肉桂醛納米乳的制備及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)

常格，牛霞，李桂玲

目的 構(gòu)建肉桂醛納米乳（Cin-NE），以提高肉桂醛（Cin）穩(wěn)定性、溶解度以及口服生物利用度。

方法 將 Cin 同時(shí)作為藥物和油相，以蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-35）為乳化劑，構(gòu)建 Cin 乳劑（Cin-E），稀釋后得到具有抗稀釋性的納米遞送系統(tǒng)—— Cin-NE，通過激光粒度儀對(duì)其粒徑和 PDI 進(jìn)行檢測(cè)，采用 UPLC 對(duì)納米乳中肉桂醛含量進(jìn)行檢測(cè)，以外觀性狀、粒徑和含量為指標(biāo)，考察長(zhǎng)期放置的 Cin-NE 的穩(wěn)定性。此外，通過對(duì) SD 大鼠進(jìn)行口服灌胃給藥，研究該納米乳的口服吸收情況以及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征。

結(jié)果 將 Cin 載入納米乳中，顯著提高了藥物在水中的溶解度；Cin-E 中 Cin 含量為 90.9 mg/ml，其制備的 Cin-NE粒徑較小且分布均勻，在水、模擬胃液和模擬腸液中具有抗稀釋性；4 ℃ 下放置穩(wěn)定性良好。SD 大鼠口服灌胃給藥的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，Cin-NE 生物利用度是 Cin 原料藥的3 倍，可見納米乳顯著改善了 Cin 的口服吸收。

結(jié)論 成功構(gòu)建了無需額外加入其他油相、無需助乳化劑、處方精簡(jiǎn)、工藝簡(jiǎn)單的 Cin 納米藥物遞送系統(tǒng) Cin-NE，其穩(wěn)定性、溶解度以及口服生物利用度顯著優(yōu)于 Cin，為 Cin的臨床應(yīng)用提供了有益的探索和啟示。

肉桂屬于樟科植物，原產(chǎn)于中國(guó)，是傳統(tǒng)的藥食同源植物。肉桂中化學(xué)組分繁多，存在大量揮發(fā)油類物質(zhì)，通常被稱為肉桂油；此外還含有黃酮類、萜類、香豆素類、多糖等成分。肉桂油的主要成分為肉桂醛（cinnamaldehyde，Cin），含量最高可達(dá)90% 以上，是肉桂最重要的活性成分[1-2]。肉桂醛也被稱為桂皮醛，天然存在的肉桂醛均為反式結(jié)構(gòu)，屬于天然苯并烯醛結(jié)構(gòu)化合物，室溫為淡黃色油狀液體，并具有芳香氣味。

肉桂醛來源于天然植物，易于獲取，毒性極低，且已被證實(shí)具有多種顯著的藥理活性，包括抗炎、抗菌、抗癌以及抗糖尿病等特性[3-5]。但由于肉桂醛本身為油狀液體，水中溶解度極低，導(dǎo)致口服生物利用度差。此外，肉桂醛長(zhǎng)期放置易被氧化。因此，肉桂醛作為藥物應(yīng)用于臨床仍任重而道遠(yuǎn)。通過構(gòu)建肉桂醛的納米遞送系統(tǒng)，提高其穩(wěn)定性、溶解度以及口服生物利用度，是增加肉桂醛成藥性的一種可行辦法。納米乳制備簡(jiǎn)單，無需大量載體材料，載藥量高，毒性低且性狀穩(wěn)定，可口服給藥。由于其結(jié)構(gòu)中同時(shí)具有親水和親油區(qū)域，納米乳可顯著提高藥物溶解度，進(jìn)而提高生物利用度[6]。由于肉桂醛室溫下為油狀液體，在作為藥物的同時(shí)，還可作為納米乳組分中的油相，能夠進(jìn)一步精簡(jiǎn)處方；且其制備方法簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本文構(gòu)建肉桂醛的納米乳遞送系統(tǒng)，并對(duì)其抗稀釋性、放置穩(wěn)定性和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了考察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 RTCbasic 磁力攪拌器為德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品；ME303E 分析天平和 XS105 分析天平均為瑞士梅特勒-托利多儀器公司產(chǎn)品；Nano-ZS90 激光粒度及 Zeta 電位分析儀為英國(guó)馬爾文儀器有限公司產(chǎn)品；LC-2040C 3D MT 超高效液相色譜為日本島津公司產(chǎn)品；UPLC/MS/MS 系統(tǒng)，包括Xevo TQ-S 三重四極桿質(zhì)譜儀、Acquity UPLC 均為美國(guó) Waters 公司產(chǎn)品；SCI-VSv 渦旋振蕩器和 D3024R 高速冷凍離心機(jī)均為美國(guó)賽洛捷克公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 肉桂醛、蓖麻油聚氧乙烯醚、吐溫80、胃蛋白酶均購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油購(gòu)自北京華威銳科化工有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司；肉桂酸、肉桂酸甲酯、氯霉素均購(gòu)自南京源植生物科技有限公司；甲醇購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) SD 大鼠18 只，8 周齡，雄性，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，在晝夜交替照明、恒溫恒濕環(huán)境中飼養(yǎng) 3 d，自由飲水進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 Cin-E 處方篩選及 Cin-NE 的制備 首先，對(duì)肉桂醛乳劑的乳化劑種類及含量進(jìn)行篩選。室溫條件下，稱取 600 mg 肉桂醛，分別以吐溫80、聚氧乙烯氫化蓖麻油（ethoxylated hydrogenated castor oil，RH）以及蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-35）為乳化劑，乳化劑用量如表 1 所示，于 600 r/min轉(zhuǎn)速下混合均勻，獲得油相體系，然后將 5 ml 純凈水逐滴加入油相體系中，滴加過程保持轉(zhuǎn)速為600 r/min，持續(xù)攪拌 3 min，使之形成分散體系，觀察所得分散體系外觀。對(duì)外觀良好的處方進(jìn)行進(jìn)一步考察，取 20 μl 新制備的處方于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 純凈水進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，后立即采用激光粒度儀進(jìn)行粒徑及 PDI 的測(cè)定。將制劑置于 4 ℃ 保存，于 7 d 后觀察外觀并再次進(jìn)行粒徑測(cè)定，初步篩選出可制得均勻分布的Cin-NE 的 Cin-E 最佳處方。

表1 肉桂醛乳劑處方篩選Table 1 Prescription screening of Cin-E

1.2.2 Cin-NE 抗稀釋性研究 分別采用水、模擬胃液（SGF）以及模擬腸液（SIF）對(duì) Cin-E 最佳處方進(jìn)行抗稀釋性考察，探索 Cin-E 口服給藥后進(jìn)入消化道形成納米乳的可行性。

1.2.2.1 SGF 和 SIF 配制

SGF：取鹽酸 384 μl 與 50 ml 水混合后，加入胃蛋白酶 1 g，混合均勻，加水稀釋至 100 ml，搖勻。

SIF：稱取磷酸二氫鈉 0.6 g，溶解在 50 ml 水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 6.8，加入胰蛋白酶 1 g，混合均勻，加水稀釋至 100 ml，搖勻。

1.2.2.2 Cin-NE 對(duì)水、SGF 及 SIF 的抗稀釋性研究 取 Cin-E 于 1.5 ml EP 管中，分別采用水、SGF、SIF 以 1:20、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 的比例進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，后采用激光粒度儀進(jìn)行粒徑測(cè)定。

1.2.3 Cin-E 及 Cin-NE 放置穩(wěn)定性考察 室溫條件下，取 600 mg 肉桂醛于 5.8 ml 純凈水中，混合均勻，即得理論上總體系中 Cin 濃度與 Cin-E相同的非均相肉桂醛乳濁液（Cin-Water）。

取 20 μl 新制備的最佳處方 Cin-E 于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 純凈水進(jìn)行稀釋，輕輕振蕩混勻，即得 Cin-NE，后立即采用激光粒度及 Zeta 電位分析儀進(jìn)行粒徑、PDI 及 Zeta 電位的測(cè)定。

取 Cin-E 和 Cin-Water 各 10 μl，前者加水制得 Cin-NE，然后將 Cin-NE 與 Cin-Water（吸取其中水相層）分別以甲醇稀釋至適宜濃度后，采用UPLC 法測(cè)定肉桂醛含量（流動(dòng)相：60% 甲醇 -水，柱溫：30 ℃，流速：0.2 ml/min）。

將 Cin-E 和 Cin-Water 分別避光儲(chǔ)存于 25 ℃和 4 ℃ 條件下，考察兩者在不同環(huán)境下的放置穩(wěn)定性，包括粒徑分布穩(wěn)定性與藥物含量穩(wěn)定性。

1.2.4 Cin-NE 在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

1.2.4.1 藥品配制 室溫條件下，稱取 600 mg肉桂醛、600 mg 蓖麻油聚氧乙烯醚，于 600 r/min轉(zhuǎn)速下混合均勻，獲得油相體系，然后將 5 ml 純凈水逐滴加入油相體系中，滴加過程保持轉(zhuǎn)速為600 r/min，持續(xù)攪拌 3 min，使之自發(fā)形成均一分散體系，即 Cin-E。

室溫條件下，稱取 600 mg 肉桂醛，加入 5.8 ml橄欖油，在 600 r/min 轉(zhuǎn)速下攪拌 3 min，混合均勻，制得理論上肉桂醛濃度與 Cin-E 相同的油狀液體，作為肉桂醛原料藥的給藥形式。

1.2.4.2 分組、給藥與血樣采集 將雄性 SD 大鼠隨機(jī)分為 3 組，每組 6 只，分別為空白組、原料藥（Cin）組以及制劑（Cin-NE）組，于給藥前禁食不禁水 12 h。空白組大鼠不給藥，直接進(jìn)行眼眶取血，置于 1.5 ml 肝素鈉 EP 管中；原料藥組和制劑組大鼠均以 250 mg/kg 劑量分別灌胃給予Cin 與 Cin-E（Cin-E 在消化道中被稀釋產(chǎn)生Cin-NE），并于給藥后 10、30 min、1、2、3、4、6、8、12、24 h 進(jìn)行眼眶取血 200 μl，置于 1.5 ml肝素鈉 EP 管中。待血樣 4 ℃ 靜置分層后，于3000 r/min、4 ℃ 條件下離心 15 min，取上清液，即為血漿樣品，保存于 -80 ℃ 冰箱中備用，使用時(shí)于 4 ℃ 靜置融化。

表2 肉桂醛及其主要代謝產(chǎn)物質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometry conditions for cinnamaldehyde and its main metabolites

1.2.4.3 液質(zhì)條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），Shim-pack GIST-HP(G) C18 預(yù)柱（2 μm）；流動(dòng)相：[0.02 mol/L 醋酸銨-甲醇（95:5）]（A）-[0.02 mol/L醋酸銨-甲醇（5:95）]（B），梯度洗脫（0 ～ 2.5 min為 100% A，2.5 ～ 5 min 線性轉(zhuǎn)變?yōu)?100% B，5 ～8 min 維持 100% B，8 ～ 12 min 線性恢復(fù)為 100%A）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 ml/min。采用電噴霧離子源（ESI 源）；毛細(xì)管電壓：3 K；脫溶劑氣：500 ℃；其余質(zhì)譜參數(shù)如表 2 所示。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取 10 mg 氯霉素于 50 ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，得到內(nèi)標(biāo)貯備液。臨用時(shí)采用甲醇將貯備液稀釋 10 000 倍，得到濃度約為 20 ng/ml 的內(nèi)標(biāo)溶液。

對(duì)照品貯備液：精密稱取 10 mg 肉桂醛、10 mg肉桂酸、50 mg 肉桂酸甲酯于同一 50 ml 容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度。采用甲醇將上述溶液稀釋 5 倍作為 S1，然后倍比稀釋得到 S2 ～S11，即為對(duì)照品貯備液。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取上述不同濃度對(duì)照品貯備液（S1 ～ S11）10 μl，向其中加入 90 μl 空白血漿，渦旋混勻。然后，分別量取上述溶液 30 μl，向其中加入 90 μl 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋 5 s，14 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min，取上清液，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

空白溶液：取 30 μl 空白血漿，加入 90 μl 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋 5 s，14 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min。取上清液，作為空白溶液。

分別精密量取空白溶液及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各70 μl，進(jìn)行 UPLC/MS/MS 檢測(cè)，分別以肉桂醛、肉桂酸、肉桂酸甲酯的響應(yīng)值對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.5 樣品處理及檢測(cè) 分別量取 1.2.4.2 項(xiàng)下的血漿樣品各 30 μl，向其中加入 90 μl 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋 5 s，14 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min。取上清液 70 μl，進(jìn)行 UPLC/MS/MS 檢測(cè)，記錄各樣品中肉桂醛、肉桂酸、肉桂酸甲酯的響應(yīng)值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其含量。

2 結(jié)果

2.1 Cin-E 的處方篩選

肉眼觀察不同乳化劑種類和用量的處方所得制劑外觀，處方 1 和處方 7 可見大量白色不溶顆粒，其余處方外觀良好，為均一乳白色液體。4 ℃ 放置 7 d 后，處方 4、8、9 外觀無明顯變化，其余處方均發(fā)生分層現(xiàn)象。對(duì)各處方樣品進(jìn)行粒徑測(cè)定，結(jié)果如表 3 所示。處方 4 放置 7 d 后 PDI 過大，因此優(yōu)選處方 8、9。處方 8 中 EL-35 含量更低，考慮載藥量與安全性，故選擇處方 8 作為Cin-E 的最佳處方，用于后續(xù)研究。

表3 肉桂醛乳劑不同處方粒徑分布Table 3 Particle size distribution of various CIN-E prescription

2.2 Cin-NE 抗稀釋性研究

Cin-E 在水、模擬胃液和模擬腸液中，以 1:20、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 的比例稀釋后，均可形成粒徑分布均一的 Cin-NE（圖 1），表明 Cin-E 形成 CIN-NE 的抗稀釋范圍大，口服后可在消化道中被稀釋形成納米乳。

圖1 Cin-E 以不同比例水、模擬胃液和模擬腸液稀釋后所得 Cin-NE 粒徑Figure 1 The particle size of Cin-NE after dilution of Cin-E with different proportions of water, SGF and SIF

2.3 穩(wěn)定性考察

新制備的 Cin-E 外觀為均一的乳白色液體，加水稀釋后為半透明液體，呈淡藍(lán)色乳光，即 Cin-NE（圖 2），粒徑為 188.1 nm，PDI 為 0.247，說明其粒徑在納米級(jí)，且粒徑分布均勻，Zeta 電位為-5.71 mV，帶負(fù)電（圖 3）；Cin 水中飽和溶解度＜ 1 mg/ml，Cin-E 中 Cin 含量為 90.9 mg/ml，極大提高了 Cin 水中溶解度。Cin-Water 為非均相油水混合物，總體系中 Cin 的濃度理論上與 Cin-E相同，由穩(wěn)定性考察結(jié)果可知：Cin-Water 靜置后出現(xiàn)水油分離，水相中藥物含量急劇下降；Cin-E 放置后外觀良好，未見明顯分層，加水稀釋后制得的Cin-NE 藥物含量穩(wěn)定性較 Cin-Water 明顯提升，且粒徑分布均一。可見，與 Cin-Water 相比，Cin-NE穩(wěn)定性顯著提高。長(zhǎng)期放置（365 d）后，4 ℃ 放置的 Cin-E 所得 Cin-NE 的粒徑、含量均較 25 ℃更加穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的放置穩(wěn)定性（圖 4、圖 5）。需要指出的是，Cin-E 在 25 ℃ 放置 170 ～ 210 d期間，其外觀性狀已發(fā)生明顯變化，肉眼可觀察到肉桂醛析出的現(xiàn)象，且 PDI 也顯著增大，此時(shí)的粒徑結(jié)果（粒徑下降）已不能準(zhǔn)確反映體系的穩(wěn)定情況。

圖3 Cin-NE 粒徑（A）和 Zeta 電位（B）分布圖Figure 3 Size (A) and Zeta potential (B) distribution of Cin-NE

圖4 25 ℃ 和 4 ℃ 貯存下 Cin-E 稀釋后所得 Cin-NE的粒徑變化Figure 4 Changes of particle size of Cin-NE obtained by diluting Cin-E storaged in 25 ℃ and 4 ℃ after long-term

圖5 25 ℃ 和 4 ℃ 貯存下 Cin-Water 和 Cin-E 中 Cin 含量變化Figure 5 Changes of Cin content of Cin-Water and Cin-NE storaged in 25 ℃ and 4 ℃ after long-term

2.4 Cin-NE 在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)考察

分別以 Cin 組和 Cin-NE 組血漿樣品中肉桂醛、肉桂酸、肉桂酸甲酯的濃度對(duì)時(shí)間作圖，得到這幾種成分的血漿濃度-時(shí)間曲線（圖 6、圖 7、圖 8）。由結(jié)果可見，肉桂醛口服吸收入血后迅速轉(zhuǎn)化為肉桂酸和肉桂酸甲酯，肉桂醛含量極低（圖 6），故通過血漿中肉桂酸和肉桂酸甲酯的含量變化對(duì)體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。

圖6 大鼠血漿肉桂醛含量變化Figure 6 Changes of plasma cinnamaldehyde content in rats

圖7 大鼠血漿肉桂酸含量變化（右圖為左圖虛線框內(nèi)的放大）Figure 7 Changes of plasma cinnamic acid content in rats (The right image is an enlargement of the left dashed box)

圖8 大鼠血漿肉桂酸甲酯含量變化（右圖為左圖虛線框內(nèi)的放大）Figure 8 Changes of plasma methyl cinnamic acid content in rats (The right image is an enlargement of the left dashed box)

Cin 原料藥在大鼠體內(nèi)口服吸收極差，而Cin-NE 顯著增加了肉桂醛的口服吸收。Cin-NE 組SD 大鼠體內(nèi)肉桂酸AUC是原料藥的 3 倍，Cmax較原料藥提高 3 倍，CLz/F 僅為原料藥的 1/3（表 4）；Cin-NE 組肉桂酸甲酯AUC是原料藥的2 倍，Cmax接近原料藥的 3 倍，CLz/F 顯著下降（表 5）。

表4 大鼠體內(nèi)肉桂酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters of cinnamic acid in rats

表5 大鼠體內(nèi)肉桂酸甲酯藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 5 Pharmacokinetic parameters of methyl cinnamic acid in rats

3 討論

Cin 作為食品中常用的天然香料成分，毒性極低且具有抗炎抗菌等多種藥理活性，具有很高的藥用價(jià)值。Cin 室溫下為淡黃色油狀液體，在水中溶解度低，口服生物利用度差，且易被氧化，長(zhǎng)期放置穩(wěn)定性差。因此，有必要通過構(gòu)建 Cin 的納米藥物遞送系統(tǒng)提高其穩(wěn)定性以及口服生物利用度。

本文利用 Cin 室溫為油狀液體的物理性質(zhì)，以 Cin 原料藥自身作為油相，以 EL-35 為乳化劑，無需助乳化劑，成功制備外觀呈均一乳白色的Cin 乳劑——Cin-E，該乳劑稀釋后即得具有淡藍(lán)色乳光和抗稀釋性的 Cin 納米乳遞送系統(tǒng)——Cin-NE，經(jīng)粒徑測(cè)定可知其粒徑在納米級(jí)，且粒徑分布良好。長(zhǎng)期放置的 Cin-E 稀釋所得的 Cin-NE外觀性狀無明顯變化，粒徑仍然保持穩(wěn)定，藥物含量穩(wěn)定性較原料藥大幅提升，且在 4 ℃ 下的放置穩(wěn)定性顯著優(yōu)于室溫，表明 Cin-NE 的構(gòu)建成功提高了肉桂醛的水中溶解度與放置穩(wěn)定性。此外，通過對(duì) SD 大鼠進(jìn)行口服灌胃給藥，探究肉桂醛原料藥及其納米乳的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征，可知該納米乳顯著提高了肉桂醛的口服生物利用度，具有更高的AUC，Cmax以及更小的 CLz/F。

綜上可知，Cin-NE 的構(gòu)建成功解決了肉桂醛原料藥穩(wěn)定性差、水中溶解度低以及口服生物利用度差等問題，大大增加了肉桂醛的成藥性，對(duì)肉桂醛的臨床應(yīng)用產(chǎn)生一定的推進(jìn)作用。