清胰湯對(duì)肝缺血再灌注損傷小鼠的肝臟保護(hù)作用及鐵死亡機(jī)制研究?

周 楨 凌琪華 王 倩 方 榮

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

膿毒癥多臟器功能障礙是膿毒癥致死的首要原因［1］，其中，肝臟由于同時(shí)擁有肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈的雙重血供結(jié)構(gòu)，往往高度暴露于以腸源性微生物為主的各種病原體之中，使急性肝損傷成為膿毒癥常見(jiàn)并發(fā)癥［2］。相比其他易損臟器，肝臟作為抵御全身炎癥反應(yīng)的重要免疫器官，肝損傷將進(jìn)一步加劇炎癥因子風(fēng)暴［3］，是影響膿毒癥預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［4］，并發(fā)急性肝損傷的膿毒癥患者病死率甚至超過(guò)50%［5］，已被臨床獨(dú)立命名為“膿毒癥相關(guān)肝損傷”（SALD）。有學(xué)者提出，探索肝臟在膿毒癥中的作用或?qū)⒋龠M(jìn)新的膿毒癥治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略發(fā)展［6］。與傳染性肝炎不同，SALD 并不常由膿毒癥病原微生物直接刺激所致，而是以缺血性肝炎為主要病理表現(xiàn)［7］。其發(fā)生肝損傷的機(jī)制包括炎癥因子風(fēng)暴引起的廣泛血管滲漏、局部組織酸中毒以及微循環(huán)血栓形成所導(dǎo)致的肝臟動(dòng)靜脈血流壓力降低、肝組織氧利用率下降以及肝臟毛細(xì)血管缺血等，最終造成肝臟血流灌注損害［8］。因此，肝缺血再灌注損傷是SALD 的核心病理生理基礎(chǔ)。

清胰湯是筆者主治腑實(shí)熱結(jié)型腹痛之經(jīng)驗(yàn)方，配伍思路旨在針對(duì)實(shí)邪直入或傳至下焦，化為濕熱，邪毒壅阻而發(fā)為腹痛的病證，對(duì)于急性胰腺炎療效確切［9］。而肝臟同處下焦，易受濕熱實(shí)邪之困，我們以此為異病同治理論基礎(chǔ)，嘗試將清胰湯運(yùn)用于SALD患者，亦初步發(fā)現(xiàn)其臨床療效［10］。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究清胰湯對(duì)肝缺血再灌注損傷小鼠的肝臟保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制，為豐富清胰湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，8～10 周齡，體質(zhì)量約20 g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。所有小鼠均經(jīng)過(guò)7 d 的適應(yīng)性飼養(yǎng)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

1.2 藥物制備

清胰湯浸膏劑委托曙光醫(yī)院藥劑科配置完成。組方：大黃9 g，枳實(shí)6 g，牡丹皮6 g，冬瓜子15 g，蘇敗醬15 g，柴胡12 g，郁金10 g，甘草6 g。將全方加10 倍量水，煎煮2 次，每次30 min，過(guò)濾后合并濾液，離心后取上清液，濃縮至1.3 g 生藥/g 浸膏，4 ℃冰箱保存。

1.3 試劑與儀器

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）ELISA 試劑盒（YMS2871-A），谷草轉(zhuǎn)氨酶（ACT）ELISA 試劑盒（EM30567S）購(gòu)自上海奧威生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（G1121）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；冰凍切片活性氧檢測(cè)試劑盒（DHE 探針）（HR8685）購(gòu)自上海穩(wěn)承生物技術(shù)有限公司；鐵含量檢測(cè)試劑盒（MAK025）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（S0131S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GPX4（ab125066）、GAPDH（ab9485）抗體（來(lái)源兔）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；免疫組化試劑盒（D601037-0020）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、凝膠成像儀、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），酶標(biāo)系統(tǒng)多功能儀（上海百基生物）。

1.4 分組與給藥

30 只小鼠以耳標(biāo)法隨機(jī)分為5 組：假手術(shù)組、模型組及清胰湯高、中、低劑量組，每組6 只。清胰湯低、中、高劑量組分別按成人劑量8、16、32 倍給藥，每組小鼠按1.5 mL/100 g 體質(zhì)量進(jìn)行灌胃，每日2 次，在IRI 模型造模前預(yù)處理7 d。假手術(shù)組及模型組同時(shí)灌胃等體積生理鹽水。

1.5 模型制備

造模前禁食不禁飲12 h，異氟烷麻醉后仰臥固定于小動(dòng)物加熱墊上，逐層打開(kāi)腹腔，充分暴露肝臟區(qū)，鈍性分離肝左葉和中葉的門(mén)靜脈及肝動(dòng)脈，并用血管夾夾閉，以阻斷肝臟左葉和中葉的血流，使70%肝臟缺血，當(dāng)被夾閉的肝臟組織部分顏色變淺時(shí)即肝血管阻斷成功。血流阻斷60 min 后，松開(kāi)血管夾，肝葉逐漸恢復(fù)供血，由白轉(zhuǎn)紅表明再灌注成功，逐層縫合關(guān)閉腹腔，再灌注12 h。假手術(shù)組僅開(kāi)腹鈍性分離血管，不進(jìn)行缺血再灌注處理。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

各組小鼠于造模結(jié)束后在異氟烷麻醉狀態(tài)下經(jīng)眼眶取血約300 μL，血液于室溫靜置1 h 后離心（6 000 r/min，10 min），取上清液待測(cè)。取血后斷頸處死，用剪刀快速暴露胸腹腔后以生理鹽水從右心房灌注，清洗臟器內(nèi)殘留血液，直至肝臟變?yōu)橥咙S色，剪取肝左葉及肝中葉，其中肝左葉剪成兩塊，盡量保持邊緣整齊，用于肝臟冰凍及石蠟病理切片的制備；肝中葉剪成數(shù)個(gè)體積相近的小碎塊后以液氮迅速冷卻，-80℃冰箱保存。

1.6.1 血清ALT、AST 水平 采用ELISA 法，取各組小鼠血清，根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并在各組樣本中加入工作液，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量各組OD 值。

1.6.2 肝組織缺血形態(tài)學(xué) 采用HE 染色法，取各組小鼠肝臟石蠟切片，依次經(jīng)脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、脫水、DAPI 封片，顯微鏡下觀察并拍片。

1.6.3 肝細(xì)胞活性氧水平 采用DHE 熒光探針技術(shù)，取各組小鼠肝臟冰凍切片，根據(jù)活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將清洗液、染色液稀釋至工作濃度，依次將切片清洗、染色，避光孵育30 min 后，用熒光顯微鏡觀察并拍片。

1.6.4 Fe2+含量 取各組小鼠肝組織0.05 g，加入冰PBS 0.5 mL 研磨成組織勻漿，低溫離心取上清至新EP管。根據(jù)鐵含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并加入工作液，37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀在593 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量各組OD 值。

1.6.5 脂質(zhì)過(guò)氧化水平 取各組小鼠肝組織0.05 g，加入蛋白裂解液0.5 mL 研磨成組織勻漿，低溫離心取上清至新EP 管。根據(jù)MDA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并配置工作液，在各組樣本中加樣后沸水加熱15 min，冷卻至室溫后離心，取上清液用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量各組OD 值。

1.6.6 GPX4 表達(dá) 1）采用Western blotting 法，取各組小鼠肝組織0.05 g，加入蛋白裂解液0.5 mL 研磨成組織勻漿，低溫離心取上清至新EP 管。BCA 蛋白定量，加入5xloading buffer，100 ℃煮沸，配置12% SDSPAGE，取50 μg蛋白加入孔中電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用5%脫脂奶粉封閉1 h。移入GPX4（1∶1 000）、GAPDH（1∶8 000）孵育盒中4 ℃過(guò)夜。次日，用0.05%Tween20 的PBST 沖洗PVDF 膜，加入二抗，再經(jīng)室溫孵育2 h，PBST 沖洗3 次，GPX4、GAPDH 蛋白表達(dá)水平經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。2）采用免疫組化染色法，取各組小鼠肝臟石蠟切片，脫蠟復(fù)水，滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，經(jīng)胰酶修復(fù)后，以4%BSA/PBS 室溫封閉1 h。移入一抗GPX4（1∶250）孵育盒中4℃過(guò)夜。次日PBS 清洗4 次，移入二抗（來(lái)源兔，1∶200）孵育盒孵育1 h，PBS 清洗5 次。滴加DAB顯色劑，以顯出陽(yáng)性且背景色不深為宜。再將切片經(jīng)IHC 專(zhuān)用蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，2%氨水返藍(lán)后脫水透明，封片后顯微鏡下觀察并拍片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用Prism 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以（±s）表示，其中WB 條帶的灰度值采用ImageJ 分析量化數(shù)據(jù)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.000 1 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清肝酶指標(biāo)比較

見(jiàn)表1。各組小鼠血清ALT 指標(biāo)方面：與假手術(shù)組相比，模型組指標(biāo)顯著升高（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中劑量組有所下降（P＜0.05），而高劑量組則顯著下降（P＜0.000 1）。各組小鼠血清AST 指標(biāo)方面：與假手術(shù)組相比，模型組顯著升高（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組指標(biāo)有所下降（P＜0.05），而中、高劑量組則顯著下降（P＜0.000 1）；與中劑量組相比，高劑量組降低更為明顯（P＜0.000 1）。

表1 各組小鼠肝酶指標(biāo)比較（U/L，±s）

表1 各組小鼠肝酶指標(biāo)比較（U/L，±s）

注：與模型組比較，?P ＜0.05，??P ＜0.000 1；與清胰湯低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.000 1；與中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.000 1。下同。

AST 84.08±2.296**1 255±130.8 909.3±48.12*427.9±26.62**222.0±17.99**△△組 別假手術(shù)組模型組清胰湯低劑量組清胰湯中劑量組清胰湯高劑量組n6 6 6 6 6 ALT 38.76±3.80**2 535±256.9 2 127±87.43 1 560±79.47*488.5±41.93**

2.2 各組小鼠肝臟組織缺血情況比較

見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠肝臟組織出現(xiàn)大面積缺血灶，肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變形、壞死，而各清胰湯組肝臟缺血面積明顯減少，肝細(xì)胞腫脹、變形、壞死減少，并呈劑量依賴(lài)性。

圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)比較（HE染色）

2.3 各組小鼠肝細(xì)胞ROS 表達(dá)比較

見(jiàn)圖2。以DHE 熒光探針觀察各組小鼠肝組織細(xì)胞層面的ROS 表達(dá)情況（紅色熒光），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組肝細(xì)胞ROS 水平增高，而各清胰湯組ROS 水平降低，且隨劑量上升逐漸下降。

圖2 各組小鼠肝組織細(xì)胞ROS表達(dá)（DHE熒光探針）

2.4 各組小鼠肝臟組織鐵離子含量及MDA 水平比較

見(jiàn)表2。各組小鼠肝臟組織Fe2+變化方面：與假手術(shù)組相比，模型組含量顯著上升（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中劑量組含量有所下降（P＜0.05），而高劑量組則顯著下降（P＜0.000 1）。各組小鼠肝臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平方面：與假手術(shù)組相比，模型組MDA 水平顯著上升（P＜0.000 1）；與模型組相比，清胰湯低劑量組MDA 水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），中劑量組有所下降（P＜0.05），而高劑量組則呈顯著下降（P＜0.000 1）。

表2 各組小鼠肝臟組織亞鐵離子含量、MDA水平及GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組小鼠肝臟組織亞鐵離子含量、MDA水平及GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別假手術(shù)組模型組清胰湯低劑量組清胰湯中劑量組清胰湯高劑量組n6 6 6 6 6 Fe2+（μmol/g）4.87±0.44**15.21±1.13 15.46±0.73 10.82±0.84*6.98±0.53**MDA（μmol/g）2.65±0.35**10.86±0.67 8.95±0.55 7.90±0.43*5.57±0.52**GPX4 0.871±0.220*0.081±0.006 0.099±0.022 0.183±0.021*0.358±0.059*△

2.5 各組小鼠肝臟組織GPX4 表達(dá)比較

見(jiàn)表2、圖3 及圖4。各組小鼠肝臟組織GPX4 表達(dá)方面：與假手術(shù)組相比，模型組蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，清胰湯低劑量組蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而中、高劑量組有所上升（P＜0.05），與中劑量組相比，高劑量組上升幅度更多（P＜0.05）。進(jìn)一步以免疫組化染色觀察GPX4 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組GPX4 表達(dá)明顯減少，而各清胰湯組表達(dá)逐漸上升，且呈劑量依賴(lài)性。

圖3 各組小鼠肝臟組織GPX4蛋白表達(dá)

圖4 各組小鼠肝臟組織GPX4表達(dá)（免疫組化染色）

3 討 論

機(jī)體對(duì)細(xì)菌病毒的清除都應(yīng)以正常的肝功能為基礎(chǔ)，當(dāng)膿毒癥并發(fā)急性肝損傷時(shí)容易進(jìn)一步誘發(fā)其他的感染并發(fā)癥，如何防治SALD 的發(fā)生發(fā)展是改善膿毒癥患者預(yù)后所亟須解決的臨床問(wèn)題［11］。

膿毒癥屬中醫(yī)學(xué)“溫病”范疇，根據(jù)溫病衛(wèi)氣營(yíng)血辨證理論，膿毒癥并發(fā)臟器功能障礙已進(jìn)入血分證病機(jī)階段［12］，以熱入血分，邪熱蒸騰，耗傷營(yíng)血，血熱相搏，甚則動(dòng)血耗血為特點(diǎn)。而肝主藏血，體陰用陽(yáng)，當(dāng)邪毒內(nèi)陷導(dǎo)致?tīng)I(yíng)血虧耗時(shí)，肝臟無(wú)法藏血，則肝陰不能制陽(yáng)而迫血妄行，加之肝主疏泄，主升主動(dòng)，肝藏血失司亦影響氣機(jī)調(diào)暢，氣機(jī)逆亂，則血隨氣逆，動(dòng)血?jiǎng)语L(fēng)，促使血分證的進(jìn)一步加重［13］，因此，該病機(jī)階段與肝之藏象關(guān)系密切。我們臨證發(fā)現(xiàn)，SALD患者大都可歸屬于“溫病，血分證”辨證類(lèi)型，中醫(yī)治療應(yīng)泄熱涼血、驅(qū)邪外出，同時(shí)配合疏肝養(yǎng)血，以期及時(shí)截?cái)嘌肿C向營(yíng)血耗竭、氣隨血脫階段發(fā)展。前期研究表明，清胰湯臨床能夠降低SALD 患者總膽紅素水平并減輕膿毒癥病情嚴(yán)重程度［10］，但具體作用機(jī)制尚未闡明。

與肝移植術(shù)后主要影響肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的冷型缺血再灌注損傷不同，SALD 缺血性肝炎通常為影響肝細(xì)胞的熱型缺血再灌注損傷［14］，以肝細(xì)胞線(xiàn)粒體活性氧（ROS）過(guò)度蓄積為特征［15］。本實(shí)驗(yàn)以?shī)A閉小鼠肝左葉及肝中葉動(dòng)靜脈血流缺血60 min，再灌注12 h的方法構(gòu)建70%肝臟缺血再灌注損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝酶指標(biāo)顯著上升，肝組織出現(xiàn)大范圍缺血灶，肝細(xì)胞發(fā)生腫脹、變形及壞死，肝細(xì)胞ROS水平明顯增高，均符合SALD 病理特征；而清胰湯中、高劑量組小鼠的肝功能指標(biāo)改善，肝組織缺血壞死減少，肝細(xì)胞ROS 水平降低，表明清胰湯可靶向作用于肝臟；中、高劑量均可減輕肝臟氧化應(yīng)激，對(duì)肝缺血再灌注損傷的肝臟具有保護(hù)作用，且高劑量清胰湯作用優(yōu)于中劑量清胰湯，呈劑量依賴(lài)性。

鐵死亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴(lài)性氧化應(yīng)激程序性細(xì)胞死亡形式［16］，線(xiàn)粒體ROS 為其公認(rèn)的誘導(dǎo)信號(hào)之一［17］，最終由不受控的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)驅(qū)動(dòng)［18］，已被證實(shí)與肝缺血再灌注損傷密切有關(guān)［19］。鑒于SALD 是以肝線(xiàn)粒體ROS 所介導(dǎo)的肝缺血再灌注損傷為病理生理基礎(chǔ)，鐵死亡或是該病發(fā)生發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)。在缺血再灌注損傷環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)典抗氧化通路xCT-GSH-GPX4 軸發(fā)揮其拮抗作用，但過(guò)度持續(xù)的線(xiàn)粒體ROS 將誘導(dǎo)GSH 耗竭，使GPX4 失活，拮抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用逐漸減弱，是引發(fā)鐵死亡的經(jīng)典效應(yīng)途徑［18］。本實(shí)驗(yàn)將GPX4 作為反映鐵死亡程度的相關(guān)標(biāo)志物，GPX4 活性越高代表鐵死亡程度越低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織亞鐵離子含量、脂質(zhì)過(guò)氧化水平明顯上升以及GPX4 表達(dá)明顯下降，提示鐵死亡密切參與肝缺血再灌注損傷的過(guò)程，而清胰湯中、高劑量組小鼠肝組織的亞鐵離子含量、脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低，GPX4 活性恢復(fù)，表明中、高劑量清胰湯均能減輕肝缺血再灌注損傷介導(dǎo)的鐵死亡，且高劑量清胰湯作用優(yōu)于中劑量清胰湯，呈劑量依賴(lài)性。

綜上所述，中、高劑量清胰湯均可體內(nèi)減輕模型小鼠的肝臟氧化應(yīng)激水平，減少肝缺血壞死，改善肝功能，對(duì)于肝缺血再灌注損傷的肝臟具有保護(hù)作用，其潛在機(jī)制可能與干預(yù)肝鐵死亡的發(fā)生有關(guān)，且其作用呈劑量依賴(lài)性。結(jié)合前期臨床研究結(jié)果，提示清胰湯或通過(guò)干預(yù)肝鐵死亡的發(fā)生改善肝缺血再灌注損傷，從而發(fā)揮抗SALD 的療效作用，這為進(jìn)一步拓展清胰湯的臨床應(yīng)用提供了部分科學(xué)依據(jù)。