茶樹CsMCC1 和CsMCC2 基因的克隆及表達特征性分析

代洪葦 劉潔強 張 麗 童華榮 袁連玉

西南大學食品科學學院 / 川渝共建特色食品重慶市重點實驗室, 重慶 400715

組蛋白乙酰化是一類可逆的組蛋白翻譯后修飾(histone post-translational modifications, HPTMs), 由組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白脫乙酰酶共同調節[1-3]。HPTMs 包括組蛋白的甲基化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化和乙酰化等, 這些表觀修飾位點一般在H3和H4 核心組蛋白的N 末端, 使染色質構象發生變化,在控制基因轉錄、表觀遺傳學和其他DNA 模板化過程中起著重要作用[4-5]。組蛋白的乙酰化過程是HATs將乙酰輔酶A (acetyl-CoA)的CH3COO-基團轉移到核心組蛋白N 末端的賴氨酸殘基的ε-NH3位, 以中和賴氨酸殘基上的正電荷, 使得染色質結構松弛,利于轉錄因子或轉錄調節蛋白與DNA 的結合, 而脫乙酰化則是一個相反的生物學過程[3,6-7]。所以, HATs參與的組蛋白乙酰化通常與基因的上調表達相關,而HDACs 催化的組蛋白去乙酰化與抑制性基因表達相關[8]。

組蛋白乙酰化在調節植物發育中的基因表達和植物對環境脅迫的響應中發揮重要作用[9]。水稻中發現組蛋白賴氨酸乙酰化與總酰化(包括丁酰化、乙酰化和巴豆酰化)的比值受環境和代謝信號的調節[10]。目前, 已經從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[1]、葡萄(Vitisvinifera)[11]、水稻(Oryzasativa)[12]、番茄(Solanumlycopersicum)[13]、荔枝(LitchichinensisSonn. cv.)[14]、小麥(Triticumaestivum)[15]、麻(Cannabis sativaL.)[16]和地錢(Marchantiapolymorpha)[17]植物中分別鑒定出13、7、8、32、6、12、11 和7 個編碼組蛋白乙酰轉移酶的HATs基因。在模式植物擬南芥中, HATs 基因家族被分為4 類: GNAT (GCN5-related N-terminal acetyltransferases)亞家族的HAG1～HAG3(HISTONEACETYLTRANSFERASEOF THEGNATFAMILY)和MCC1基因; MYST (Moz,Ybf2/Sas3, Sas2 和Tip60)亞家族的HAM1和HAM2(HAIRYMERISTEM)基因; CBP (CREB-binding protein)亞家族的HAC1、HAC2、HAC4、HAC5和HAC12(HISTONEACETYLTRANSFERASEOFTHECBP FAMILY)基因; TAFII250 (TATA binding protein- associated factor)亞家族的HAF1和HAF2(HISTONE ACETYLTRANSFERASEOFTHETAFII250FAMILY)基因[1]。HATs 廣泛參與各項生命活動, 包括細胞分化、分生組織功能、次生代謝物合成和脅迫應激反應等過程。在牽牛花中發現,GNAT是一類調控苯丙素類/類苯化合物生物合成及揮發的關鍵基因[18]。大麥GNAT 和MYST 亞家族的基因在種子發育的不同階段表達, 并且能夠被外源ABA 誘導[19]。AtMYST可以調節雌雄配子體的形成和發育, 當ham1ham2雙突變后導致雄性和雌配子體形成受到阻礙[20]。CBP 可以通過影響主要開花抑制因子基因FLC(FLOWERINGLOCUSC)的表達來促進開花[21-22],而TAFII250 又可以調節控制細胞周期及光響應基因的表達[23-24]。HAG1, 又名GCN5(GENERALCONTROL NONDEREPRESSIBLE5), 是HAT大家族中被研究最廣泛的基因。擬南芥AtHAG1對根系發育的干細胞維持及調節光誘導基因的表達發揮作用, 此外可以參與CBF1 (CRT/DRE binding factor 1)調節的低溫應激響應[23,25-26]。玉米根部在鹽脅迫處理后,ZmGCN5表達水平升高, 同時組蛋白的乙酰化水平上升[27]。但對于MCC基因的研究還很缺乏, 目前僅有2 篇文獻報道了MCC1是編碼GCN5 相關組蛋白N-乙酰轉移酶的基因, 可以影響植物細胞的減數分裂過程[28-29]。研究發現MCC1在植物減數分裂過程中維持染色體的交叉互換和分離具有重要調控作用,AtMCC1表達升高導致擬南芥2 號染色體交叉互換缺失, 4 號染色體交叉互換數目增加[28];AtMCC1基因在擬南芥中過表達后, 發現花粉母細胞中組蛋白高乙酰化, 且導致控制精細胞減數分裂的基因失調[29]。

茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]是重要的經濟作物, 已經從茶樹中鑒定出眾多調控次生代謝、生長發育及脅迫響應的基因, 但關于茶樹組蛋白乙酰化修飾的研究還很少。目前在茶樹中鑒定了18 個CsHDACs基因, 在hd2c突變體中過表達CsHD2C可以恢復擬南芥對脫落酸(abscisic acid,ABA)和NaCl 的敏感性[30];CsHDA2與CsMYC2一起調控了茶綠葉蟬在侵染茶葉后誘導(E)-橙花醇的積累[31]。而HAT基因在茶樹中的研究還未見報道, 僅在近源物種油茶(CamelliaoleiferaAbel.)中發現CfGCN5對油茶炭疽病有調節作用[32]。本研究從茶樹基因組中鑒定克隆了2 個CsMCC基因, 并對其進行了全面的生物信息學分析和表達特性分析, 初步了解CsMCC基因的基本特征和功能特性, 可為茶樹HAT基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為西南大學試驗田種植的‘福鼎大白茶’ (Camelliasinensis(L.) O. Kuntze cv. ‘Fuding Dabaicha’)。取同一株茶樹上的花、成熟葉、莖和根用于CsMCC基因克隆和組織特異性分析; 分別取同一時期不同發育狀態的花、芽、葉和根用于CsMCC基因在各器官發育階段的表達分析, 其中不同發育階段的根部材料由‘福鼎大白茶’種子經萌發獲得,以上材料均保存5 份以上。茶樹CsMCC基因對外源GA3和IAA 的響應分析: 選擇健康且生長勢一致的2 年生福鼎大白茶扦插苗, 將茶苗根部泥土洗凈后放入裝有營養液的100 cm × 50 cm × 30 cm方盆中進行水培(每盆30 株, 共6 盆), 每盆中的茶苗分為對照組和試驗組, 茶苗預培養3 周后分別用100 mg L-1赤霉素(gibberellic acid, GA3)和50 mg L-1生長素(indole-3-acetic acid, IAA)溶液噴施茶苗葉片的正反面, 在噴施24 h 和48 h 后取一芽二葉樣, 以未經激素處理的茶苗為對照, 每個處理設置3 次重復。以上材料取下后均用錫箔紙包裹, 立即液氮速凍, 放于-80℃冰箱保存備用。

1.2 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 基因的克隆及生物信息學

以擬南芥AtMCC1 (AT3G02980)蛋白的氨基酸序列為參考, 在茶樹基因庫(tpdb.shengxin.ren)中進行Blast 搜索, 篩選相似性大于50%且具有GNAT 保守結構域的蛋白作為茶樹CsMCC 候選蛋白, 并下載其核苷酸和蛋白序列。根據CsMCC候選基因的核苷酸序列設計克隆引物(表 1), 以茶樹莖和花為cDNA 模板, 利用PCR 技術克隆茶樹CsMCC基因。

利用NCBI 數據庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的ORF Finder 和CD-search 功能分析茶樹CsMCC基因的開放閱讀框和蛋白結構域; 分別運用MapChart、Plantcare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-lab.org/index.php)軟件分析基因的染色體定位、啟動子順式作用元件和基因結構。利用SOPM (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)、TMHMM-2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)預測蛋白質的二級結構、三級結構、跨膜結構和保守基序特征; 使用ExPASy (https://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白質分子量和等電點等蛋白基本理化指標; 在STRING (https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=sTwl25wIT4pO&input_page_show_search=on)中利用模式植物擬南芥AtMCC1 蛋白的相互作用網絡構建茶樹CsMCC 蛋白的互作網絡圖;分別在擬南芥數據庫(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)和 Phytozome 數據庫(https://phytozomenext.jgi.doe.gov/blast-search)下載擬南芥AtHATs 家族成員和13 個不同植物中MCC 基因的蛋白質序列,采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)法構建進化樹; 在DNAMAN 軟件中對茶樹和其他同源物種的MCC 的蛋白質序列進行多序列比對分析。

1.3 茶樹CsMCC 蛋白的亞細胞定位

利用XbaI 和BamH I 酶雙酶切pAN580-EGFP載體, 利用 PCR 擴增(引物見表 1)獲得處理后的CsMCC基因擴增產物, 使用無縫連接試劑盒(BioRun)分別構建pAN580-CsMCC1-EGFP 和pAN580-CsMCC2-EGFP 融合表達載體。經DH5α 大腸桿菌(唯地生物)轉化和測序鑒定, 對序列正確的單克隆菌斑進行菌液擴繁并提取重組質粒。分別將膜共定位信號Marker 與pAN580-CsMCC1-EGFP、pAN580-CsMCC2-EGFP 重組質粒共轉化擬南芥原生質體, 28℃暗培養20 h 后, 在激光共聚焦顯微鏡(Nikon C2-ER) 下分別觀察CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的亞細胞定位熒光信號, 并照相。

1.4 茶樹CsMCC 基因的表達分析

采用植物RNA 快速提取試劑盒(艾德萊)提取茶樹各樣本RNA, RNA 質量檢測合格后使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (全式金)反轉錄為cDNA 作為模板。為研究CsMCC基因在茶樹生長發育中的作用, 采用qRTPCR 檢測了CsMCC基因在茶樹4 個組織器官和不同發育時期的花、芽、葉和根中的表達情況。為研究CsMCC基因對非生物脅迫和激素的響應情況,從茶樹數據庫中獲得轉錄組表達的相關數據, 由此分析了茶樹CsMCC基因在受到干旱、鹽、冷和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)脅迫后的表達情況, 此外還檢測了茶樹在外源GA3和IAA 處理后CsMCC基因的表達量。基于擴增獲得的CsMCC核苷酸序列, 利用Primer 3 設計qRT-PCR 引物(表1),以茶樹肌動蛋白基因CsACTIN為內參基因[33], 根據SoFast EvaGreen Supermix (美國伯樂)試劑說明書設置反應體系和反應程序。每個樣品包含3 次生物學重復, 每次重復含3 個平行, 采用2-ΔΔCT法計算相對表達量, 數據經標準歸一化處理后在TBtools軟件中繪制熱圖。

表1 PCR 擴增和基因表達分析的引物Table 1 Primers for PCR in tea plant

表2 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的理化性質Table 2 Physicochemical properties of CsMCC1 and CsMCC2 proteins in tea plant

2 結果與分析

2.1 茶樹MCC 基因的鑒定及克隆

以擬南芥AtMCC1 蛋白的氨基酸序列為參考, 在茶樹基因組數據中進行Blast 搜索, 共獲得2 個MCC同源蛋白(TEA029044 和TEA011651), 根據在染色體上的位置將其分別命名為CsMCC1 和CsMCC2。分別以茶樹莖和花的cDNA 為模板, 克隆獲得CsMCC1和CsMCC2基因片段(圖1-A), 其CDS 長度分別為774 bp 和810 bp, 分別編碼257 個和269 個氨基酸殘基, 蛋白分子質量分別為29.34 kD 和30.69 kD。染色體定位分析結果顯示, 2 個CsMCC基因分別定位于茶樹基因組的1 號和7 號染色體(圖1-B)。對茶樹CsMCC和擬南芥AtMCC1的基因結構進行分析(圖1-C)發現, 這2 個物種的MCC基因具有相同的外顯子-內含子分布模式, 均含有4 個內含子和5 個外顯子; 內含子相位類型高度一致, 即均有2 處“2”相位, 各有 1 處“0” “1”相位。CsMCC1 蛋白在185～209 aa 處存在 1 個跨膜結構(圖 1-D), 而CsMCC2 蛋白無跨膜結構。由表 2 可知, 茶樹CsMCC 蛋白的理論等電點分別為 9.44 和 8.22;CsMCC 蛋白不穩定指數分別為46.50 和46.13, 當不穩定指數小于 40 時為穩定蛋白; CsMCC1 和CsMCC2 蛋白親疏水性值分別為-45.97 和-0.921,均小于0 (圖1-E), 由此推測茶樹的2 個CsMCC 蛋白均為堿性不穩定親水性蛋白。

圖1 茶樹CsMCC 基因的克隆和理化性質分析Fig. 1 Cloning and physicochemical characterization of CsMCC genes in tea plant

2.2 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白系統進化及蛋白保守結構域分析

系統進化樹分析結果顯示, 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白與AtMCC1 同源, 屬于HAT 基因家族中的GNAT 亞家族(圖2-A), 且與葡萄(Vitisvinifera)、番茄(Solanumlycopersicum)、玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)的MCC 蛋白的親緣關系較近(圖2-B)。茶樹CsMCC 和擬南芥AtMCC1 蛋白的保守基序高度保守, 均含有Motif 1/2/3/5/6 基序, 且基序排序一致, 此外茶樹CsMCC 蛋白的C 端多了Motif 4 基序(圖3-A)。MCC 蛋白具有GNAT 亞家族典型的GNAT 保守結構域, 且該結構域跨越了4 個保守基序, 即包含完整的Motif 3、Motif 6 基序及部分Motif 1、Motif 2 基序(圖3-B, C)。基于茶樹CsMCC蛋白的親緣關系(圖2-B), 分析茶樹(CsMCC1/2)、擬南芥(AtMCC1)、葡萄(VIT_216s0039g01810)、番茄(Solyc03T002163)、玉米(Zm00001d017691)和水稻(LOC_Os02g46700)的MCC 蛋白同源序列(圖3-C),發現不同植物中MCC 蛋白序列高度保守, 同源性為65.85%, 茶樹與葡萄的MCC 蛋白序列一致性高達71.36%。

圖2 HAT 蛋白家族(A)和植物MCC 蛋白(B)的進化樹分析Fig. 2 Evolutionary tree of the HAT protein family (A) and plant MCC proteins (B)

2.3 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白二級結構、三級結構分析

茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的二級結構分析顯示(圖4-A), 各二級結構在2 個茶樹CsMCC 蛋白中的占比極為相似, 其中α-螺旋在CsMCC1和CsMCC2蛋白中的比例最大, 分別為35.41%和35.69%; 其次是自由卷曲, 分別為31.91%和31.97%; 延長鏈所占的比例分別為24.51%和22.68%, β-轉角所占的比例最小。以已知蛋白6th0.1 為模板構建蛋白三級結構(圖4-B)發現, CsMCC1 和 CsMCC2 蛋白與擬南芥AtMCC1 高度相似, 推測茶樹的2 個CsMCC 蛋白與模式植物中的MCC1 蛋白存在相似的生物學功能。

圖4 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的空間結構分析Fig. 4 Spatial structure analysis of CsMCC1 and CsMCC2 proteins

2.4 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的亞細胞定位分析

為明確茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白的功能,將CsMCC基因構建到pAN580-EGFP 表達載體, 并在擬南芥原生質體中瞬時表達。由圖5 可知, 通過激光共聚焦顯微鏡下觀察到pAN580-CsMCC1-GFP和pAN580-CsMCC2-GFP 融合蛋白在細胞質膜上具有明顯的綠色熒光信號, 且在細胞質膜上與膜定位marker 的紅色熒光共定位, 表明 CsMCC1 和CsMCC2 蛋白在細胞質膜上發揮生物學功能。

圖5 CsMCC 在擬南芥原生質體中的亞細胞定位Fig. 5 Subcellular localization of CsMCC in Arabidopsis protoplasts

2.5 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 基因的啟動子順式作用元件分析

為分析CsMCC1和CsMCC2基因在茶樹中的潛在功能, 利用PlantCARE 軟件分析了CsMCC1和CsMCC2基因上游2 kb 區域的啟動子序列。由圖6可知, 在茶樹CsMCC基因的啟動子序列中共發現31 種功能型順式作用元件, 按照功能將其分為了五大類: 逆境脅迫響應、光響應、植物激素響應、代謝調節和其他元件。參與逆境脅迫響應的元件數量和種類最多, 以MYB、MYC 和STRE 元件為主;其次為光響應元件, 包括 BOX 4、GT1-motif、TCT-motif 和G-box 等元件; 在植物激素類中包括響應生長素(AuxR-core)、茉莉酸甲酯(CGTCAmotif 和TGACG-motif)、水楊酸(TCA-motif)和脫落酸(ABRE)的元件; 參與代謝調節的元件以碳代謝(AAGAA-motif)和精氨酸代謝(O2-site)為主。此外, 茶樹CsMCC1 基因啟動子序列中的順式作用元件類型和數量比CsMCC2更豐富, 表明在茶樹中CsMCC1具有比CsMCC2參與更廣泛生理調節的潛能。

圖6 CsMCC 基因啟動子區域的順式作用元件分析Fig. 6 Cis-elements detected in the promoter of the CsMCC genes

2.6 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 基因的時空表達特異性分析

為明確CsMCC1和CsMCC2基因在茶樹生長發育過程中的調控作用, 本研究利用qRT-PCR 技術分析了CsMCC基因在茶樹不同組織部位及各器官在不同發育階段的表達模式。由圖7-A 可知,CsMCC基因在茶樹的花、葉、莖和根中均有表達, 但表達量的高低有所不同, 其中CsMCC1在莖中的表達量高于其他組織; 而CsMCC2在根中的表達量最高,在花、葉和莖的表達量幾乎持平。在茶樹芽的發育過程中(圖7-B),CsMCC1基因表達呈現先增加后減少的趨勢, 而CsMCC2基因隨著芽成熟度的增加表達量下調。在茶樹葉片的發育過程中(圖 7-C),CsMCC1基因均衡表達,CsMCC2基因有先下降后上升的趨勢并在老葉中表達量最高。在茶樹花的發育過程中(圖7-D),CsMCC1基因在茶樹花開放初期(Flower-I)的表達量遠高于后期的表達量;CsMCC2基因在花發育的Flowe-I、II 階段有相對較高的表達量, 其次為 Flower-IV、V 階段。由圖 7-E 可知,CsMCC1基因在茶樹幼根時期(Root I～III)有明顯地高表達, 隨著根部木質化程度的增加表達量下調;CsMCC2基因在茶樹根發育的Root I～V 階段均有較高的表達; 2 個CsMCC基因在根發育的VI 階段時的表達量均較低。說明CsMCC1基因更傾向在茶樹芽、花和根的幼嫩階段表達,CsMCC2基因可能在茶樹的根發育中有重要調控作用。

圖7 茶樹CsMCC 基因的時空特異性表達分析Fig. 7 Spatial-specific expression analysis of CsMCC genes in tea plants

2.7 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 基因對非生物脅迫和激素響應的表達特異性分析

為進一步分析CsMCC1和CsMCC2基因的功能,本研究基于TPIA 已公布的轉錄組數據和qRT-PCR技術分析了CsMCC基因在茶樹受到非生物逆境脅迫和外源激素處理下的表達情況(圖8)。在干旱脅迫(圖 8-A)和外源 GA3 激素(圖 8-E)處理條件下,CsMCC1和CsMCC2基因均被誘導上調表達。在鹽脅迫中(圖8-B),CsMCC1基因的表達受到明顯的抑制;CsMCC2基因在48 h 內表達上調, 72 h 時表達也受到抑制。經冷馴化后(圖8-C),CsMCC1基因被誘導表達上調, 而CsMCC2基因表達受到輕微抑制。在MeJA 處理條件下(圖8-D), 2 個CsMCC基因的表達量均在24 h 內受到抑制, 在48 h 后表達上調。在外源IAA 處理后(圖8-F), CsMCC1基因被明顯地誘導上調表達; 而CsMCC2基因的表達先受到輕微抑制, 在48 h 后也被誘導上調表達。說明CsMCC1和CsMCC2基因均能被非生物脅迫和激素誘導表達且具有不同的表達模式。

圖8 茶樹CsMCC 基因在非生物脅迫和激素處理下的表達分析Fig. 8 Relative expression pattern of CsMCC genes under different abiotic stresses and phytohormones in tea plant

圖9 CsMCC 蛋白的相互作用網絡分析Fig. 9 Functional interacting network of CsMCC proteins

2.8 茶樹CsMCC1 和CsMCC2 的蛋白關聯蛋白分析

利用擬南芥同源AtMCC 蛋白進行了CsMCC蛋白的關聯蛋白預測分析。由圖 9 可知, 茶樹CsMCC 蛋白與乙酰轉移酶相關的多種蛋白存在關聯性, 包含HAG1 (Histone acetyltransferase 1)、SGF29a/b (Saga associated factor 29 A/B) 、EMB2753 (Embryo defective 2753) 和 MAK10(MAK10 homologue)等蛋白, 此外還與細胞分化調節的CDC5 (Cell division cycle 5-like protein)蛋白具有相互作用, 進一步表明茶樹 CsMCC1 和CsMCC2 蛋白具有通過組蛋白乙酰化作用參與調控茶樹生命活動的潛能。

3 討論

MCC 是一類編碼GCN5-like N-乙酰轉移酶, 屬于HAT 家族的GNAT 亞家族[1], 植物中僅在模式植物擬南芥中有對AtMCC 基因功能的研究。本研究從茶樹中獲得2 個MCC基因(CsMCC1和CsMCC2), 其內含子-外顯子分布和剪接模式與擬南芥AtMCC1完全一致, 蛋白結構和序列與其他植物也高度保守,說明 MCC 同源蛋白在植物的進化過程中都是高度保守的, 可參與調控細胞減數分裂過程的細胞行為[28-29]。2 個茶樹MCC 蛋白均屬于堿性不穩定性親水蛋白,α-螺旋在其蛋白二級結構中的占比最高,這與HAT 家族蛋白的典型二級結構相似[34]。茶樹CsMCC1 和CsMCC2 蛋白序列包含5 個保守基序,GNAT 結構域跨越了其中的Motif 1～3 及Motif 6 基序。GNAT 亞家族蛋白在植物、酵母和動物中均具有保守的GNAT 結構域, 該結構域由A～D 4 個保守基序構成, 說明茶樹CsMCC 蛋白形成的復合物可能與動物和酵母類似[35-36]。Motif C 和D (茶樹Motif 1 和 3)在維持蛋白質穩定性方面起重要作用, 而Motif A 和B (茶樹Motif 6 和2)分別含有參與酰基輔酶A 和受體底物結合的殘基[37]。茶樹CsMCC1和CsMCC2 具有HAT 家族的GNAT 亞家族蛋白所需的必需結構元件, 具備植物組蛋白乙酰化酶的催化功能, 可以通過調控相關蛋白的乙酰化水平來調控其表達活性, 進而參與茶樹的生長發育等過程的調控。

HAT 蛋白家族被報道廣泛參與植物的形態建成、生長發育和逆境脅迫響應等調控過程[1]。小麥TaHAT基因在生長較快的組織中具有相對較高的表達水平, 且能夠被冷脅迫誘導表達[15]; 陸地棉GhHATs在營養(根、莖和葉)和生殖(花托、花瓣、雄蕊、雌蕊和花萼)器官中廣泛表達, 其表達也受到非生物脅迫和外源激素脅迫的誘導[38]; 栗子SiHAT2在葉片和莖中高表達, 但SiHAT4、SiHAT15和SiHAT18的轉錄水平非常低[34]; 麻CsHATs在雄花、根、莖、葉和種子中均具有較活躍的轉錄水平[16]。現有的文獻報道發現MCC1與細胞分裂相關[28-29],細胞分裂是植物有性生殖和生長發育的基礎, 一般發生在幼嫩組織和生殖器官, 在本試驗中發現CsMCC1基因在茶樹芽、花、根發育的幼嫩時期表達較高, 表明CsMCC1基因可能對茶樹的形態建成和生殖生長具有重要調控作用。GCN5 組蛋白乙酰轉移酶可通過調控PLETHORA基因的表達來調節根干細胞、分生區細胞的維持和伸長區細胞的增殖[26],CsMCC2基因在茶樹根部有最大表達量, 且在根發育過程的較長時期內均有相對較高的表達, 說明CsMCC2基因在茶樹根干細胞維持和根生長發育過程中發揮了重要作用。此外, 茶樹CsMCC1和CsMCC2基因的啟動子序列中包含多個逆境脅迫、激素響應和光響應順式作用元件, 且在轉錄組數據和表達分析中也發現茶樹CsMCC基因能被非生物脅迫和外源激素誘導表達。茶樹2 個CsMCC基因在干旱、外源GA3和IAA 激素脅迫下均被上調表達,而在鹽、冷和MeJA 脅迫中表現出不同的表達模式,表明2 個CsMCC基因在茶樹響應部分外界環境刺激時具有協同調節的能力, 而在一些環境脅迫時表現出不同的表達模式, 這更利于茶樹適應外界環境。

多種植物的HAT 蛋白被報道定位于細胞核, 少數定位于細胞質和葉綠體[12]。茶樹CsMCC1 蛋白和CsMCC2 蛋白則定位于細胞膜, 與其他植物中報道的HAT 的亞細胞定位不同。在CsMCC1 蛋白中還預測到1 個跨膜結構, 推測MCC 蛋白可能是通過調控位于細胞膜上的目標蛋白的乙酰化修飾水平來參與植物細胞的分裂和伸長過程, 但還需要通過更多的試驗數據來探索MCC 蛋白的具體調控途徑和蛋白作用網絡。本研究初步發現MCC 蛋白可以與HAG1、SGF29a/b、EMB2753 和MAK10 等多個蛋白具有相互作用和關聯性, 后續還將進一步驗證該關聯調控網絡。綜上, 茶樹CsMCC基因具有參與調控茶樹形態建成、生長發育和逆境脅迫響應等過程的潛能,但其詳細作用機理及其是否是通過乙酰化修飾作用參與調控還需要更深入的研究。

4 結論

本研究從茶樹中克隆獲得2 個MCC 類HAT 蛋白基因:CsMCC1和CsMCC2, 屬于堿性不穩定親水性蛋白, 均定位于細胞質膜。2 個CsMCC 蛋白在基因結構、蛋白結構及保守基序等方面與其他植物的MCC 蛋白高度保守, 含有典型的GNAT 保守結構域,且與葡萄和番茄的親緣關系較近。CsMCC1和CsMCC2基因的表達在茶樹中具有時空特異性, 且能夠受到非生物逆境脅迫(干旱、鹽和冷脅迫)和外源植物激素 (MeJA、IAA、GA3)的誘導表達。CsMCC1和CsMCC2 蛋白與乙酰化轉移酶相關的多個蛋白具有關聯性。綜上, 通過本研究推測茶樹CsMCC1和CsMCC2基因具有通過組蛋白乙酰化修飾作用參與茶樹的生長發育和非生物逆境脅迫響應過程的潛能。