國標法和新型試劑盒法測定維B12 含量的方法比較

蔡曉霞，吳家碧，陳葉蘭，李詩華，陳紫媚，盧靖怡，蘆 平，謝黔蘭

（湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040）

0 引言

維B12也叫鈷胺素，是指一類具有含三價金屬鈷鍵的多環系物質，4 個被還原后的呋咯環連接在一起可轉變而成的1 個咕啉大環系（與卟啉相似）化合物，為自然界唯一的含有鈷金屬單質子的維生素，也是人類目前所知的分子量最大、系統最復雜的維生素分子，按其溶解性分為水溶性和脂溶性維生素[1]。維B12對于人體來說非常的重要，這種元素可以幫助人體維持中樞神經系統的正常運轉，也會影響到細胞間質的功能和神經膠質，以及細胞髓磷脂的人體含量。另外，維B12在部分臨床疾病的治療上發揮著重要作用，可參與制造骨髓紅細胞，防止惡性貧血，防止大腦神經受到破壞等，而缺乏維B12則可能導致惡性貧血、精神抑郁、血管性癡呆及阿爾茨海默病等疾病[2]。因此，適量補充維B12，對于維持人體的健康來說非常重要，但是維B12的攝入量也不是越多越好。有研究表明，服用過量的維B12，可能導致面部浮腫、腹痛泄瀉、低血鉀癥等。因此，對于嬰幼兒配方乳品和營養補充食品中維B12的含量檢測準確性要求越來越高。

目前，食品中維B12的檢測方法越來越豐富[3]，包括微生物法[4-6]、試劑盒法[7-9]、高效液相色譜法[10-12]、化學發光法[13]、酶聯免疫法[14]等。其中，微生物法具有檢測靈敏度較高、檢出限低等顯著優點，是目前美國、中國等許多國家采用的一種官方微生物分析方法。我國現行國家標準GB 5413.14—2010、美國政府機構的實驗室、FDA 和AOAC 均采用該方法[2]。

維B12試劑盒檢測方法為《GB 5413.14—2010 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維B12的測定》的簡化方法，具有簡單、高效、準確度高及穩定性好的優點，主要適用于檢測外添加的營養膳食補充劑的維B12含量。采用國標法和新型試劑盒法測定嬰兒配方乳粉定量分析質控樣品中維B12的含量，通過方法的專屬性、線性、精密度和回收率對比2 種檢測方法結果的差異，為實驗室在乳粉類樣品中維B12含量的檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣品

標準菌株：萊氏曼氏乳桿菌，ATCC 7830，來源于廣東微生物菌種保藏中心。

質控樣品：嬰兒配方乳粉中維B12定量分析質控樣品（維B12特性值5.09 μg/100 g，滿意范圍為4.16～6.02 μg/100 g），購自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心，貨號QC-IP-741。

1.1.2 標準品和培養基

維B12標準品：純度≥91.3%，中國食品藥品檢定研究院提供；培養基：乳酸桿菌肉湯培養基，青島高科技工業園海博生物技術有限公司提供；維B12測定培養基，美國BD 公司提供。

1.1.3 試劑盒

維B12檢測試劑盒，批號RS12.170424，深圳市瑞賽生物技術有限公司提供；其組成為維B12凍干菌、維B12凍干標品、維B12測定培養基、無菌水、96 孔微孔板，封板膜等。

1.1.4 儀器與設備

AL-204 型分析天平，梅特勒-托利多科學儀器有限公司產品；BXM-30R 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；UV-2600型紫外-可見分光光度計，島津公司產品；BSC-1600-Ⅱ-A2 型生物安全柜，蘇州市華宇凈化設備有限公司產品；SPX-250BSH-Ⅱ型生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司產品；1～5 mL 移液槍（編號：19E62016）、100～1 000 μL移液槍（編號：16G12712），上海安譜實驗科技股份有限公司產品；TGL-10C 型離心機，上海安亭科學儀器廠產品；HH-8 型水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司產品；MULTISKAN FC 型酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線制作

（1）國標法。參考GB 5413.14—2010，配制維B12標準曲線工作液，按照標準系列管制備方法，配制0～0.440 0 ng 范圍內的標準系列管，每個梯度做3 個平行。以標準系列管維B12含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制國標法維B12標準曲線。

（2）試劑盒法。取出1 包試劑盒提供的維B12凍干標準品（2 板共16 孔），加入適量無菌水后，按照說明書，配制0.00，0.025，0.050，0.100，0.160，0.360 μg/100 g 系列質量濃度的標準溶液。每個質量濃度做2 個平行，培養后進行測定，以維B12標準管質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制維B12檢測試劑盒標準曲線，該方法定量限為0.025 0 μg/100 g。

1.2.2 樣品處理及測定

選取定量標準乳粉質控樣品，按照GB 5413.14—2010 和試劑盒說明書對樣品進行相應處理，并進一步稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養24 h，國標法采用紫外分光光度計測定吸光度，試劑盒法采用酶標儀測定吸光度。

2 測試指標

2.1 標準曲線線性

根據測定結果擬合的標準曲線考查曲線的線性。

2.2 方法專屬性

通過測定試驗中培養基的本底值，以此判斷培養基的本底對試驗帶來的影響，從而確定方法的專屬性是否良好。國標方法中，以S0調零，S0+菌的OD值作為測定的培養基本底值；試劑盒方法中，以標準曲線中S1（即為空白點）的OD 值作為測定的培養基本底值。

2.3 精密度試驗

分別取6 份乳粉質控樣品，按照國標方法和試劑盒說明書進行樣品處理，并進行適當稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養24 h，國標法采用紫外分光光度計測定結果，試劑盒法采用酶標儀測定結果。

2.4 準確性試驗

分別取9 份乳粉質控樣品，分成低、中、高3 組（每組3 份），并且分別加入50%，100%，150%維B12含量的標液，按照國標方法和試劑盒說明書進行樣品處理，并進行適當稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養24 h，國標法采用紫外分光光度計測定結果，試劑盒法采用酶標儀測定結果，通過測定加標試驗中維B12含量，計算回收率。

2.5 穩定性試驗

選用乳粉質控樣品進行穩定性試驗，測試同一批樣液在不同時間段的穩定性，即將樣品提取液在4 ℃冰箱中貯存0，3，6，9，12，24，48 h 后，分別測試放置不同時間段的提取液中維B12的含量，比較測試結果之間的差異。

3 2 種方法的數據對比與分析

3.1 標準曲線的線性

國標法采用Labslution 繪制標準曲線，維B12質量濃度為0.044 0～0.440 0 ng/mL。

國標法維B12標準曲線見圖1。

試劑盒法采用試劑盒提供的軟件Elisa 制作標準曲線，維B12含量為0.025～0.360 μg/100 g。

試劑盒法維B12標準曲線見圖2。

圖2 試劑盒法維B12 標準曲線

由圖1 可知，國標法維B12標準曲線方程為Y=16.070 0X3-16.410 1X2+6.577 59X-0.047 675 3，R2=0.996 44，相關系數R=0.998 21＞0.99，即在含量為0.044 0～0.440 0 ng 范圍內，曲線線性關系良好。

由圖2 可知，試劑盒法維B12標準曲線方程為Y=（0.973 28-0.054 24）/[1+（X/0.168 40）-1.714 77]+0.054 24，R2=0.999 05，相關系數R=0.999 52＞0.99，即在含量為0.025～0.360 ng 范圍內，曲線線性關系良好，該方法定量限為0.025 0 μg/100 g。

3.2 方法專屬性

國標方法中，以S0調零，測定S0+菌的OD 值3 次；試劑盒方法中，測定S1的OD 值10 次。

空白管試驗結果見表1。

表1 空白管試驗結果

由表1 可知，2 種方法的空白管OD 值都＜0.1，但該OD 值對標液和樣液的測定結果有一定的影響，因此，每次測定國標法時都以該標液空白管調零，然后再進行標準曲線和樣液的紫外吸光度測定；采用試劑盒方法進行測定及結果計算時，每次都需將標準曲線和樣液的OD 值扣除空白管的OD 值后進行計算。

3.3 精密度試驗

分別取6 份樣品，按照國標方法和試劑盒說明書進行樣品處理，并進行適當稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃下培養24 h 后測定吸光度。

精密度試驗結果見表2。

表2 精密度試驗結果

由表2 可知，傳統國標法測定質控樣品的精密度試驗結果為5.18 μg/100 g，試劑盒法測定質控樣品的精密度試驗結果為5.06 μg/100 g，精密度均符合《GB/T 27404—2008 實驗室質量控制規范》的要求（精密度要求≤7.5%）；2 種方法測定結果的偏差為1.8%＜15%，對2 種方法的6 次測定結果的平均值采用F 檢驗（95%的置信度），F0.05（5，5）=1.02＜F 表（5.05），說明2 種方法的測定結果無明顯差異，表明2 種方法的精密度及重復性良好。

3.4 準確性試驗

分別取9 份乳粉質控樣品，分成低、中、高3 組（每組3 份），并且分別加入50%，100%，150%維B12含量的標液，按照國標方法和試劑盒說明書進行樣品處理，并進行適當稀釋，加樣并接種菌液后于37 ℃條件下培養24 h，國標法采用紫外分光光度計測定結果，試劑盒法采用酶標儀測定結果，通過測定加標試驗中維B12含量，計算回收率。

回收率試驗結果見表3。

表3 回收率試驗結果

由表3 可知，國標法和試劑盒法測定乳粉質控樣品的回收率分別為97.3%和113.6%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范》 的要求“GB/T 27404—2008 要求回收率為90%～120%”，2 種方法測得的回收率偏差為7.7%，偏差＜10%，表明2 種方法的準確度較高。

3.5 穩定性試驗

分別采用國標方法和試劑盒法對質控樣品和健樂多乳清蛋白粉進行穩定性試驗，測試同一批樣品提取液在4 ℃冰箱貯存0，3，6，9，12，24，48 h后樣品的維B12含量。

穩定性試驗結果見表4。

表4 穩定性試驗結果

由表4 可知，國標法和試劑盒法測定乳粉質控樣品提取液放置0～48 h 后的維B12含量平均值分別為5.25 μg/100 g 和5.15 μg/100 g，2 種方法的RSD值分別為2.0%和2.8%，均小于5%，說明樣品提取液于4 ℃冰箱中儲存48 h 后，樣液中維B12的含量穩定，2 種方法的穩定性良好。

4 討論

試驗采用GB 5413.14—2010[15]和維B12檢測試劑盒測定嬰兒配方乳粉中維B12定量分析質控樣品中維B12的含量，2 種方法標準曲線相關系數均在0.99以上，曲線擬合度較好，培養基本底值較低，方法專屬性良好；定量標準質控樣品檢測的結果均在滿意范圍內且接近特性值，結果準確；2 種方法的精密度均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范》[16]的要求，且精密度較高、重復性較好；2 種方法的回收率均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范》 的要求，且2 種方法的回收率偏差均小于10%；2 種方法的穩定性試驗結果RSD 均小于5%，方法穩定性良好。

國標方法檢測維B12的過程較為復雜繁瑣，包括了菌株活化、傳代、保藏和接種液的制備等，要嚴格控制菌株的活化、培養過程，保證菌株對維B12的特異性，這對實驗室檢測人員的技術操作水平提出了較高的要求；其次，采用國標法檢測維B12含量時，需要選擇合適的測定培養基，尤其需要關注培養基的本底值。本底值低，標準曲線擬合度高，線性良好是獲得準確檢測結果的前提；最后，采用國標法檢測維B12含量時，還需要關注到所用玻璃器皿的潔凈度。少量的外源物質可能導致試驗的失敗。因此，需要使用活性劑對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗，清洗之后要在180 ℃以上干熱滅菌2 h 以上，從而確保去除殘留的微量生長因子。

試劑盒方法是基于國標方法研制的一種快速檢測方法。與國標方法相比，試劑盒方法有較為明顯的優勢，首先，采用試劑盒方法進行樣品中維B12的含量測定時，前處理使用試劑盒提供的提取液進行水浴提取，操作步驟簡便，無需調pH 值，操作誤差小，且樣品處理時間短；其次，試劑盒方法采用的是即用型凍干菌粉，節省了每次轉接菌株及制備菌懸液的步驟，保證每次試驗各微孔中菌液量及活性一致[17]；另外，試劑盒方法采用的是即用型凍干標準品，即將標準品按梯度固定的量以凍干粉的形態儲存于微孔板中，試驗時只需要將無菌水加入到每個微孔中進行吹打溶解即可，節省了每次配制標液的步驟，操作誤差小，操作過程方便快捷。

另外，試劑盒方法主要用酶標儀進行標準曲線和樣液的OD 值測定。1 次可測定96 個微孔的OD值，整個測定過程只需要3～5 min，非常簡便、快捷，省去了國標方法中每支試管分別測定OD 值的繁雜過程。最后，對于檢測純外添加營養素的樣品，試劑盒方法可以一次提取出維B12、葉酸、泛酸和生物素含量，節省了國標方法中多測提取不同營養素的過程，檢測效率更高。總體而言，與傳統的國標方法相比較，新型的試劑盒方法具備操作簡便、檢測效率高、檢測結果準確的優點，這與史贇學[7]、王贏[8]、黃曉林等人[9]的研究結果基本一致。

5 結論

試驗采用國標法和試劑盒方法測定嬰兒配方乳粉定量分析質控樣品中[9]的含量。結果表明，2 種方法的標準曲線線性均良好（R＞0.99），方法的專屬性良好，質控樣品檢測的結果均在滿意范圍內且接近特性值，結果準確、重復性和穩定性好，2 種方法的檢測結果差異性不顯著[17-18]，可根據實驗室的經濟能力及實驗室自身條件選擇適當的方法進行測試。