小麥TaPOD 家族的全基因組鑒定及表達分析

琚吉浩 馬 超 王添寧 吳 毅 董 鐘 方美娥 陳鈺姝張 均,* 付國占,*

1 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南洛陽 471000; 2 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 河南洛陽 471000

過氧化物酶(Peroxidase, POD)是一種以過氧化氫為電子受體具有催化底物氧化的酶。其包含有兩類: 血紅素過氧化物酶(heme Peroxidase)和非血紅素過氧化物酶(nonheme Peroxidase); 血紅素過氧化物酶進一步可以分為動物過氧化物酶和非動物過氧化物酶, 而非動物過氧化物酶主要分為3 類, 分別稱為I 類過氧化物酶(Class I Prxs)、II 類過氧化物酶(Class II Prxs)、III 類過氧化物酶(Class III Prxs)[1], 它們所包含的種類以及主要存在的位置不同。I 類過氧化物酶主要是微生物中的過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶, II 類主要是真菌分泌性過氧化物酶[2]。III 類過氧化物酶主要是植物中的過氧化物酶, 又稱分泌性植物過氧化物酶[3]。

POD基因參與了植物廣泛的生理過程, 大量研究表明細胞生長和細胞壁松動、木質(zhì)化、生物以及非生物脅迫反應(yīng)、植物生長、成熟和衰老都與之密切相關(guān)[4]。該基因通過調(diào)控活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生在棉花纖維細胞的伸長過程中發(fā)揮重要的作用[5]。在擬南芥細胞損傷和正常生長過程中, 根的曲率伸長率會受到H2O2濃度的影響, 同時AtPRX有增強細胞壁限制細胞擴張的作用[6]。另外,POD家族基因與植物的生長發(fā)育關(guān)系密切。在一些單子葉植物中,POD基因可以參與調(diào)節(jié)H2O2水平來直接控制細胞壁的伸長過程, 因此POD基因參與調(diào)控了根系及幼苗葉片的生長[7]; 在雙子葉植物西葫蘆中, 過量表達APRX基因同樣可以產(chǎn)生更長的根和芽的表型[8]。植物細胞在生物以及非生物脅迫下會積累過量的活性氧(ROS)[9], 從而改變細胞組分, 導(dǎo)致細胞膜系統(tǒng)受到損傷[10], 最終使植物減產(chǎn)甚至死亡。然而, 植物體內(nèi)存在抗氧化酶系統(tǒng)可以清除ROS, 其中POD 在這一過程中起著關(guān)鍵作用[11]。有研究表明, 過量表達CrPRX基因可以提高煙草對鹽和干旱脅迫的耐受性[12], 在小麥中TaPRX-2A的過量表達也可以增強小麥對鹽脅迫的耐受性[13]。

小麥由于其具有較長的生育期而更容易受到不利環(huán)境的影響。隨著氣候的惡化和環(huán)境污染的加劇, 環(huán)境脅迫成為影響小麥生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要障礙[14]。特別是一些極端天氣的發(fā)生, 將嚴重影響小麥的產(chǎn)量。例如, 在小麥拔節(jié)到孕穗期遭遇倒春寒造成小麥的嚴重減產(chǎn)[15]; 在小麥揚花灌漿期受到干熱風(fēng)影響, 也會嚴重干擾小麥的各種生理功能, 導(dǎo)致顯著減產(chǎn)[16]。因此對于小麥的抗逆性和生長發(fā)育的研究顯得意義重大。多數(shù)研究證明, 提高植物的抗氧化物酶的活性對提高植物的抗逆性有一定作用[16]。而且POD基因廣泛存在于植物的整個生理過程中, 小麥的生長發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)和種子萌發(fā)都與之相關(guān)[17]。盡管POD基因家族在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中具有重要的作用, 但該家族在小麥中的家族成員還缺乏系統(tǒng)的鑒定和分析。本研究通過生物信息學(xué)分析的方法鑒定了659 個小麥TaPOD基因家族成員, 分析了其基因結(jié)構(gòu)、種內(nèi)共線性以及重復(fù)關(guān)系、進化關(guān)系、啟動子順式作用元件、基因表達模式等, 有助于進一步了解小麥中TaPOD家族的結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系, 為進一步推進小麥TaPOD家族成員應(yīng)用于提高小麥抗旱性進而增加小麥產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥TaPOD 家族的全基因組鑒定

從 EnsemblPlants 數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)獲取小麥氨基酸序列、小麥基因注釋文件(gff文件)、基因組核酸序列, 以擬南芥AtPOD 蛋白序列作為query 序列進行BLASTP 比對(E-value＜1e-5)獲得同源序列。在Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載TaPOD 保守結(jié)構(gòu)域(PF00141), 利用HMM3.0 (http://hmmer.org/)進行保守結(jié)構(gòu)域比對, 篩選出含有保守結(jié)構(gòu)域的小麥TaPOD 家族候選成員, 通過BLAST 和HMMER 共同選擇得到TaPOD 家族成員。使用在線工具ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)對TaPOD 蛋白進行等電點、分子量、親水性分析。

1.2 小麥TaPOD 基因系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

利用MEGA11[18]工具對TaPOD 蛋白序列進行多重比對, 同時利用該工具采用鄰接法(Neighbor-Jointing, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(bootstrap, 1000; motif, 10)。使用gff 基因注釋文件進行基因結(jié)構(gòu)分析。為鑒定TaPOD 蛋白motif,使用TaPOD 氨基酸序列, 在MEME[19]網(wǎng)站上進行分析,使用默認參數(shù), 鑒定5 個motif。利用Tbtools[20]軟件進行可視化分析。

1.3 小麥TaPOD 基因染色體定位和共線性分析

根據(jù)IWGSC (http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)小麥基因組的注釋文件數(shù)據(jù)獲得TaPOD基因在染色體上的物理位置。利用TBtools 構(gòu)建基因在染色體上的物理圖譜。利用MCScanX[21]進行共線性分析(E-value＜1e-5), Advance Circos 進行可視化分析。利用Tbtools 進行序列中未知堿基分布分析, 同時做可視化分析。

1.4 小麥TaPOD 基因家族Ka/Ks 分析

在EnsemblPlants 數(shù)據(jù)庫中獲取小麥的基因組, 使用MCScanX 軟件對TaPOD家族進行共線性分析, 選擇具有共線性的基因?qū)? 計算非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)的比值, 來推斷自然選擇壓力, 從而研究基因進化中的選擇壓力。若Ka/Ks比率大于1, 則認為該基因在進化過程中受到了正向選擇, 加快基因進化速度; 若Ka/Ks比率等于1, 則為中性選擇, 也就是自然選擇對其未產(chǎn)生顯著影響;Ka/Ks比率小于1, 則認為該基因經(jīng)過了純化選擇。

1.5 小麥TaPOD 基因的順式作用元件分析

截取小麥TaPOD基因CDS 上游2.0 kb 的DNA 序列,提交至PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)進行啟動子順式作用元件的預(yù)測。篩選出候選的結(jié)合元件進行可視化分析。

1.6 小麥TaPOD 基因在不同組織中的表達特性

為鑒定小麥TaPOD基因在不同組織中的表達特性,以普通小麥中國春作為試驗材料, 采集五葉期小麥的根系、葉片以及灌漿后15 d 的籽粒材料進行RNA-Seq, 由百邁客生物科技有限公司完成測序。根據(jù)TaPOD基因的FPKM 值繪制表達量熱圖。

1.7 小麥葉片總RNA 的提取、cDNA 的合成及RT-qPCR檢測

選用中國春小麥品種為試驗材料, 選擇籽粒大小一致的種子, 用蒸餾水沖洗后, 進行小型盆栽種植, 在室溫下待種子發(fā)芽后置于光照培養(yǎng)箱中, 在22℃、光照強度180 μmol m-2s-1、光/暗周期為16 h/8 h 的條件下培養(yǎng)。待其生長至二葉一心期時進行生長素(100 μmol L-1IAA)、赤霉素(100 μmol L-1GA)、脫落酸(100 μmol L-1ABA)、玉米素(100 μmol L-1ZT)、鹽脅迫(200 mmol L-1NaCl)、低溫(4 ℃)、高溫(38 ℃)、干旱(20% PEG-6000)處理, 以正常生長為對照。在處理后的12 h 取不同處理的葉片, 立即置于液氮保存。使用TRIZOL (TaKaRa, 9108Q)試劑提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA (PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time), RR047Q), 利用軟件Primer Premier 5 設(shè)計引物(表1), 用于之后的qPCR 分析。其中qPCR 反應(yīng)體系與程序參考ChamQ Universal SYBR qPCR masier Mix (Vazyme)試劑盒說明書, 采用2-ΔΔCt法計算相對表達量[22]。

表1 部分TaPOD 基因熒光定量所用的引物Table 1 Partial primers of TaPOD genes for RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaPOD 家族全基因組鑒定

根據(jù)擬南芥107 個TaPOD 的蛋白序列, 利用BLASTP得到500 個候選基因, 通過結(jié)構(gòu)域使用HMM 比對得到747 個候選基因, 合并去重后在小麥基因組數(shù)據(jù)庫中總共得到731 個TaPOD候選基因, 利用NCBI-CD 去除結(jié)構(gòu)域不完整的成員, 最終得到659 個TaPOD基因。根據(jù)蛋白序列編號從小到大原則, 將其重新命名為TaPOD1至TaPOD659。對其蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進行分析(附表1), 659個TaPOD基因的氨基酸數(shù)量為 206～518; 分子量為22.94～53.58 kD; 理論等電點為4.20～11.36, 其中有283 個蛋白理論等電點位于堿性位置, 1 個位于中性位置, 其他位于酸性位置; 不穩(wěn)定指數(shù)在18.69～82.99, 有398 個不穩(wěn)定指數(shù)小于40 的蛋白; 親水值在-0.52～0.30 之間, 其中有253 個親水蛋白, 其他為疏水蛋白。

2.2 小麥TaPOD 基因家族系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

基于進化關(guān)系,TaPOD家族可以分為7 組(I～VII) (圖2)。每組成員分布不均勻, 第IV 組成員數(shù)量最多, 第V 組成員數(shù)量最少。多數(shù)情況下, 聚在同一分組的TaPOD基因表現(xiàn)出相似的序列結(jié)構(gòu)。利用MEME motif 搜索工具, 鑒定出5 個相關(guān)的保守基序(圖1)。其中有537 個TaPOD基因包含5 個motif (圖3), 有122 個基因存在缺失, 缺少motif3 結(jié)構(gòu)的基因有10 個, 同時存在22 個基因僅包含motif3。依據(jù)基因組注釋文件, 獲得了TaPOD基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。由圖3 可知, 所有基因均具有完整的CDS, 但有76 個基因不存在UTR, UTR 的缺少可能是導(dǎo)致基因功能發(fā)生變化的原因。進化關(guān)系較近的基因存在保守的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 尤其在這些基因的保守結(jié)構(gòu)域中表現(xiàn)更為明顯。

圖1 小麥TaPOD 家族成員的保守序列標(biāo)識Fig. 1 Identification of conserved sequence of TaPOD family members in wheat

圖2 小麥TaPOD 家族成員的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig. 2 Phylogenetic relationships among members of TaPOD family in wheat

圖3 小麥TaPOD 基因的保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 Analysis of the phylogenetic relationship and gene structure of TaPOD gene in wheat

2.3 小麥TaPOD 基因的染色體分布及共線性分析

根據(jù)基因在染色體上的位置, 繪制TaPOD基因的染色體定位圖(圖4)。結(jié)果表明, 小麥TaPOD基因在3 個亞基因組(A、B、D)上分布較為均勻(A: 215、B: 220、D: 210)。在2 號染色體(2A、2B、2D)上數(shù)量最多, 有180 個基因, 在4 號染色體(4A、4B、4D)上最少, 有49 個基因。其中, 265個小麥TaPOD基因形成了152 對串聯(lián)重復(fù)基因?qū)?圖4 中黑色小線條連接表示)。由于六倍體小麥中的基因密度較大, 染色體中呈現(xiàn)密集的藍色線條, 只有染色體兩端存在密度較小的區(qū)域呈現(xiàn)黃色線條。

為明確小麥TaPOD基因的擴展與小麥多倍化間的關(guān)系, 通過MCscanX 對TaPOD基因進行重復(fù)模式分析。結(jié)果顯示, 小麥中共存在81,537 個共線性區(qū)域(包含Un 染色體), 163,074 個基因(圖5)。其中有396 個TaPOD基因定位在共線性區(qū)域內(nèi), 表明這些成員是由于基因的片段復(fù)制而產(chǎn)生, 也可能是隨著小麥多倍化過程中產(chǎn)生。而在串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制事件中涉及到103 個TaPOD基因, 證明這些基因是由兩種模式共同作用而擴增出來的。同時圖中環(huán)1 顯示小麥中的基因密度普遍較大。由環(huán)3 可知, 在Un 染色體上存在大量未知堿基部分(序列中用N 表示),而其他染色體僅在個別位置存在未知堿基的分布, 同時環(huán)2 中線的波動也與之相互印證。

圖5 小麥TaPOD 基因的區(qū)域共線性關(guān)系Fig. 5 Regional collinearity of TaPOD gene in wheat

為了確定小麥TaPOD重復(fù)基因在進化過程中受到的自然選擇壓力, 對396 個重復(fù)基因進行了Ka/Ks分析(附表2)。由表2 (部分)顯示, 396 個重復(fù)事件中, 有4 個事件的Ka/Ks比率大于1 (TraesCS1B02G096000.1 和TraesCS1D02G 080000.1; TraesCS3B02G034300.1 和 TraesCS3D02G 031800.1; TraesCS4A02G036100.1 和TraesCS4D02G 268200.1; TraesCS4B02G268900.1 和 TraesCS4D02G 268200.1), 比率分別為1.26、1.81、1.45、1.88, 這4 對復(fù)制事件可能是加速基因進化的關(guān)鍵所在。剩余的TaPOD基因Ka/Ks值在0.023629782～0.963772088 之間, 表明這些基因在進化中得到了純化選擇。

表2 TaPOD 基因Ka/Ks 分析(部分)Table 2 Ka/Ks of repeated events in wheat TaPOD (Part)

2.4 小麥TaPOD 基因啟動子的順式作用元件分析

轉(zhuǎn)錄因子通過與順式作用元件結(jié)合來調(diào)控基因表達,對小麥TaPOD基因啟動子區(qū)域的順式作用元件進行分析,可以為研究這些基因的表達調(diào)控提供理論依據(jù)。結(jié)果表明(圖6), 其上游2 kb 區(qū)域包含有12 種與植物生長發(fā)育、7種與植物抗性以及11 種參與激素反應(yīng)的順式作用元件。從中篩選23 種元件進行了可視化分析。在659 個小麥TaPOD基因中,TaPOD13、TaPOD22和TaPOD24僅含有3 個元件結(jié)合位點, 而TaPOD366中存在48 個啟動子元件結(jié)合位點, 其他基因的結(jié)合位點數(shù)量在這兩者之間。其中含有與光反應(yīng)有關(guān)的 G-box 啟動子順式作用元件,只有33 個成員不存在這個結(jié)合位點。而與晝夜節(jié)律的控制有關(guān)的circadian 啟動子順式作用元件數(shù)量較少, 只在90 個成員中存在。同時從整體來看, 與植物生長發(fā)育、激素反應(yīng)、抗逆性響應(yīng)有關(guān)的啟動子元件分別占總元件數(shù)的47.4%、39.3%、13.3%。以上結(jié)果表明,TaPOD家族成員可能主要參與調(diào)控植物生長發(fā)育以及響應(yīng)多種逆境脅迫。

圖6 小麥TaPOD 基因啟動子順式作用元件Fig. 6 Cis-acting element of TaPOD gene promoter in wheat

2.5 小麥TaPOD 基因家族的組織表達模式分析

小麥TaPOD基因表達模式分析見圖7, RNA-Seq 結(jié)果中總鑒定到的TaPOD家族成員422 個, 這些成員可以分為7 類(A～G), 其中86.5%TaPOD基因在小麥根系中的表達量較高, 而在籽粒和葉片中表達量較低或不表達。在A和G 組中, 有53 個基因在小麥根、籽粒、葉片中均有表達, 在這其中有17 個基因具有較高的表達量。其中有104個TaPOD成員只在根中表達, 而只在葉片中表達的有5 個成員以及有2 個成員只在籽粒中表達并且表達量都小于1;有11 個家族成員在根中不表達而在籽粒和葉片中有表達量; 在3 個組織都有表達量的有117 個, 占全部成員的30%,同時3 個組織中表達量都大于1 的有38 個成員; 這其中還有52 個成員在這3 個組織中表達量為0。進一步分析可知,TaPOD237在小麥根系表達量最高, 而在籽粒中表達量為0,在葉片中表達量小于0.1;TaPOD630在籽粒和葉片中表達量都最高, 而在根系中僅有0.24;TaPOD163、TaPOD228在小麥根系、葉片和籽粒中均具有較高的表達量。這說明TaPOD基因在植物的各個組織中都具有很大作用, 同時對小麥根系生長發(fā)育過程具有更重要影響。

2.6 小麥TaPOD 基因家族對外源激素和逆境響應(yīng)的表達模式分析

為研究TaPOD基因?qū)ν庠醇に睾湍婢车捻憫?yīng), 在圖7中的聚類分組中每組挑選一個, 同時挑選TaPOD534(POD11-A)的另外2 個亞基因組成員(TaPOD570(POD11-B)、TaPOD615(POD11-D)), 共挑選9 個TaPOD基因進行RT-qPCR 驗證, 結(jié)果顯示(圖8), 在4 種外源激素的處理下,TaPOD8、TaPOD340、TaPOD256的表達量均有所提高, 而TaPOD228對于外源激素沒有響應(yīng)。在赤霉素處理下, 除TaPOD228與TaPOD26沒有顯著變化外, 其他7 個基因的表達量明顯上調(diào), 其中TaPOD8和TaPOD340上調(diào)最高, 其相對表達量較對照分別提高了 42.4 倍和 34.1 倍。TaPOD534、TaPOD615、TaPOD8、TaPOD256、TaPOD458、TaPOD340在生長素的處理下相對表達量顯著升高。多數(shù)基因?qū)γ撀渌岬捻憫?yīng)較弱, 只有TaPOD340的相對表達量較對照上調(diào)2.1 倍,TaPOD570的相對表達量較對照下調(diào)0.5倍。TaPOD458、TaPOD26、TaPOD340在玉米素的處理下,相對表達量較對照分別上調(diào)了6.3、2.6 和4.5 倍,TaPOD507的相對表達量較對照下調(diào)0.7 倍, 其余5 個激素相對表達量沒有明顯變化。

圖8 TaPOD 基因家族成員在4 種激素處理下的表達模式分析Fig. 8 Relative expression pattern of TaPOD gene family members under four hormone treatments

在4 種逆境脅迫下,TaPOD228和TaPOD26的相對表達量均顯著下調(diào), 而TaPOD458和TaPOD534則全部上調(diào),且上調(diào)倍數(shù)較大(圖9)。在鹽脅迫下,TaPOD534、TaPOD8、TaPOD256、TaPOD458、TaPOD340相對表達量顯著上調(diào),其中TaPOD534與對照相比上調(diào)了13.3 倍; 而TaPOD570、TaPOD615、TaPOD228、TaPOD26均下調(diào)表達, 其中TaPOD615下調(diào)不顯著。在低溫脅迫下,TaPOD534、TaPOD615、TaPOD8、TaPOD256、TaPOD458、TaPOD340相對表達量均顯著上調(diào), 且TaPOD340與對照相比上調(diào)了23 倍。在高溫脅迫下, 只有TaPOD534、TaPOD8、TaPOD458的相對表達量顯著上調(diào), 其他基因均為下調(diào)表達。在干旱脅迫中,TaPOD458、TaPOD534的相對表達量較對照分別上調(diào)15.3 倍和8.6 倍。

圖9 TaPOD 基因家族成員在4 種逆境脅迫下的表達模式分析Fig. 9 Relative expression pattern of TaPOD gene family members under four stresses

3 討論

POD在植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)、光合作用等過程有著重要的調(diào)控作用。目前,POD已經(jīng)在擬南芥[23]、水稻[24]、玉米[25]、稷[26]、毛果楊[27]、葡萄[28]中進行了廣泛的研究, 本研究在小麥全基因組中共鑒定了 659 個TaPOD家族成員, 在所有染色體上均鑒定到TaPOD基因(包括Un 染色體)。其中, 2 號染色體上TaPOD基因較多,而4 號、5 號、6 號染色體上較少, 說明基因在進化過程中存在不均勻分布的現(xiàn)象。共線性分析發(fā)現(xiàn), 在小麥的21條染色體中都存在TaPOD基因的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象以及片段重復(fù)現(xiàn)象, 并且兩者的數(shù)量都較大, 這是TaPOD基因家族擴張的主要途徑[27]。TaPOD基因重復(fù)事件的Ka/Ks分析,發(fā)現(xiàn)其中有4 組重復(fù)事件的比值大于1, 說明存在自然的正向選擇, 這可能是TaPOD進化較快的主要表現(xiàn)途徑[28]。其他的比值都小于1 表現(xiàn)為純化選擇, 這和大多數(shù)基因家族情況一致[29-30]。在我們鑒定到的659 個TaPOD基因中包含了I 類26 個成員, II 類23 個成員, III 類610 個成員, 而在擬南芥中鑒定到73 個III 類POD成員[31], 在水稻中鑒定到138 個成員[24], 在玉米中鑒定到119 個成員[25], 小麥(六倍體)中存在如此大量的POD家族成員遠超過其他物種(二倍體), 可能是由于多種重復(fù)事件而造成的, 這些重復(fù)與基因組的大小并無直接的聯(lián)系, 同時基因的進化也會造成基因結(jié)構(gòu)上的不同。

TaPOD基因結(jié)構(gòu)存在差異, 系統(tǒng)發(fā)育樹中不同分組間的基因結(jié)構(gòu)差異更大, 這些結(jié)構(gòu)上的差異可能是造成功能差異的主要原因。分析鑒定出的5 個保守基序發(fā)現(xiàn),不同進化分支上的TaPOD 蛋白中的motif 組成存在差異,這也可能會導(dǎo)致不同TaPOD家族成員功能上的差異。另外, 進化樹VI、VII 分支的基因結(jié)構(gòu)與其他組的結(jié)構(gòu)差異較大, 外顯子數(shù)量明顯較多, 這與番茄中鑒定到的POD基因結(jié)構(gòu)相似[31], 推測屬于I 類POD。其他的分組里面基因結(jié)構(gòu)也都較為保守, 含有1～4 個外顯子, 與胡蘿卜中鑒定到的POD基因結(jié)構(gòu)近似[32]。這說明POD在進化過程中基因結(jié)構(gòu)較為保守, 推測這些POD功能可能也是相似的[33]。同時, 基因UTR 區(qū)域結(jié)構(gòu)的不同可能也會造成功能上的變化, 這需要我們進一步去探究。

通過對小麥TaPOD基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分析, 發(fā)現(xiàn)數(shù)量最多的是參與光反應(yīng)的作用元件, 也包含大量生物和非生物脅迫相關(guān)的調(diào)節(jié)元件, 這與程靈彤等人的研究結(jié)果一致[34]。也有研究指出玉米POD家族成員具有與激素、干旱和低溫響應(yīng)有關(guān)的MBS、P-box、SpI、AE-box 順式作用元件[35]。本研究結(jié)果表明, 659 個TaPOD家族成員中, 包含元件數(shù)量最多的成員(TaPOD299)有23個, 最少成員(TaPOD22、TaPOD24和TaPOD592)只有2個; 其中, 有626 個POD成員含有G-box 結(jié)合元件, 有386 個POD成員含有CAT-box 元件, 這些元件主要參與小麥生長發(fā)育的調(diào)控。此外這些成員還有與根、胚乳、細胞分生組織特異性表達有關(guān)的元件, 以及在水稻干旱脅迫中發(fā)揮作用的ABRE 順式元件[36]。由此推測, 不同的順式作用元件可能反映了潛在的功能變異, 而元件的不同對轉(zhuǎn)錄水平的基因表達起到?jīng)Q定作用[34]。

基因在RNA 水平的表達往往是影響生物表型的重要因素。根據(jù)基因在不同組織中的表達水平分析可知, 在根系中表達量最高的成員TaPOD237其注釋屬于根系POD主要在根系表達, 可能與大多數(shù)POD基因相同, 對植物根系的伸長生長以及根系的保護防御有重要意義, 同時也可能在根毛的發(fā)育中起重要作用[37]; 葉片和籽粒中表達最高的成員TaPOD630屬于PODP7亞家族, 在葉片的伸長區(qū)和表皮中表達較為突出, 可能參與葉片細胞壁的擴張, 同時也可能在植物的防御機制中有重要作用, 具有抗真菌病害的功能[38]; 在3 個組織中表達量都較高的成員TaPOD163、TaPOD228屬于抗壞血酸過氧化物酶, 有研究顯示其具有H2O2體內(nèi)平衡、葉綠體保護、植物結(jié)構(gòu)維持的功能[39], 還可以作為分子伴侶的存在, 同時可能對糖信號有一定的影響作用[40]。同時從整體來看小麥中TaPOD基因主要在根部表達, 這可能是因為POD 是木質(zhì)素大分子合成酶的最后一步[41], 而根系在生長過程中需要通過大量的木質(zhì)化來強化其耐磨損性[42]。籽粒和葉片中表達量較少, 則可能是生育后期活性不高或是這些基因在根和葉中有不同的功能導(dǎo)致的[43]。同時, 植物的生長發(fā)育會受到植物激素的精確調(diào)控。在本試驗條件下,TaPOD228對于4 種激素響應(yīng)均不明顯, 這可能是由于其屬于抗壞血酸過氧化物酶, 與植物中的抗壞血酸含量的關(guān)系較為密切, 且參與抗壞血酸循環(huán)[44]。而除TaPOD26以外, 其他POD基因在赤霉素處理下有明顯上調(diào), 這可能與其啟動子序列含有P-box、GARE-motif 等與赤霉素相關(guān)的啟動子元件有關(guān)。這9 個基因表現(xiàn)出了對于4 種激素不同的反應(yīng),TaPOD340對生長素響應(yīng)最明顯, 可能與其中含有AuxRR-core 生長素響應(yīng)元件有關(guān), 有研究顯示該啟動子順式作用元件對于生長素反應(yīng)必不可少[45]。TaPOD8在赤霉素處理下顯著上調(diào),TaPOD458和TaPOD26響應(yīng)玉米素處理, 這表明不同的TaPOD基因?qū)τ诩に氐捻憫?yīng)模式或是信號通路存在差異。

植物的生命周期內(nèi)會受到各種非生物脅迫的影響,例如鹽、低溫、高溫、干旱[46]。本試驗結(jié)果表明,TaPOD534、TaPOD8和TaPOD458在4 種逆境條件下的相對表達量均有所提高, 同時其中含有LTR、MBS 等與干旱和溫度有關(guān)的啟動子元件, 推測這3 個POD基因參與了多種逆境調(diào)控, 這與大多數(shù)前人的研究結(jié)果相符[47-48]。TaPOD570、TaPOD228、TaPOD26基因在逆境脅迫下其表達量呈下調(diào)的狀態(tài), 推測這3 個基因可能主要在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮作用。這之中TaPOD458、TaPOD340在鹽脅迫和低溫脅迫下上調(diào)倍數(shù)較大可能與其含有 DRE core 啟動子順式作用元件有關(guān)[49]。另有研究顯示,OsAPX2由鹽脅迫誘導(dǎo), 從而使轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出更高的耐鹽性[50]。本研究中發(fā)現(xiàn)TaPOD534、TaPOD8在鹽脅迫下有明顯上調(diào), 但是在啟動子順式作用元件的預(yù)測中沒有發(fā)現(xiàn)與鹽脅迫有關(guān)的啟動子作用元件, 可能說明其在鹽脅迫條件下通過其他途徑發(fā)揮他們相關(guān)的作用, 有待進一步研究。不同POD成員在這4 種脅迫下各有不同的表現(xiàn),表明TaPOD成員間在響應(yīng)脅迫方面有不同的生理功能,這也與多數(shù)研究結(jié)果一致[43]。值得注意的是, 脫落酸與干旱和鹽脅迫有重要關(guān)系, 且外源性的ABA 處理可以誘導(dǎo)多種干旱脅迫響應(yīng)基因[43,51-52], 這與本試驗結(jié)論有所不同, 推測可能是不同物種之間存在差異或是處理條件不同造成的, 有待進一步研究。

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