低氧對(duì)炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制

李 磊 ，王一范2，施強(qiáng)慧，鐘華建，曹佳實(shí)

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬衢州醫(yī)院（衢州市人民醫(yī)院）骨科，衢州 324000

2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院健康管理科，上海 200003

3.中國(guó)人民解放軍63680 部隊(duì)醫(yī)院骨科，江陰 214400

4.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院骨科，上海 200003

5.海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍特色醫(yī)學(xué)中心，上海 200433

椎間盤是脊柱內(nèi)包含髓核、纖維環(huán)及軟骨終板的“三明治”結(jié)構(gòu)，與相鄰椎體組成脊柱運(yùn)動(dòng)單元，在維持脊柱穩(wěn)定性及活動(dòng)度中發(fā)揮重要作用［1］。椎間盤退行性變表現(xiàn)為炎性反應(yīng)，髓核細(xì)胞凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，神經(jīng)、血管長(zhǎng)入椎間盤等，其中炎性反應(yīng)尤為重要［2-3］。退行性變?cè)缙?，炎性反?yīng)由髓核組織中的髓核細(xì)胞或免疫細(xì)胞引發(fā)，通過增加促炎因子分泌誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解等，加劇椎間盤退行性變進(jìn)程；退行性變晚期血管長(zhǎng)入椎間盤，循環(huán)血液中免疫細(xì)胞被募集至椎間盤，進(jìn)一步加劇炎性反應(yīng)［4］。

椎間盤是人體內(nèi)最大的無血管區(qū)域，其氧氣供應(yīng)依賴于附著在軟骨終板和纖維環(huán)外層的毛細(xì)血管網(wǎng)，循環(huán)血液攜帶的氧分子通過毛細(xì)血管網(wǎng)經(jīng)椎體終板的滲透作用運(yùn)輸至椎間盤［5］，導(dǎo)致椎間盤內(nèi)（尤其髓核區(qū)域）形成生理性低氧環(huán)境。當(dāng)椎間盤發(fā)生退行性變時(shí)，軟骨終板鈣化進(jìn)一步削弱髓核區(qū)域的氧供［6］，同時(shí)，低氧可誘導(dǎo)附著在纖維環(huán)外圍的毛細(xì)血管向椎間盤內(nèi)部生長(zhǎng)，當(dāng)血管穿透纖維環(huán)蔓延至髓核區(qū)域時(shí)，循環(huán)血液中的氧分子可直接進(jìn)入椎間盤內(nèi)部，影響低氧環(huán)境，該階段患者通常會(huì)出現(xiàn)頸腰痛等臨床癥狀，提示椎間盤退行性變發(fā)展至病程晚期［7］。因此，椎間盤內(nèi)部髓核組織從健康到退行性變中晚期均處于低氧環(huán)境，為進(jìn)一步探究椎間盤退行性變的生物學(xué)過程，須明確低氧與炎性反應(yīng)的相互作用及對(duì)髓核細(xì)胞的影響。NLRP3 炎性小體是目前已知炎性小體中研究最為透徹的一種，對(duì)炎性反應(yīng)啟動(dòng)具有重要作用，其對(duì)椎間盤退行性變的促進(jìn)作用已基本明確［8］。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)大鼠原代髓核細(xì)胞施加低氧和炎性刺激雙重干預(yù)，觀察髓核細(xì)胞凋亡及NLRP3 炎性小體改變，為闡明低氧對(duì)炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞的影響及作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

NLRP3 抗體（ab270449）、促炎因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）抗體（ab254360）、Caspase-1 抗體（ab207802）、Caspase-3 抗體（ab13585）、BAX 抗體（ab32503）、Bcl-2 抗體（ab182858）均購(gòu)自Abcam公司；IL-1β 購(gòu)自Peprotech 公司，NLRP3 炎性小體激活劑QS-21（HY-101092）購(gòu)自MedChemExpress公司；大鼠IL-1β ELISA 試劑盒（ab235646）、大鼠IL-18 ELISA 試劑盒（ab213909）購(gòu)自Abcam 公司，大鼠IL-8 ELISA 試劑盒（ml037351）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，Annexin V FITC/PI 流式凋亡試劑盒（APCC101）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（RR820A）及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）購(gòu)自TaKaRa 公司，TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。CCK-8 試劑盒（CK04）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 髓核細(xì)胞分離和培養(yǎng)

采用大鼠原代髓核細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，髓核細(xì)胞提取參照Risbud 等［9］的方法。經(jīng)分離、消化后獲得的髓核細(xì)胞采用含10%胎牛血清（Gibco 公司）的DMEM 高糖培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液并均勻鋪在T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 ～ 96 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，之后每3 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%匯合時(shí)進(jìn)行鋪板、傳代或凍存，取2 ～ 3 代的髓核細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞干預(yù)

①采用MIC101低氧密閉小室（Billups-Rothenberg公司）進(jìn)行低氧干預(yù)，將髓核細(xì)胞置于小室中并關(guān)閉小室，留有進(jìn)、出氣管道，將三元?dú)猓?%氧氣、5%二氧化碳和94%氮?dú)猓┙?jīng)進(jìn)氣孔輸注到低氧小室，5 min后，待小室內(nèi)空氣全部被三元?dú)庵脫Q后關(guān)閉小室進(jìn)、出氣管道，使小室內(nèi)維持密閉狀態(tài)，干預(yù)24 ～72 h。干預(yù)結(jié)束后，采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性，采用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。②采用25 ng/mL 的促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）干預(yù)髓核細(xì)胞模擬椎間盤退行性變時(shí)髓核細(xì)胞所處的炎性環(huán)境，同時(shí)施加低氧或常氧干預(yù)24 ～ 72 h，采用上述相應(yīng)方法檢測(cè)髓核細(xì)胞活性及凋亡水平。③采用TNF-α 聯(lián)合低氧或常氧干預(yù)髓核細(xì)胞48 h，以低氧或常氧干預(yù)48 h 的髓核細(xì)胞作為對(duì)照，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)髓核細(xì)胞內(nèi)炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-8、IL-18 mRNA 表達(dá)水平，通過ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清中炎性細(xì)胞因子含量，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NLRP3 炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平。④采用NLRP3 炎性小體激動(dòng)劑QS-21 刺激炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞，并置于常氧或低氧條件下干預(yù)48 h，通過流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.4 檢測(cè)方法

①蛋白質(zhì)印跡法：預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌髓核細(xì)胞2 遍，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上反應(yīng)10 min 后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞及細(xì)胞裂解液，離心取上清，即得蛋白液；取部分蛋白液經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度；剩余蛋白液加入上樣緩沖液，95℃加熱5 min；根據(jù)蛋白濃度計(jì)算各組蛋白上樣體積，根據(jù)目的蛋白分子量配制相應(yīng)濃度SDS-PAGE膠，進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗、二抗，ECL 顯影后觀察，通過條帶灰度值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用總RNA 提取試劑盒（DP419，Tiangen 公司）提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度后取2 μg RNA 添加到反轉(zhuǎn)錄體系中合成樣本cDNA。隨后配制20 μL 的反應(yīng)體系，包含cDNA 模板、目的基因特異性PCR 引物、滅菌水和TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（RR820A）。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 10 s、72℃ 25 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。③CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL和ELISA：根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，采用 Studentt檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行比較；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 低氧對(duì)正常環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡無顯著影響

與常氧組相比，低氧組髓核細(xì)胞在干預(yù)24 ～ 72 h后活性無明顯變化（圖1a）。隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，常氧組和低氧組髓核細(xì)胞凋亡率逐漸增加，72 h 時(shí)凋亡細(xì)胞比例與24 h 相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖1b、c）；細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3 和BAX 表達(dá)水平逐步升高、Bcl2 表達(dá)水平逐步降低，48 h、72 h 時(shí)與24 h 相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖1d、e）；TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞占比逐漸增加，72 h 時(shí)與24 h 時(shí)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖1f、g）。值得注意的是，各時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)常氧組和低氧組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），說明正常環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡與氧濃度無關(guān)，即低氧對(duì)正常髓核細(xì)胞凋亡無明顯影響。

圖1 低氧對(duì)正常環(huán)境中髓核細(xì)胞凋亡影響Fig. 1 Effect of hypoxia on nucleus pulposus cell apoptosis in normal condition

2.2 低氧抑制炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡

隨著炎性刺激時(shí)間延長(zhǎng)，常氧組髓核細(xì)胞活性降低（圖2a），凋亡比例增加（圖2b、c），凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3 和BAX 表達(dá)水平升高、Bcl2表達(dá)水平降低（圖2d、e），TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞占比增加（圖2f、g），48 h、72 h 時(shí)與24 h 時(shí)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。低氧組髓核細(xì)胞上述指標(biāo)隨炎性刺激時(shí)間變化不明顯。與常氧組相比，各時(shí)間點(diǎn)低氧組髓核細(xì)胞活性高，凋亡比例低，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3 和BAX 表達(dá)水平低，Bcl2 表達(dá)水平高，TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞占比少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），說明低氧對(duì)炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

圖2 低氧對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡影響Fig. 2 Effect of hypoxia on nucleus pulposus cell apoptosis in inflammatory environment induced by TNF-α

2.3 低氧抑制炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞內(nèi)NLRP3 炎性小體激活

未施加炎性刺激的低氧和常氧組髓核細(xì)胞表達(dá)及分泌的炎性細(xì)胞因子均處于低水平，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；TNF-α刺激48 h 后，常氧組髓核細(xì)胞表達(dá)及分泌的IL-1β、IL-8、IL-18 均升高，而低氧組髓核細(xì)胞仍處于較低水平（圖3a ～ f），說明炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)激活，而低氧對(duì)該激活過程具有阻礙作用。通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NLRP3 炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達(dá)增加，而低氧干預(yù)能夠削弱炎性環(huán)境所誘發(fā)的NLRP3 炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)（圖3g、h），提示低氧可抑制炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體激活。

圖3 低氧對(duì)炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞內(nèi)NLRP3 炎性小體激活的影響Fig. 3 Effect of hypoxia on NLRP3 inflammasome activation of nucleus pulposus cell in inflammatory environment

2.4 低氧通過NLRP3 炎性小體抑制炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡

在炎性環(huán)境下，使用NLRP3 炎性小體激動(dòng)劑QS-21激活NLRP3炎性小體后，常氧組髓核細(xì)胞凋亡比例無明顯變化，而低氧組髓核細(xì)胞細(xì)胞凋亡比例增加（P＜ 0.05，圖4a、b）；常氧組Cleaved caspase-3和BAX 蛋白表達(dá)無明顯變化、Bcl2 蛋白表達(dá)降低，而低氧組Cleaved caspase-3 和BAX 蛋白表達(dá)升高、Bcl2 蛋白表達(dá)降低（圖4c、d）；常氧組TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞占比無明顯變化，而低氧組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞占比增高（圖4e、f）。以上結(jié)果說明NLRP3炎性小體激活能夠削弱低氧對(duì)炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡的抑制作用，提示NLRP3 炎性小體在低氧調(diào)控炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

3 討 論

氧氣是真核細(xì)胞通過氧化磷酸化產(chǎn)生足量ATP，維持細(xì)胞活性的重要物質(zhì)［10］。由于椎間盤內(nèi)無血管生長(zhǎng)，髓核細(xì)胞處于生理性低氧環(huán)境，導(dǎo)致其主要通過無氧糖酵解獲取ATP［11］。低氧作為椎間盤內(nèi)最為重要的微環(huán)境特征，對(duì)髓核細(xì)胞具有多重影響，如Kim 等［12］發(fā)現(xiàn)低氧可通過調(diào)控髓核細(xì)胞自噬和凋亡維持細(xì)胞活性，Silagi 等［13］證實(shí)低氧可通過低氧誘導(dǎo)因子調(diào)控髓核細(xì)胞能量代謝、維持髓核細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)，Novais 等［14］發(fā)現(xiàn)低氧可調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，影響髓核細(xì)胞外基質(zhì)成分表達(dá)及分泌。以上研究體現(xiàn)低氧對(duì)髓核細(xì)胞的重要調(diào)控作用，但均是針對(duì)低氧開展的單因素研究。髓核組織微環(huán)境復(fù)雜多樣，單因素體外研究無法有效模擬疾病進(jìn)程，導(dǎo)致體外研究結(jié)果難以在體內(nèi)獲得進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，聯(lián)合多個(gè)因素，分析彼此相關(guān)性及對(duì)髓核細(xì)胞的影響是提升椎間盤退行性變體外研究可靠性的重要方法。截止目前，相應(yīng)研究報(bào)道較少，Wang等［15］通過低氧和血清剝奪2 種干預(yù)方式探索低氧和低營(yíng)養(yǎng)對(duì)髓核細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響及二者之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)低氧顯著緩解低營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)降解。低氧和低營(yíng)養(yǎng)均是椎間盤生理環(huán)境的重要特征，故該研究初步闡明正常椎間盤微環(huán)境相互作用及對(duì)髓核細(xì)胞的影響；而發(fā)生退行性變的椎間盤微環(huán)境相互作用的研究暫未見報(bào)道。

相較于正常椎間盤，發(fā)生退行性變的椎間盤微環(huán)境突出表現(xiàn)為炎性反應(yīng)和代謝廢物的積聚，導(dǎo)致髓核組織中炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8、前列腺素 E2（PGE2）等表達(dá)及分泌增加［16］。炎性反應(yīng)可能是引發(fā)椎間盤退行性變患者頸腰痛癥狀的關(guān)鍵因素，Pedersen 等［17］發(fā)現(xiàn)，腰椎椎間盤突出癥患者的腰痛癥狀與其血清內(nèi)IL-6 及IL-8 含量密切相關(guān)；Krock 等［18］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 可作為抗炎治療靶點(diǎn)用于緩解椎間盤退行性變患者頸腰痛癥狀。以上研究均說明炎性反應(yīng)對(duì)椎間盤退行性變影響重大，是椎間盤退行性變的重要病理反應(yīng)，而低氧是貫穿椎間盤生理到病理狀態(tài)的微環(huán)境特征。為探索低氧在發(fā)生退行性變的椎間盤內(nèi)的作用，本研究針對(duì)低氧和炎性反應(yīng)相互作用及對(duì)髓核細(xì)胞的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)正常髓核細(xì)胞活性無明顯影響，而對(duì)炎性刺激誘導(dǎo)發(fā)生退行性變的髓核細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng)，突顯低氧在發(fā)生退行性變的椎間盤內(nèi)的重要作用。

關(guān)于低氧與炎性反應(yīng)相互作用的研究在人體其他疾病中報(bào)道較多。有研究［19］發(fā)現(xiàn)，低氧可促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生，而炎性反應(yīng)進(jìn)一步加劇氧含量的丟失，二者呈相互促進(jìn)關(guān)系。然而，近期基于基因敲除小鼠的炎性腸病相關(guān)研究結(jié)果顯示，低氧有助于小鼠腸道黏膜炎性反應(yīng)的恢復(fù)［20-21］，提示低氧對(duì)炎性反應(yīng)具有雙重作用，可能受作用部位影響［22］。椎間盤發(fā)生退行性變時(shí)，低氧與炎性反應(yīng)同時(shí)存在，本研究基于大鼠髓核細(xì)胞開展體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)低氧可保護(hù)炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞免于凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)低氧通過抑制NLRP3 炎性小體激活而抑制髓核細(xì)胞凋亡。

炎性小體是細(xì)胞啟動(dòng)炎性反應(yīng)的發(fā)動(dòng)機(jī)，炎性小體的組裝或激活失調(diào)將導(dǎo)致人體多種疾病發(fā)生。目前研究較多的炎性小體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4 和AIM2，其中NLRP3 研究最為廣泛。NLRP3 與炎性反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)降解、髓核細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)，深刻影響椎間盤退行性變進(jìn)程［8］。此外，NLRP3 在其他疾病研究中被證實(shí)受低氧調(diào)控，Cosin-Roger 等［23］發(fā)現(xiàn)低氧通過抑制NLRP3 炎性小體及下游自噬活性緩解腸道炎性反應(yīng)，Yang等［24］發(fā)現(xiàn)低氧可促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞中NLRP3炎性小體激活，說明低氧對(duì)NLRP3 及炎性反應(yīng)的調(diào)控具有多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧對(duì)NLRP3 炎性小體激活具有抑制效應(yīng)，在調(diào)控炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡中作用顯著。值得一提的是，本研究使用QS-21激活炎性環(huán)境下低氧及常氧組髓核細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體活性后，僅促進(jìn)低氧組髓核細(xì)胞凋亡，而對(duì)常氧組髓核細(xì)胞凋亡無明顯影響。該結(jié)果提示，在炎性環(huán)境下，常氧組髓核細(xì)胞內(nèi)NLRP3 炎性小體活性足夠維持炎性反應(yīng)，QS-21 進(jìn)一步活化NLRP3炎性小體對(duì)炎性反應(yīng)影響甚微，因而髓核細(xì)胞凋亡無明顯變化；而低氧組髓核細(xì)胞因NLRP3 炎性小體活性受低氧抑制，炎性反應(yīng)啟動(dòng)受阻，QS-21 活化NLRP3 炎性小體后釋放炎性反應(yīng)活性，導(dǎo)致髓核細(xì)胞凋亡增加。

綜上，本研究通過體外研究，針對(duì)髓核組織特征性低氧和椎間盤退行性變時(shí)炎性反應(yīng)之間的相互作用及對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響展開探索，發(fā)現(xiàn)低氧可通過抑制NLRP3 炎性小體激活緩解炎性環(huán)境下髓核細(xì)胞凋亡，突顯低氧在椎間盤退行性變進(jìn)程中的保護(hù)作用。