照以下公式計算多糖含量：

多糖含量（μg/ml）=（稀釋倍數 × 樣品中核糖醇含量）/0.413

1.3 統計學處理

采用 Excel 2017 軟件計算平均值、SD 及RSD，并進行線性擬合，計算線性關系及相關系數（r2）。

2 結果

2.1 色譜柱的選擇

PRP 的 HPAEC-PAD 分析的早期研究使用CarboPac PA1 和 CarboPac PA10 柱[7,15,17]。我們參考制造商的推薦及相關文獻[18]，最終選取 MA1 色譜柱作為本次研究的色譜柱。

2.2 專屬性

采用 HPAEC-PAD 和 MA1 柱對不同醇類物質進行分離研究。核糖醇參考品（圖 1A）、Hib-TT結合疫苗原液（圖 1B）和 DTacP-sIPV-Hib（圖 1C）在相應位置均具有明顯的色譜峰（保留時間約21.5 min），而空白對照品（圖 1D）和甘油（圖 1E）在相應保留時間均無相應的色譜峰，表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 專屬性色譜圖（A：核糖醇參考品；B：Hib-TT 結合疫苗原液；C：DTacP-sIPV-Hib；D：空白；E：甘油）Figure 1 Chromatogram for verification of specificity (A: Ribitol reference; B: Hib-TT conjugate vaccine stock solution;C: DTacP-sIPV-Hib; D: Blank; E: Glycerol)

2.3 線性

通過信噪比（N/S ≥ 3）測定該方法的檢出限為 10 ng/ml，表明該方法靈敏度高。對核糖醇參考品標準曲線進行 6 次測定，測定結果見表 1。6 次結果的線性相關系數r2均大于 0.99，綜合斜率和截距，證明該方法的線性關系良好。不同濃度的參考品的峰值時間保持不變（從 21.534 ～21.634 min），如圖 2 所示。

圖2 核糖醇參考品標準曲線Figure 2 Standard curve detection of ribitol reference substance

表1 核糖醇參考品測定線性數據結果Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient

2.4 準確度

在 DTacP-sIPV-Hib（批號 202111S04）中加入高、中、低三個濃度參考品后的核糖回收率分別為100.43%、101.33% 和 100.44%，均在 95% ～ 105%之間，見表 2。表明該方法對 Hib 檢測無干擾，方法準確度良好。

表2 準確度驗證結果Table 2 Verification for accuracy

2.5 精密度

同一操作人員連續檢測 6 次同一批五聯苗樣品，Hib 多糖含量的 RSD（n = 6）為 1.45%，表明重復性良好。結果見表 3。

表3 重復性驗證結果Table 3 Verification for repeatability

不同操作人員對相同核糖醇參考品低（0.2 μg/ml）、中（0.8 μg/ml）、高（1.4 μg/ml）質量濃度 3 次檢測的相對標準偏差 RSD 分別為2.17%、2.52% 和 1.74%，見表 4。滿足人員間 RSD＜ 15% 的要求，說明中間精密度良好。

表4 中間精密度驗證結果Table 4 Verification for intermediate precision

2.6 耐用性

改變單一因素（柱溫、流速或洗脫液濃度）后得到的核糖醇參考品標準曲線具有良好的線性（r2＞ 0.99）。改變柱溫（30 → 32 ℃）后，各濃度的峰面積變化不大。雖然在改變流速后，每個濃度下的參比物的峰面積變得小于對照品的峰面積，并且在改變洗脫液濃度（580 → 450 mmol/L）后，各個濃度下的參考產物的峰面積變大，但是各條件下線性方程相關系數均大于 0.99，結果如表 5 所示。改變單一條件后，DTacP-sIPV-Hib 中 Hib 含量的RSD 均小于 5%，如表 6 所示。以上結果表明，在改變流速、柱溫或洗脫液濃度后，該方法具有良好的耐用性。

表5 耐用性驗證Table 5 The results of durability verification

表6 不同條件下聯合疫苗中 Hib 含量測定結果Table 6 Test results of polysaccharide content of test sample under different conditions

2.7 初步應用

利用建立的 HPAEC-PAD 法檢測 3 批DTacP-sIPV-Hib，多糖含量分別為 19.114、21.005和 18.511 μg/ml。為了更好地對 DTacP-sIPV-Hib中 Hib 含量的檢測方法進行驗證，用該方法對三批疫苗各進行了 19 次檢測，統計分析了 19 次結果的 95% 置信區間（CI）為 16.58 ～ 21.77 μg/ml，結果表明該方法適用于 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib多糖含量測定，精密度良好，具有很好的方法重復性，見表 7。

表7 DTacP-sIPV-Hib 聯合疫苗中 Hib 多糖含量檢測結果Table 7 Detection results of Hib polysaccharide content in DTacP-sIPV-Hib combined vaccine

3 討論

由于 Hib 疫苗可以有效減少 Hib 侵襲性感染[19]，世界衛生組織（WHO）推薦使用 Hib 疫苗來減少 Hib 相關疾病的感染和發病率。截至 2020年，全世界 194 個世界衛生組織成員國（地區）中有 193 個已將 Hib 疫苗納入其免疫規劃。根據疫苗接種史，在 18 個月以下兒童中多糖-蛋白質結合疫苗比多糖疫苗更有效[20]。

傳統的 Hib 多糖含量檢測方法包括化學法（地衣酚）和 ELISA 法，目前最常用的方法是地衣酚法，也是《中國藥典》規定的標準方法。但地衣酚法會受到乳糖或蔗糖等常用保護劑的干擾，而ELISA 方法受不同批次 Hib 抗體的影響較大。HPAEC-PAD 離子色譜法不受上述條件的干擾，具有更高的靈敏度和準確度，因此可用于測量低濃度PRP 多糖樣品，如游離多糖含量，離子色譜法的靈敏度是地衣酚法的 30 倍[7]。迄今為止，英國國家生物制品控制研究所（NIBSC）已采用 HPAEC-PAD法作為測定 Hib 和腦膜炎球菌疫苗中多糖含量的標準方法[8]。

本研究中，采用 HPAEC-PAD 法來檢測DTacP-sIPV-Hib 中總的多糖含量。樣品中首先加入檸檬酸鈉從氫氧化鋁佐劑中解吸所有 PRP，然后通過 4000 ×g離心 5 min 來收集上清液，再加入高濃度鹽酸（6 mol/L）將樣品水解以使 PRP 制備成核糖醇單體。使用 580 mmol/L 氫氧化鈉作為流動相，等度洗脫模式提高了測定效率。通過 CarboPac MA1 色譜柱分離核糖醇單體，最終通過電流檢測器檢測。用該方法測定了三批 DTacP-sIPV-Hib 中Hib 的含量，結果與理論值無顯著差異，回收率大于 95%，這表明添加檸檬酸鈉減少了氫氧化鋁佐劑對 Hib 的吸附，并且使用高濃度的酸可以將多糖完全水解成 PRP 單元。聯合疫苗中游離多糖和載體蛋白結合的多糖含量也是評價含多糖類疫苗的關鍵指標，本研究的方法不太適用于以上多糖含量的檢測，目前正在積極開發檢測游離多糖和載體蛋白結合的多糖含量的檢測方法。

總之，本研究建立的酸水解聯合 HPAEC-PAD法檢測聯合疫苗中 Hib 總多糖含量具有良好的特異性、精密性、穩定性和準確性。該方法不需要進行樣品衍生，可以批量檢測含鋁佐劑中 Hib 多糖的含量。同時，為檢測其他多糖蛋白偶聯物或聯合疫苗中的多糖提供了思路。