不同分子量牛蒡多糖的生物活性研究

王解語，滕迎弟，唐業(yè)豪，黃莉莉， 巫永華，2，張建萍，2，劉恩岐，2

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇徐州 221018；2.徐州工程學院江蘇省食品資源開發(fā)與質量安全重點建設實驗室，江蘇徐州 221018）

牛蒡（Arctium lappa L.）為菊科牛蒡屬兩年生草本植物，是傳統(tǒng)藥食同源的植物，多糖類是牛蒡中具有重要生理活性的物質之一，且含量較高。對于牛蒡多糖的提取和生物活性的研究已經有大量的報道，呂俊梅等人[1]優(yōu)化了微波法提取牛蒡多糖的工藝；唐仕榮等人[2]采用超聲波法制備了牛蒡多糖，且表明其具有一定的清除DPPH·和·OH 的能力；李玲玉等人[3]也優(yōu)化了超聲輔助提取牛蒡多糖的工藝，并對其體外和細胞內的抗氧化活性進行了評價；張辰辰等人[4]優(yōu)化了綠色高效的動態(tài)高壓微射流工藝提取牛蒡多糖，分析表明牛蒡根多糖為呋喃型多糖，并具有較好的清除DPPH·、·OH 和ABTS+·的能力；課題組也考查了雙水相[5]和閃式提取[6]制備牛蒡多糖的工藝及其抗氧化活性。但牛蒡多糖組成較為復雜，研究表明多糖的生物活性與其相對分子量大小有關[7]，Ling Shi-kuan 等人[8]研究發(fā)現，相對分子質量越小的多糖，其抗氧化性越強；趙婷婷[9]也研究表明分子量對壇紫菜多糖生物活性影響很大，分子量越低其體外抗氧化活性和免疫調節(jié)作用越顯著。此外，李彩藝等人[10]研究雙參多糖和朱曉冉等人[11]研究黑木耳多糖時也得出相似的結論。而有關不同分子量牛蒡多糖生物活性的研究較少，采用超濾技術獲得不同分子量段的牛蒡多糖，并對其抗氧化、降血糖和膽酸鹽結合能力等生物活性進行研究，為其進一步開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡，購自農貿市場。

沒食子酸、蘆丁、D -半乳糖醛酸、葡萄糖、福林酚、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH），上海葉源生物科技公司提供；苯酚、無水乙醇、濃硫酸，國藥集團上海試劑公司提供。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MILLIPORE 小型切向流超濾系統(tǒng)，默克生物科技有限公司產品；BGZ-76 型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司產品；ALPHA1-4 LD plus 型冷凍干燥機，德國CHRIST 儀器公司產品；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司產品；BioTek Synergy2 型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛蒡多糖的制備

將鮮牛蒡根洗凈、切片，采用質量分數為1.5%的檸檬酸溶液浸泡2～3 min，撈出瀝水后，于50 ℃鼓風干燥箱中烘干，粉碎后過80 目篩，冷藏備用。取一定量的牛蒡粉，加入5 倍體積的體積分數為95%的乙醇溶液浸泡2 h，重復3 次。將藥渣置于50 ℃烘箱中烘干，按料液比1∶30（g∶mL）加入純水，于85 ℃條件下提取3 h 后過濾，濾液濃縮至1/10 后加入無水乙醇至其體積分數為80%，于4 ℃條件下靜置12 h。將沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌3 次去除色素等雜質。用去離子水完全溶解粗多糖，將Sevage 試劑（正丁醇∶氯仿=1∶4）與多糖溶液按1∶4 的比例混勻，攪拌60 min 以脫除蛋白質，多糖溶液冷凍干燥后獲得牛蒡多糖，放入自封袋中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同分子量牛蒡多糖的制備

取一定量的上述牛蒡多糖，用純水溶解后，采用MILLIPORE 小型切向流超濾系統(tǒng)，分別通過5，8，30，50，300 k 的超濾膜，在0.05 MPa 條件下超濾、濃縮、冷凍干燥，獲得不同分子量段的牛蒡多糖。

1.3.3 牛蒡多糖的生物活性研究

（1）DPPH·清除率的測定。參照姚芳等人[12]的方法，于波長517 nm 處測定吸光度，按照公式（1）計算DPPH·清除率。

式中：A1——牛蒡多糖樣品溶液與DPPH 混合液的吸光度；

A2——牛蒡多糖樣品溶液和乙醇混合液的吸光度；

A0——乙醇和DPPH 混合液的吸光度。

（2）·O2-清除率的測定。參照何芳等人[7]的鄰苯三酚自氧化法，測其于波長325 nm 處的吸光度，按照公式（2）計算·OH 清除率。

式中：A0——鄰苯三酚自氧化吸光度；

A1——加入牛蒡多糖溶液后的鄰苯三酚自氧化吸光度。

（3）α -淀粉酶抑制率的測定。參考湯陳鵬等人[13]的方法測定牛蒡多糖抑制α -淀粉酶的活性，測其于波長540 nm 處的吸光度。按照公式（3）計算α -淀粉酶的抑制率。

式中：A0——純水替換牛蒡多糖溶液測定的吸光度；

A1——牛蒡多糖溶液測定的吸光度；

A2——磷酸鹽緩沖液替換α -淀粉酶溶液測定的吸光度；

A3——純和磷酸鹽緩沖液分別替換牛蒡多糖溶液和α -淀粉酶溶液測定的吸光度。

（4）α -葡萄糖苷酶抑制率的測定。參考李婧雯等人[14]的方法測定牛蒡多糖抑制α -葡萄糖苷酶的活性，采用多功能酶標儀測其在405 nm 波長處的吸光度，按照公式（4）計算α -葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A——牛蒡多糖溶液測定的吸光度；

A1——磷酸緩沖液替換α -葡萄糖苷酶測定的吸光度；

A2——磷酸緩沖液替換牛蒡多糖測定的吸光度。

（5）體外膽酸鹽結合能力測定。參照于美匯等人[15]的方法，以甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉為標準品，測其于波長387 nm 處的吸光度，分別獲得標準曲線。再根據文獻報道的方法測定并計算牛蒡多糖對甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結合能力。

2 結果與分析

2.1 不同分子量牛蒡多糖的分布

不同分子量牛蒡多糖分布見圖1。

圖1 不同分子量牛蒡多糖分布

由圖1 可知，牛蒡多糖通過不同超濾膜分離后，分子量＜5 k 的牛蒡多糖占5.24%，5～8 k 占12.13%，而＞300 k 的占22.41%，顯著高于前者，但是與30～50 k 和50～300 k 的沒有差異；分子量大于30 k 的多糖占64.17%，表明牛蒡多糖主要由分子量大于30 k的多糖組成；試驗中同時發(fā)現不同分子量段的牛蒡多糖顏色也會有一定的差異，分子量越大，多糖粉末的顏色越深。

2.2 牛蒡多糖生物活性研究結果

2.2.1 牛蒡多糖的抗氧化活性

（1）DPPH·清除能力

清除DPPH 自由基的效果見圖2。

圖2 清除DPPH 自由基的效果

由圖2 可知，不同分子量段的牛蒡多糖為0.5～1.0 mg/mL 時，清除DPPH·能力隨多糖質量濃度的升高而升高，與喻俊等人[16]的研究結果相似，表明牛蒡多糖具有較好的DPPH·清除能力。根據回歸曲線計算其IC50值，其中＜5 k 組分的為0.99 mg/mL，5～8 k組分的為0.82 mg/mL，8～30 k 組分的為0.96 mg/mL，30～50 k 組分的IC50值為0.95 mg/mL，而50～300 k 和＞300 k 的組分在試驗溶度范圍內無法計算其IC50值，但其在質量濃度為1 mg/mL 時，清除率僅有40.18%和36.90%，表明分子量為5～8 k 的牛蒡多糖對DPPH·的清除率效果最好。

（2）·O2-清除能力

清除羥自由基的效果見圖3。

圖3 清除羥自由基的效果

考查樣品對·O2-的清除能力時體現樣品抗氧化活性的重要指標，由圖3 可知，在1.0～1.8 mg/mL 質量濃度范圍內，不同分子量段的牛蒡多糖對·O2-的清除率隨牛蒡多糖質量濃度的升高而升高，并表現出較好的量效關系，結果與周濃等人[17]的報道相似。通過計算其IC50值表明，＜5 k 組分的為1.45 mg/mL，5～8 k 組分的為1.31 mg/mL，8～30 k 和30～50 k 組分的均為1.40 mg/mL，50～300 k 組分的為1.14 mg/mL，＞300 k 組分的為1.51 mg/mL，提示50～300 k 的牛蒡多糖對·O2-的清除效果最好，而＞300k 的最差。

2.2.2 牛蒡多糖降血糖活性研究

（1）α -淀粉酶的抑制效果。

抑制α -淀粉酶的效果見圖4。

圖4 抑制α -淀粉酶的效果

對α -淀粉酶的抑制能有效阻礙食品中糖類的水解、消化，從而減少機體對糖分的攝取，從而降低血糖水平[18]。由圖4 可知，在0.1～0.5 mg/mL 質量濃度范圍內，對α -淀粉酶的抑制率隨牛蒡多糖質量濃度的升高而升高，并呈現出良好的量劑關系，說明各組分都具有較好的α -淀粉酶抑制活性。通過計算其IC50值，＜5 k 組分的為0.28 mg/mL，5～8 k和8～30 k 組分的都為0.26 mg/mL，30～50 k 組分的為0.33 mg/mL，50～300 k 組分的為0.30 mg/mL，＞300 k 組分的為0.42 mg/mL，表明5～8 k 和8～30 k的牛蒡多糖抑制α -淀粉酶的效果最好，而＞300 k的最差。

（2）α -葡萄糖苷酶的抑制效果。

抑制α -葡萄糖苷酶的效果見圖5。

圖5 抑制α -葡萄糖苷酶的效果

抑制α -葡萄糖苷酶的活性可以減緩葡萄糖的生成和吸收，調整血糖水平，減少高血糖對胰腺的刺激，有效預防和改善糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[19]。由圖5 可知，不同分子量段的牛蒡多糖在0.1～0.5 mg/mL質量濃度范圍內，對α -葡萄糖苷酶的抑制率隨牛蒡多糖質量濃度的升高而升高，表現出較好的抑制效果和量效關系。計算其IC50值表明，＜5 k 組分的為0.31 mg/mL，8～30 k 組分的為0.29 mg/mL，5～8 k和50～300 k 組分的都為0.25 mg/mL，30～50 k 組分的為0.32 mg/mL，＞300 k 組分的為0.36 mg/mL，可知5～8 k 和50～300 k 的牛蒡多糖抑制α -葡萄糖苷酶的抑制效果最好，而＞300 k 的最差。

2.2.3 牛蒡多糖降血脂活性研究結果

（1）結合甘氨膽酸鈉能力。

結合甘氨膽酸鈉的效果見圖6。

圖6 結合甘氨膽酸鈉的效果

由圖6 可知，不同分子量段的牛蒡多糖對甘氨膽酸鈉的結合率隨牛蒡多糖質量濃度的升高而升高，且呈較好的量效關系。從各組分的IC50值來看，＜5 k組分的為4.91 mg/mL，5～8 k 組分的為3.83 mg/mL，而其中組分在質量濃度為5 mg/mL 時，結合率都小于50%，無法計算其IC50值。相對而言，分子量為5～8 k 的牛蒡多糖結合甘氨膽酸鈉的能力較好。

（2）結合牛磺膽酸鈉能力。

結合牛磺膽酸鈉的效果見圖7。

圖7 結合牛磺膽酸鈉的效果

由圖7 可知，不同分子量段的牛蒡多糖對牛磺膽酸鈉的結合率隨牛蒡多糖質量濃度的升高而升高，表明各組分均有一定的牛磺膽酸鈉結合能力，并與質量濃度呈正相關。從各組分的IC50值來看，5～8 k 組分的為3.23 mg/mL，＞300 k 組分的為4.53 mg/mL，其中組分在試驗最高質量濃度下結合率都小于50%，說明5～8 k 的牛蒡多糖對牛磺膽酸鈉的結合效果較好。

3 結論

試驗將牛蒡使用熱水浸提法制備、醇沉后，采用不同分子量的超濾膜分離，獲得分子量＜5，5～8，8～30，30～50，50～300，＞300 k 的6 個牛蒡多糖組分。結果表明，表明牛蒡多糖主要由分子量大于30 k的多糖組成，分子量小于8 k 的占比較少。生物活性分析表明，不同組分牛蒡多糖都表現出一定的生物活性，其中5～8 k 的牛蒡多糖對DPPH·和·O2-的清除能力，抑制α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶，結合甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉能力較好，提示5～8 k 的牛蒡多糖具有最好的抗氧化、降血糖和降血脂活性，進一步開發(fā)利用的價值較大。不同分子量牛蒡多糖在生物活性上的差異，可能與其結構、含量、化學組成等有關，可對多糖的結構、組成與多糖生物活性的關系進行進一步探討。