低溫脅迫對(duì)Bt 棉纖維中殺蟲蛋白含量及氮代謝的影響

戴雨陽(yáng) 岳 野 劉震宇 何 潤(rùn) 劉雨婷 張 祥 陳德華 陳 媛

揚(yáng)州大學(xué) / 江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn), 江蘇揚(yáng)州 225009

自1997 年轉(zhuǎn)Bt 基因抗蟲棉在我國(guó)進(jìn)行商品化種植以來(lái), Bt 棉面積已占中國(guó)棉花種植面積的90%以上[1]。種植Bt 棉能有效地降低棉鈴蟲等害蟲的危害, 從而減少農(nóng)藥的用量, 具有良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益[2-3]。棉花原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶, 是喜溫作物, 對(duì)低溫極其敏感, 更易受到低溫冷害的影響。目前, 我國(guó)棉花產(chǎn)區(qū)逐漸向新疆寒涼地帶轉(zhuǎn)移, 因此低溫逆境在棉花生產(chǎn)中發(fā)生更為頻繁[4], 并且極端低溫發(fā)生的頻率和強(qiáng)度也呈上升趨勢(shì)。在7 月至8 月, 新疆地區(qū)夜晚經(jīng)常出現(xiàn)15℃左右的低溫, 甚至出現(xiàn)連續(xù)3 d 及以上平均氣溫小于20℃的障礙性冷害現(xiàn)象[5]。2022 年7 月9 日, 喀什出現(xiàn)了9℃的低溫; 2022 年8月中旬, 阿勒泰出現(xiàn)了持續(xù)一個(gè)星期的平均氣溫低于15℃的天氣。低于15℃的溫度會(huì)使棉花生長(zhǎng)發(fā)育速度減緩或者是停止生長(zhǎng); 后期溫度在20℃以下,對(duì)纖維成熟不利[6]。纖維是棉花的主要產(chǎn)物, 在棉鈴纖維生長(zhǎng)發(fā)育的重要時(shí)期受到棉鈴蟲危害, 會(huì)對(duì)產(chǎn)量形成造成極大的影響[7]。

國(guó)內(nèi)外的研究普遍認(rèn)為Bt 棉花的抗蟲性是不穩(wěn)定的, 并且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)空動(dòng)態(tài)規(guī)律。陳松等[8]對(duì)轉(zhuǎn)Bt 抗蟲棉32B 不同生育時(shí)期抗蟲性測(cè)定表明,整個(gè)苗期抗蟲性表現(xiàn)較強(qiáng), 但到了現(xiàn)蕾期則有所下降, 在生長(zhǎng)中后期更是顯著下降至最低值。李汝忠等[9]研究表明, 全展開的功能葉中殺蟲蛋白含量是最高的, 而根、莖和葉柄中含量相對(duì)較低。Bt 棉的抗蟲性還受各種環(huán)境因素影響, 在不良的環(huán)境脅迫下, Bt 棉會(huì)表現(xiàn)出抗蟲性顯著下降甚至抗蟲性消失的情況[10]。張祥等[11]通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)陀谔镩g持水量的60%時(shí), 棉花植株不同器官中殺蟲蛋白的含量會(huì)顯著降低。夏蘭芹等[12]研究表明高溫使Bt 基因沉默時(shí)間提前, 殺蟲蛋白表達(dá)量減少, 進(jìn)而導(dǎo)致殺蟲蛋白含量急劇下降。周冬生等[13]通過(guò)棉鈴蟲飼喂研究了溫度對(duì) Bt 棉的抗蟲性影響, 指出高低溫都影響B(tài)t 棉抗蟲性, 且低溫對(duì)Bt 棉抗蟲性影響更大。鐘信念等[14]通過(guò)溫室試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低于20℃的低溫會(huì)對(duì)棉花的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響, 并且低溫持續(xù)時(shí)間也是重要的影響因素之一。周青[15]研究發(fā)現(xiàn)在棉纖維加厚期日均溫低于19.5℃時(shí), 纖維中的可溶性蛋白含量逐漸降低, 并且可溶性蛋白含量隨著溫度的降低會(huì)進(jìn)一步的降低。Fitt 等[16]在對(duì)Bt 棉進(jìn)行田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連續(xù)的低溫會(huì)使殺蟲蛋白含量下降, 導(dǎo)致棉鈴蟲危害。陳德華等[17]研究表明在低溫條件下,葉片的殺蟲蛋白含量發(fā)生變化的時(shí)間較早, 并且在整個(gè)脅迫期間下降幅度大。

以往的研究主要集中在葉片, 而棉鈴蟲危害棉花纖維會(huì)對(duì)產(chǎn)量造成直接影響。因此在纖維生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期, 纖維殺蟲蛋白含量保持穩(wěn)定具有十分重要的意義。此外Bt 棉低溫脅迫的研究多以特定脅迫溫度對(duì)棉花不同生育時(shí)期的影響為主, 然而不同程度的低溫及低溫持續(xù)時(shí)長(zhǎng)對(duì)Bt 棉抗蟲性的影響卻很少涉及。針對(duì)棉花生產(chǎn)實(shí)踐中低溫影響抗蟲性的問(wèn)題,本研究通過(guò)人工模擬生產(chǎn)上可能出現(xiàn)的低溫, 探討鈴期不同水平低溫及持續(xù)時(shí)間對(duì)Bt 棉纖維殺蟲蛋白表達(dá)量及其氮代謝特征的影響, 從而為Bt 棉抗蟲性安全應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為: 轉(zhuǎn)Bt 基因(Cry I Ac)抗蟲棉(Bt 棉)常規(guī)品種泗抗1 號(hào)(Sikang 1, SK1)和雜交種泗抗3 號(hào)(Sikang 3, SK3)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020—2021 年在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省遺傳栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2 年試驗(yàn)均為盆栽試驗(yàn), 所用盆缽直徑35 cm, 盆高30 cm, 每盆裝20 kg 過(guò)篩的砂壤土(取自大田試驗(yàn)田), 含有機(jī)物17.3 g kg-1、水解氮129.9 mg kg-1、速效磷25.4 mg kg-1和速效鉀81.0 mg kg-1。采用育苗移栽方式種植, 每年的4 月17 日營(yíng)養(yǎng)缽育苗, 5 月22 日選擇長(zhǎng)相一致的壯苗移栽盆中, 每盆1 株。保持盆中土壤含水量接近田間持水量, 肥料與其他管理措施按照當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)栽培要求進(jìn)行。

2020 年試驗(yàn), 每個(gè)品種每個(gè)處理設(shè)6 次重復(fù)。于盛花期時(shí)(7 月18 日)標(biāo)記棉株第7～8 果枝, 第1～2果節(jié)當(dāng)日花, 待標(biāo)記鈴長(zhǎng)至15 日齡時(shí)移至人工氣候室以16℃、17℃、18℃、19℃、20℃和27 ℃ ( 對(duì)照)進(jìn)行不同低溫水平脅迫試驗(yàn)和12 h、24 h、48 h 不同低溫脅迫持續(xù)時(shí)間試驗(yàn)。2021 年(除去20℃處理)并重復(fù)2020 年試驗(yàn), 溫度控制情況見表1。處理結(jié)束后, 取盛花期標(biāo)記相同部位相同日齡的棉鈴, 液氮冷凍后在低溫條件下用鑷子從鈴殼中剝離纖維并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

表1 人工氣候室48 h 內(nèi)各處理最低溫度和最高溫度Table 1 Lowest and highest temperatures of each treatment within 48 hours in the artificial climate chamber ( ℃)

1.3 測(cè)定指標(biāo)

采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測(cè)定[18]殺蟲蛋白含量。采用G-250 考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定[19]可溶性蛋白含量。采用抗壞血酸茚三酮染色法測(cè)定[20]游離氨基酸含量。采用賴氏比色法測(cè)定[21]谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性[22]; 肽酶活性測(cè)定是在粗酶液中加入底物牛血紅蛋白和酪蛋白(干酪素), 反應(yīng)一段時(shí)間后, 離心獲得上清液, 上清液中的氨基酸含量采用茚三酮染色法進(jìn)行測(cè)定[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 25.0 軟件進(jìn)單因素方差分析, 在P≤0.05 時(shí)LSD 檢驗(yàn)各處理間差異的顯著性, 采用皮爾遜相關(guān)分析, 用Microsoft Excel 2017 進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)Bt 棉纖維中殺蟲蛋白含量的影響

與對(duì)照(27 ℃)相比, 低溫處理下纖維中殺蟲蛋白含量降低, 且隨著溫度的降低, 其含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1)。2020 年, 低溫處理12 h 后, SK1 和SK3均僅在16℃處理下存在顯著差異, SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃的處理下分別比對(duì)照降低13.64%、3.43%、1.23%、1.69%、1.57%和9.91%、3.12%、0.96%、0.19%、0.61%。低溫處理24 h 后, SK1 在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃和18℃處理下存在顯著差異;SK3 在18℃、19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃和17℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃的處理下分別比對(duì)照降低25.11%、16.63%、8.65%、6.47%、5.12%和18.73%、10.71%、3.17%、2.55%、2.22%。低溫處理48 h 后, SK1 在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃和18℃處理下存在顯著差異; SK3 在18℃、19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃和17℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃的處理下分別比對(duì)照降低27.78%、19.09%、18.17%、3.47%、3.22%和29.69%、20.31%、11.81%、3.45%、2.12%。導(dǎo)致SK1 中殺蟲蛋白含量顯著降低的溫度在脅迫12 h 后為16 ℃, 24 h 和48 h 后為18 ℃, SK3在脅迫12 h 后為16 ℃, 24 h和48 h 后為17℃。2021年, 纖維中殺蟲蛋白含量的變化趨勢(shì)與2020 年相似,SK1 在低溫處理12 h、24 h 和48 h 后發(fā)生顯著變化的溫度分別為16℃、18℃和18 ℃, SK3在低溫脅迫12 h、24 h、48 h 后發(fā)生顯著變化的溫度分別為16℃、17℃和18℃。品種間相比, SK1 的殺蟲蛋白含量的下降幅度整體上比SK3 更大。2021 年也觀察到了相似的趨勢(shì)。導(dǎo)致殺蟲蛋白含量顯著降低的溫度隨低溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加, 并且還進(jìn)一步降低了殺蟲蛋白的含量。

圖1 低溫對(duì)Bt 棉纖維中殺蟲蛋白含量的影響Fig. 1 Effect of low temperature stress on insecticidal protein content in fibers

2.2 低溫對(duì)Bt 棉纖維中氮代謝的影響

2.2.1 低溫脅迫對(duì)Bt 棉纖維中可溶性蛋白含量的影響 可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 隨著溫度的降低, 其含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖2)。2020 年, SK1 和SK3 在低溫脅迫12 h 后, 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維可溶性蛋白含量分別比對(duì)照下降14.11%、11.62%、8.62%、2.29%、4.37%和14.48%、4.93%、7.03%、2.93%、2.27%。在低溫處理24 h 后, SK1 在18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃和17℃處理下存在顯著差異; SK3 在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維可溶性蛋白含量分別比對(duì)照下降31.46%、19.54%、5.12%、0.79%、1.65%和17.04%、14.46%、9.92%、8.82%、6.00%。在低溫處理48 h后, SK1 在各處理下與對(duì)照均存在顯著差異; SK3 在20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃、19℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維可溶性蛋白含量分別比對(duì)照下降33.72%、27.29%、23.58%、9.82%、10.49%和26.52%、28.98%、19.73%、7.76%、5.46%。品種間相比, SK1 的可溶性蛋白含量的下降幅度整體上比SK3 更大。2021 年也觀察到相似的趨勢(shì)。引起纖維內(nèi)可溶性蛋白含量顯著下降的溫度隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高, 并且還進(jìn)一步降低了可溶性蛋白含量。

2.2.2 低溫對(duì)Bt 棉纖維中游離氨基酸含量的影響

纖維中游離氨基酸含量在低溫處理下升高, 且隨處理溫度的降低, 其含量整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖3)。2020 年, SK1 和SK3 在低溫處理12 h 后, 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維游離氨基酸含量分別比對(duì)照升高8.24%、5.30%、6.34%、4.37%、1.16%和20.33%、2.05%、1.75%、1.40%、-0.68%。在低溫處理24 h 后, SK1 和SK3 均在18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃和17℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維游離氨基酸含量分別比對(duì)照升高21.49%、14.53%、7.19%、3.56%、0.73%和33.5%、15.03%、8.69%、5.46%、3.93%。在低溫處理48 h 后, SK1 和SK3 均在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維游離氨基酸含量分別比對(duì)照升高35.20%、24.77%、21.92%、7.97%、5.03%和37.06%、18.50%、19.45%、5.64%、4.42%。品種間相比, SK1的游離氨基酸含量的升高幅度整體上比SK3 更大。2021 年也觀察到相似的趨勢(shì)。引起纖維內(nèi)游離氨基酸含量顯著升高的溫度隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高, 并且還進(jìn)一步升高了游離氨基酸含量。

圖3 低溫對(duì)Bt 棉纖維游離氨基酸含量的影響Fig. 3 Effect of low temperature stress on free amino acid content in fibers

2.2.3 低溫對(duì)Bt 棉纖維中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

作為氨基酸合成的關(guān)鍵酶, 谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性在低溫處理下降低, 且隨處理溫度的降低, 其含量整體上呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(圖4)。2020 年, 低溫處理12 h后, SK1 和SK3 均僅在16℃處理下與對(duì)照存在顯著差異。SK1 和SK3 脅迫在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維谷草轉(zhuǎn)氨酶活性分別比對(duì)照下降13.32%、8.27%、6.43%、1.01%、0.64%和13.63%、9.66%、7.37%、3.66%、2.00%。在低溫處理24 h 后,SK1 在18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃和17℃處理下存在顯著差異; SK3 在17℃、18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維谷草轉(zhuǎn)氨酶活性分別比對(duì)照下降19.73%、15.90%、6.87%、4.57%、2.35%和20.96%、11.97%、3.33%、0.94%、1.26%。在低溫處理48 h 后, SK1 和SK3 均僅在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維谷草轉(zhuǎn)氨酶活性分別比對(duì)照下降31.31%、20.58%、16.90%、4.45%、3.41%和28.29%、20.88%、18.32%、4.60%、2.52%。品種間相比, SK1 的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的降低幅度整體上比SK3 更大。2021 年也觀察到了相似的趨勢(shì)。引起纖維內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降的溫度隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高, 并且還進(jìn)一步降低了谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。

圖4 低溫對(duì)Bt 棉纖維谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響Fig. 4 Effect of low temperature stress on GOT activity in fibers

2.2.4 低溫脅迫對(duì)纖維中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

作為氨基酸合成的關(guān)鍵酶, 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性在低溫處理下降低, 且隨處理溫度的降低, 其含量整體上呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(圖5)。2020 年, 在低溫處理12 h 后, SK1 和SK3 均僅在16℃處理與對(duì)照存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和 20℃處理下纖維谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性分別比對(duì)照下降16.41%、7.68%、6.82%、5.77%、2.76%和12.55%、5.57%、4.33%、1.61%、2.11%。在低溫處理24 h后, SK1 在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著,但在16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異; SK3在18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著,但在16℃和17℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性分別比對(duì)照下降28.17%、16.93%、8.79%、5.81%、3.35%%和21.31%、13.79%、6.08%、4.76%、3.87%。在低溫處理48 h 后, SK1 在各處理下與對(duì)照均存在顯著差異; SK3 在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性分別比對(duì)照下降30.66%、27.20%、22.86%、7.57%、5.86%和25.78%、19.40%%、16.39%、6.21%、4.98%。品種間相比, SK1 的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的降低幅度整體上比SK3 更大。2021 年也觀察到了相似的趨勢(shì)。低溫脅迫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)不僅提高了使纖維內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降的溫度, 并且還進(jìn)一步降低了谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。

圖5 低溫對(duì)Bt 棉纖維谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響Fig. 5 Effect of low temperature stress on GPT activity in fibers

2.2.5 低溫對(duì)Bt 棉纖維中蛋白酶活性的影響

參與蛋白質(zhì)分解的蛋白酶的活性在低溫處理下升高, 且隨處理溫度的降低, 其含量整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖6)。2020 年, 在低溫處理12 h 后, SK1和SK3 均僅在16℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維蛋白酶活性分別比對(duì)照升高 7.82%、3.48%、2.88%、0.58%、0.37%和7.54%、4.11%、3.44%、2.90%、0.84%。在低溫處理24 h 后, SK1 在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在 16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異; SK3 在 18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃和17℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維蛋白酶活性分別比對(duì)照升高13.11%、7.98%、6.77%、1.24%、0.65%和14.08%、7.46%、4.75%、1.44%、0.61%。在低溫處理48 h 后, SK1 在20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃、19℃處理下存在顯著差異; SK3 在19℃和20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維蛋白酶活性分別比對(duì)照升高 18.71%、14.02%、12.85%、4.93%、3.12%和19.25%、14.57%、13.10%、1.44%、0.31%。品種間相比, SK1 的蛋白酶活性的升高幅度整體上比SK3 更大。2021 年也觀察到了相似的趨勢(shì)。引起纖維內(nèi)蛋白酶活性顯著升高的溫度隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高, 并且還進(jìn)一步升高了蛋白酶活性。

2.2.6 低溫對(duì)Bt 棉纖維中肽酶活性的影響 參與蛋白質(zhì)分解的肽酶的活性在低溫處理下升高, 且隨處理溫度的降低, 其含量整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖7)。2020 年, 在低溫處理12 h 后, SK1 在17℃、18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃處理下存在顯著差異; SK3 在各處理下均與對(duì)照差異不顯著。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維肽酶活性分別比對(duì)照升高11.19%、6.81%、3.79%、3.02%、2.21%和6.59%、2.53%、1.56%、2.46%、1.41%。在低溫處理24 h 后,SK1 和SK3 均僅在18℃、19℃、20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃和17℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維肽酶活性分別比對(duì)照升高 23.74%、15.17%、8.83%、4.91%、3.42%和18.01%、10.47%、6.29%、3.67%、1.60%。在低溫處理48 h 后, SK1 在19℃和 20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃處理下存在顯著差異; SK3 在20℃的處理下與對(duì)照差異不顯著, 但在16℃、17℃、18℃、19℃處理下存在顯著差異。SK1 和SK3 在16℃、17℃、18℃、19℃和20℃處理下纖維肽酶活性分別比對(duì)照升高27.24%、19.07%、15.65%、6.57%、3.11%%和16.36%、11.04%、9.95%、6.72%、3.86%。2021 年也觀察到了相似的趨勢(shì)。品種間相比, SK1的肽酶活性的升高幅度整體上比SK3 更大。引起纖維內(nèi)肽酶活性顯著升高的溫度隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高, 并且還進(jìn)一步升高了肽酶活性。

圖7 低溫對(duì)Bt 棉纖維肽酶活性的影響Fig. 7 Effect of low temperature stress on peptidase activity in fibers

2.3 Bt 棉纖維中殺蟲蛋白含量與氮代謝關(guān)鍵物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶的相關(guān)性分析

對(duì)氮代謝關(guān)鍵物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性進(jìn)行相關(guān)分析(表2)發(fā)現(xiàn), 2020 年SK1 在低溫處理12 h 后, 殺蟲蛋白含量與可溶性蛋白含量以及游離氨基酸含量無(wú)顯著關(guān)系, 與谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈現(xiàn)顯著正相關(guān),與谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性呈極顯著正相關(guān), 與蛋白酶和肽酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。SK3 在低溫處理12 h 后, 殺蟲蛋白含量與可溶性蛋白含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性呈極顯著正相關(guān), 與谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈顯著正相關(guān),與游離氨基酸含量和肽酶活性呈顯著負(fù)相關(guān), 與蛋白酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)。SK1 在低溫處理24 h 和48 h 后, 殺蟲蛋白含量和可溶性蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈極顯著正相關(guān), 與游離氨基酸含量、蛋白酶活性、肽酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。SK3 在低溫處理24 h 后, 殺蟲蛋白含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈極顯著正相關(guān),與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān), 與游離氨基酸含量、蛋白酶活性、肽酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。SK3在低溫處理48 h 后, 殺蟲蛋白含量和可溶性蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈極顯著正相關(guān), 與游離氨基酸含量、蛋白酶活性、肽酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。2021 年的數(shù)據(jù)也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。表明殺蟲蛋白含量的變化受到氮代謝關(guān)鍵物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性變化的影響, 并且隨著持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)變得更加顯著。以殺蟲蛋白含量為(Y)為因變量,可溶性蛋白含量(X1)、游離氨基酸含量(X2)、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性(X3)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(X4)、蛋白酶活性(X5)和肽酶活性(X6)為自變量進(jìn)行逐步回歸分析, 回歸方程決定系數(shù)為R2=0.968 (表3), 則谷草轉(zhuǎn)氨酶活性和肽酶活性是能夠反映殺蟲蛋白含量的主要因素。

表2 殺蟲蛋白含量與氮代謝關(guān)鍵物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of insecticidal protein content with the content of key substances in nitrogen metabolism and the activity of key enzymes

表3 逐步回歸分析結(jié)果Table 3 Results of stepwise regression analysis

3 討論

3.1 低溫脅迫對(duì)Bt棉纖維中殺蟲蛋白含量的影響

前人研究表明。低于15℃的溫度會(huì)嚴(yán)重影響棉花的生長(zhǎng)發(fā)育[23]。Maho 等[24]通過(guò)生測(cè)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在低溫(14～22 ℃)條件下棉鈴幼蟲存活率較高。周冬生等[25]研究溫度對(duì)已表達(dá)于棉株中的殺蟲蛋白抗蟲活性的影響, 發(fā)現(xiàn)在16℃的低溫下可明顯降低轉(zhuǎn)Bt基因離體器官的抗蟲活性。張明偉等[26]研究表明Bt棉全生育期均會(huì)受低溫高濕影響, Bt 棉葉片殺蟲蛋白下降幅度因脅迫的程度和時(shí)期而異, 結(jié)鈴期Bt 棉葉片殺蟲蛋白含量下降速度快于盛花期。Chen 等[27]研究表明低溫脅迫會(huì)降低鈴殼以及葉片中殺蟲蛋白含量, 并且延長(zhǎng)低溫持續(xù)時(shí)間會(huì)增加其發(fā)生顯著變化的溫度。由此可見, 在棉花生育階段特別是結(jié)鈴期出現(xiàn)低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致Bt 棉抗蟲性的下降, 其原因可能是影響了自身殺蟲蛋白表達(dá)量, 也可能直接影響了殺蟲蛋白的活性。本文研究表明纖維中殺蟲蛋白含量在低溫脅迫下降低, 并且隨著溫度的降低,殺蟲蛋白含量總體呈下降趨勢(shì)。同時(shí), 殺蟲蛋白含量發(fā)生顯著變化的溫度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與對(duì)照(27 ℃)相比。纖維中殺蟲蛋白含量降低幅度隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。引起纖維中殺蟲蛋白含量顯著下降的溫度, SK1 在低溫處理12 h、24 h、48 h 后, 分別為16℃、18℃、18 ℃, SK3為16℃、17℃、17℃。品種間相比, SK1 的殺蟲蛋白含量的下降幅度整體上比SK3 更大, 這可能是雜種優(yōu)勢(shì)的原因。

3.2 低溫脅迫對(duì)氮代謝的影響

生物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程, 在合成新的蛋白質(zhì)的同時(shí), 也存在舊的蛋白質(zhì)的降解,降解產(chǎn)生的氨基酸又可用于合成蛋白質(zhì)[28]。劉志等[29]研究發(fā)現(xiàn)Bt 棉開始生殖生長(zhǎng)后, 生殖器官發(fā)育需要大量的蛋白質(zhì)和光合產(chǎn)物, 導(dǎo)致Bt 棉生長(zhǎng)中后期殺蟲蛋白含量顯著下降, 且葉片中的殺蟲蛋白含量與可溶性蛋白含量呈正相關(guān)。董雙林等[30]研究發(fā)現(xiàn)Bt棉生育后期殺蟲蛋白含量下降可能是蛋白酶降解的一部分作用。高溫條件下, Bt 棉葉片中殺蟲蛋白含量下降, 這可能是由于高溫促進(jìn)了葉片中可溶性蛋白的降解, 從而導(dǎo)致的下降[31]。溫度在38℃以上時(shí),晝夜變溫持續(xù)7 d 以上時(shí), 蕾鈴中蛋白質(zhì)的分解能力大于合成能力, 導(dǎo)致殺蟲蛋白含量顯著下降[32]。由此可見, 高溫脅迫會(huì)加快蛋白質(zhì)的分解, 延緩蛋白質(zhì)的合成, 最終導(dǎo)致殺蟲蛋白含量下降。本文研究發(fā)現(xiàn)在低溫條件下也有相似的結(jié)果。在低溫脅迫48 h 后, SK1 和SK3 中的殺蟲蛋白與可溶性蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈極顯著正相關(guān), 與游離氨基酸含量、蛋白酶活性、肽酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)均表明, 低溫條件下, 肽酶以及蛋白酶活性增強(qiáng), 導(dǎo)致分解蛋白質(zhì)能力增加, 游離氨基酸增多; 同時(shí), 谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶這2 種酶的活性下降直接導(dǎo)致合成蛋白質(zhì)能力的下降, 使得可溶性蛋白含量下降, 進(jìn)而導(dǎo)致殺蟲蛋白含量下降。以上結(jié)果表明, 低溫導(dǎo)致了蛋白質(zhì)合成能力的減弱和分解能力的增強(qiáng), 從而最終降低了殺蟲蛋白含量。通過(guò)對(duì)殺蟲蛋白含量做逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)谷草轉(zhuǎn)氨酶活性和肽酶活性是能夠反映殺蟲蛋白含量的主要因素。

4 結(jié)論

低溫脅迫降低了殺蟲蛋白含量, 且隨持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)下降幅度增大, 殺蟲蛋白發(fā)生顯著變化的溫度升高。低溫脅迫還使蛋白質(zhì)的合成功能下降, 分解能力增強(qiáng), 導(dǎo)致可溶性蛋白含量下降, 游離氨基酸含量升高, 最終導(dǎo)致殺蟲蛋白含量下降。因此生產(chǎn)上需要避免在鈴期出現(xiàn)持續(xù)12 h 以上, 16℃到18℃的低溫天氣, 以免纖維中的殺蟲蛋白含量顯著降低,抗蟲性降低, 產(chǎn)量減少。