甘蔗與斑茅雜交染色體組構成特征研究

薛 麗 李心怡 黃勇泰 歐財籃 吳小青 余澤懷 崔澤田張木清 鄧祖湖 余 凡,*

1 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室 / 廣西甘蔗生物學重點實驗室/廣西大學農學院, 廣西南寧 530004; 2 福建農林大學農學院國家甘蔗工程技術研究中心, 福建福州 350002

甘蔗(Saccharumspp.)作為最重要的糖料作物以及可再生能源作物[1], 可為全球提供約80%的食用糖產量。甘蔗病害是目前導致其產量損失的重要因素之一, 因此導入近緣野生種質血緣提高甘蔗抗性是育種家們努力的目標[2]。近幾十年來, 甘蔗的近緣屬種植物逐漸受到了甘蔗育種家們的關注, 河八王屬(Narenga)、蔗茅屬(Erianthus)、芒屬(Miscanthus)等成為拓寬甘蔗遺傳基礎的重要種質資源[3]。其中,斑茅(Tripidiumarundinaceum)因具有生長旺盛, 抗旱耐貧, 抗病好, 抗蟲性強, 適應性廣, 宿根性強等優異性狀獲得了國內外學者的親睞[4]。育種者們期望通過引入野生種質資源斑茅的優良性狀對甘蔗進行遺傳改良, 將優良的基因引入甘蔗以獲得抗逆、高產、高糖的優良品種[5]。

由于甘蔗細胞的多倍性和異質性, 基因組龐大,染色體數目多等特點[6-7], 使甘蔗的分子細胞遺傳學方面的研究受到了一定阻礙, 特別是在染色體構成及遺傳機制方面未有重大突破。而在甘蔗的遠緣雜交過程中, 雙親的染色體在后代材料中的傳遞方式復雜, 熒光原位雜交技術逐漸成為揭示甘蔗雜交后代親本染色體遺傳的有效手段[8]。甘蔗屬間雜種的細胞學研究表明, 甘蔗遠緣雜交后代染色體遺傳具有n+n、2n+n、n+2n等多種復雜的傳遞方式[9-14], 這種配子數目常有增減的現象被稱為“不平衡遺傳”。Li 等[15]應用FISH 技術觀察到甘蔗與斑茅雜交F1在減數分裂過程中存在染色體滯后、不同步、微核、不能形成細胞板等多種異常現象。Piperidis 等[16]試驗結果表明斑茅甘蔗BC1染色體遺傳為2n+n。但Wu 等[17]研究表明, 甘蔗與斑茅雜交BC1后代不止存在2n+n的遺傳方式, 還出現超2n+n的染色體傳遞現象。陳健文等[18]利用 GISH (genomic in situ hybridization, GISH)技術對來自崖城96-40 × CP84-1198 組合的后代進行鑒定, 后代中來自斑茅的染色體從BC1到BC2的染色體傳遞也基本符合n+n方式。Huang 等[19]研究甘蔗與斑茅雜交后代染色體的遺傳方式時, 結果顯示BC2和BC3代染色體傳遞基本符合n+n遺傳, 但部分后代斑茅染色體發生丟失, 除此之外還發現了斑茅與甘蔗雜交后代發生了可遺傳的易位現象。因此, 甘蔗與斑茅不同雜交后代的染色體組結構特征具有明顯差異, 進一步研究不同雜交組合高世代的斑茅染色體組組成對于分析不同數量的斑茅染色體對農藝性狀的表現具有重要意義。

由于不同野生近緣屬血緣的滲入, 加大了甘蔗與斑茅雜交后代組成鑒定分析的難度。利用特異重復序列和基因組探針的FISH (Fluorescence in situ hybridization, FISH)技術成為了高效區分甘蔗遠緣雜交后代中染色體組結構特征的有效工具。本研究應用斑茅特異性引物和特異的FISH 探針, 對甘蔗與斑茅雜交高世代材料快速進行了真實性鑒定并分析了其染色體組的結構特征, 為今后進一步揭示斑茅的染色體對甘蔗抗性表型貢獻奠定了細胞遺傳學基礎, 為高效利用斑茅種質資源提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取用斑茅原始種海南92-77 (2n= 6x= 60), 甘蔗熱帶種拔地拉 (2n= 8x= 80), 甘蔗割手密種Np-X (2n= 4x= 40), 甘蔗栽培種柳城05-136 (母本,♀)與前課題組創制斑茅與甘蔗雜交無性系BC3材料崖城05-164 (父本, ♂)及第89 批次雜交后代組合BC4材料(89 組合)為研究對象, 所有材料均保育在廣西大學扶綏農科新城甘蔗研究基地(圖1 和表1)。

表1 供試材料Table 1 Experimental materials in this study

圖1 甘蔗與斑茅雜交系譜圖Fig. 1 Hybridized pedigree chart between sugarcane and T.arundinaceum

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA 提取及雜交后代真實性分子鑒定 參考Mace 等[20]改良的CTAB 法提取供試材料葉片的基因組DNA。以斑茅雜交后代材料DNA 為模板, 經過已開發設計的1 對斑茅物種特異重復序列分子標記引物(AGRP-52 和AGRP-53)擴增出含有斑茅血緣的目的條帶[21]。反應總體系為10 μL, 包括50 ng μL-1基因組DNA 1 μL, 2×RapidTaqMaster Mix 5 μL, 上、下游引物(10 μmol L-1)各1 μL, ddH2O 2 μL。擴增程序: 95℃預變性3 min; 95℃變性30 s, 52℃退火20 s, 72℃延伸20 s, 32 個循環; 72℃終延伸3 min。

1.2.2 根尖細胞培養與染色體制片 中期染色體制片參考Braz 等[22]和Yu 等[23]研究方法, 截取適當蔗節在營養土中進行培根, 剪取約1 cm 健壯根尖于對二氯苯-α-溴代萘溶液中避光處理2.5～3 h, 再用無水乙醇和冰醋酸(3∶1)溶液固定過夜, 固定后可用75%酒精保存。處理后的根尖用刀片切成薄厚均勻的小塊, 再使用適量的果膠酶和纖維素酶制備成混合液在37℃恒溫箱酶解去除細胞壁4 h, 吸去酶液后用現配的固定液反復吸打成細胞懸液, 最后吸取適量細胞懸液均勻涂抹在載玻片上制備成中期玻片。

1.2.3 探針制備 采用CTAB 法提取的斑茅原始種海南92-77 (2n= 6x= 60)基因組, 使用缺口平移法以斑茅基因組 DNA 為模板與酶切混合溶液在15℃酶切2 h 40 min, 將基因組序列酶切至大小約200～600 bp (表2)。割手密特異重復序列探針參考Huang 已發表的引物序列進行克隆, 將提取的質粒采用缺口平移法進行制備[24](表2)。

表2 基因組探針制備體系Table 2 Genomic probe preparation system

1.2.4 熒光原位雜交及數據分析 每個編號材料選取3～5 個形態完整良好的中期細胞進行FISH, 具體方法參考Meng 等[25], 略微修改。雜交前先用HCl(0.01 mol L-1)和胃蛋白酶 (10 μg mL-1) (99 ∶1)處理1 h 30 min, 用2×SSC 清洗, 3×3 min; 用100 μL 的4%多聚甲醛固定形態5 min, 1×PBS 清洗, 3×3 min;清水洗凈晾干, 依次用75%、100%酒精脫水3 min后晾干; 接著用70%甲酰胺(FD)于70℃變性1 min 40 s; 加熱后依次轉置-20℃的70%酒精、95%酒精、100%酒精內浸泡 4 min; 晾干后加入雜交液含有5 μL FD、2 μL 50% DS、1 μL 20×SSC、1 μL 基因組探針, 蓋上蓋玻片, 37℃溫育過夜。雜交后室溫2×SSC、42℃預熱的2×SSC 和室溫1×PBS 分別漂洗5 min、10 min 和3 min, 漂洗結束后用清水潤洗, 風干; 最后滴加10 μL DAPI, 蓋上蓋玻片, 后于奧林巴斯BX53 正置熒光顯微鏡(https://om-digitalsolutions.cn/)下觀察。捕獲到的信號通過ImageJ (https://imagej.net/ij/)和Photoshop CS6 (https://www.adobe.com/cn/products/photoshop.html)處理。熱帶種、割手密及重組血緣的判定參考Huang 等[24]和Wang 等[26]的方法,具有完整或著絲粒區域明顯分布割手密特異重復序列信號的判定為割手密染色體, 具有完整或著絲粒區域分布斑茅基因組雜交信號的染色體判定為斑茅染色體; 未分布割手密、斑茅雜交信號判定為熱帶種染色體, 含有割手密特異重復序列、斑茅基因組雜交信號但不包含著絲粒區域的判定為重組染色體。

2 結果與分析

2.1 親本染色體構成分析

對親本染色體構成進行鑒定能夠更好的探究在甘蔗與斑茅遠緣雜交中斑茅染色體的遺傳特征。本試驗通過斑茅基因組探針與割手密特異探針對父本材料YCE05-164 與母本材料LC05-136 進行染色體分型。結果表明, 在YCE05-164 中, 具有斑茅染色體15 條, 占全基因組的13.04%, 而母本LC05-136未攜帶斑茅染色體(圖2-a)。進一步統計了YCE05-164 中熱帶種血緣, 割手密血緣與重組血緣占比分別為64.35%、12.17%和10.43% (圖2-b); 而LC05-136中, 熱帶種血緣占比為63.89%, 割手密血緣占比為15.74%, 兩者間的染色體重組占比為20.37% (圖2-a)。

圖2 崖城05-164 和柳城05-136 的染色體組成鑒定Fig. 2 Identification of chromosomal composition of YCE 05-164 and LC 05-136

2.2 斑茅特異引物鑒定甘蔗與斑茅雜交后代材料的真實性

為快速鑒定得到甘蔗與斑茅雜交真實后代材料,利用斑茅的特異重復序列引物 A G R P-5 2 和AGRP-53 對31 份后代材料進行初步鑒定。1.5%的凝膠電泳結果顯示(圖3), 利用特異引物可對含斑茅血緣的材料擴增出約350 bp 的特異條帶, 而熱帶種Badila、割手密Np-X、LC 05-136 均檢測不出條帶,說明該引物對檢測斑茅血緣材料具有可靠性。泳道31 為YCE89-66 編號材料, 分子標記初步鑒定其為假的斑茅后代, 結合GISH 結果最終確定為假種, 其余材料均為真種, 真實率為96.77%。

圖3 甘蔗與斑茅BC4 雜交后代PCR 產物電泳檢測Fig. 3 Electrophoretic detection of PCR products of the BC4 hybrid between sugarcane and T. arundinaceum

2.3 甘蔗與斑茅雜交后代GISH 鑒定

使用制備的斑茅基因組探針對31 份BC4材料進行GISH 鑒定分析發現, 雜交后代中30 份材料為甘蔗與斑茅的真實雜交后代, 均含有斑茅染色體, 與PCR 鑒定結果一致。此外, 30 份甘蔗與斑茅雜交后代中斑茅染色體數目具有明顯差異, 根據斑茅染色體數目可分為6 種類型, 分別為6 條斑茅(圖4); 7 條斑茅(圖5); 8 條斑茅(圖6); 9 條斑茅(圖7); 1、10 條斑茅染色體(圖8); 未含斑茅染色體材料結果與分子標記鑒定一致(圖8-c)。

圖4 甘蔗與斑茅雜交后代中包含6 條斑茅染色體Fig. 4 Hybrid between sugarcane and T. arundinaceum contained six chromosomes of T. arundinaceum

(圖5)

圖6 含8 條斑茅染色體的雜交后代Fig. 6 Hybrid between sugarcane and T. arundinaceum contained eight chromosomes of T. arundinaceum

(圖7)

圖8 含0、1 和10 條斑茅染色體的雜交后代Fig. 8 Hybrid between sugarcane and T. arundinaceum contained zero, one, and ten T. arundinaceum chromosomes

2.4 甘蔗與斑茅雜交后代遺傳與結構分析

2.4.1 甘蔗與斑茅雜交后代群體染色體遺傳分析

我們感興趣的是, 斑茅染色體傳遞給后代的遺傳特征。為此, 本研究對甘蔗與斑茅雜交后代群體進行了斑茅染色體遺傳統計(圖9)。通常情況下, 配子體一半的遺傳物質源自于母本, 一半源自于父本。根據上述結果可知, LC05-136 作為母本未攜帶斑茅染色體, 表明其后代的斑茅染色體均來自于父本YCE05-164。其中, 父本YCE05-164 攜帶的15條斑茅染色體以7 條和8 條2 種均等分離的遺傳類型進行向后代傳遞的比例占該群體的60.00%。在以非均等分離方式傳遞斑茅染色體, 后代繼承父本斑茅染色體數目主要為6 條和9 條2 種類型, 占整個群體的33.33%, 而1 條和10 條斑茅染色體兩種遺傳類型在群體中各占3.33% (圖10-a)。表明, 盡管在后代斑茅染色體遺傳數目存在大量的分離, 但在對子代傳遞的斑茅染色體主要服從n+n的遺傳方式。

圖9 甘蔗與斑茅雜交后代BC4 群體斑茅染色體遺傳圖譜Fig. 9 Chromosome genetic mapping of T. arundinaceum from the BC4 population between sugarcane and T. arundinaceum

圖10 甘蔗與斑茅真實雜交后代染色體遺傳特征Fig. 10 Chromosomal genetic characteristics of the true progenies between sugarcane and T. arundinaceum

2.4.2 甘蔗與斑茅雜交后代群體染色體結構分析

利用遠緣雜交將野生種質的優良抗性導入作物內, 這一過程中基因之間交流與重組的程度是決定品種種質的關鍵。為了進一步探究斑茅染色體與甘蔗之間的重組特征與規律, 基于上述結果對完整斑茅的染色體、斑茅與甘蔗染色體重組進行統計(圖10-b)。結果表明, 在30 份真實后代群體中, 斑茅與甘蔗染色體出現易位的概率為16.67% (圖10-b)。其中, 有3 份材料出現斑茅染色體與熱帶種染色體易位, 1 份材料出現斑茅與熱帶種割手密重組染色體易位, 1 份材料出現斑茅與割手密染色體重組(圖9和圖11)。斑茅與三者染色體發生易位的材料數目比例為3∶1∶1 (圖11), 這基本與近現代栽培甘蔗的血緣占比一致, 表明斑茅染色體與甘蔗不同血緣的染色體發生易位重組的概率基本相同。

圖11 甘蔗斑茅雜交后代群體材料中鑒定的染色體易位Fig. 11 Chromosomal translocations identified in population from the progeny between sugarcane and T. arundinaceum

2.4.3 甘蔗與斑茅雜交后代群體血緣結構分析

以母本LC05-136 為參考, 統計后代群體的血緣結構, 并比較各個基因型與親本的差異(表3)。結果表明, 群體熱帶種血緣占比介于55.36%～65.77%之間, 相較于母本, 整體降低; 重組血緣(熱帶種與割手密重組), 平均為 14.71%, 相較于母本的重組率占比降低 5.66%; 割手密占比介于 14.55%～21.05%, 平均為17.59% (圖10-c), 相較母本和父本顯著增加。說明當斑茅染色體導入近現代栽培甘蔗中, 其熱帶種血緣與重組血緣下調, 而割手密血緣有所提高。

表3 甘蔗與斑茅雜交后代BC4 的染色體組成Table 3 Chromosomal composition of BC4 in the hybrid from sugarcane × T. arundinaceum

3 討論

近緣屬野生種質資源一直是作物遺傳改良的重要途經, 如小麥與長穗偃麥草雜交獲得的代換系7E2/7D 和7E1/7D 染色體上含有植物中偃麥草屬特有的Fhb7基因, 該基因對小麥赤霉病具有廣譜抗性[27]。Li 等[28]應用墨西哥黑麥和普通小麥雜交, 成功創制出一個新的小麥衍生系D27, 比普通小麥具有更高的分蘗以及更突出的白粉病、條銹病抗性。早期分子結果表明, 甘蔗和斑茅遺傳距離較遠[29],因此認為它們很難發生染色體重組現象。斑茅作為甘蔗重要的近緣屬野生種質資源, 其雜交育種進程緩慢, 這也可能與血緣間重組率低以及未形成有效重組有關。Piperidis 等[16]對甘蔗斑茅3 個世代材料進行鑒定分析, 也未在其BC1和BC2發現甘蔗與斑茅的染色體交換現象。在本研究中, 我們發現甘蔗與斑茅的BC4群體材料中存在部分斑茅染色體的交換現象, 占后代群體材料的16.67%, 這表明利用含斑茅的親本與甘蔗栽培種回交獲得高世代材料過程中成功滲入了斑茅的血緣, 為后續結合群體重要農藝性狀篩選有益斑茅血緣奠定了細胞遺傳學基礎。

作物雜交育種過程中會存在不同的染色體遺傳方式, 而后代的染色體遺傳差異最終也會導致表型的多樣性。Li 等[15]通過對甘蔗與斑茅雜交后代F1的減數分裂不同時期進行觀察, 發現F1代材料中的斑茅染色體在減數分裂過程中出現了大量不正常的現象。在本研究中, 親本YCE05-164 含有15 條斑茅血緣染色體, 與LC05-136 雜交后代群體中斑茅血緣染色體包含1、6、7、8、9、10 條不同數目類型。這些結果表明甘蔗與斑茅在雜交過程中, 由于它們親緣關系較遠導致了其減數分裂染色體配對異常,產生的配子存在較大的多樣性。而基于這些細胞遺傳學結果, 提高培育包含斑茅不同染色體數目類型的雜交后代材料, 有助于篩選包含斑茅血緣的優異雜交親本。

對于屬間雜交來說, 結合作物不同遺傳背景及其農藝性狀表型差異, 鑒定并挖掘優異野生種質資源血緣基因十分重要。Babil 等[30]報道, 斑茅的染色體和某些農藝性狀之間存在明顯的正相關, 產量相關性狀如干物質產量、有效莖重、單莖重和莖直徑,斑茅染色體數目與糖和纖維含量無明顯關系, 其中約n= 30 斑茅染色體數目的斑茅屬間雜種在糖分和纖維數據上表現出良好的變化。因此對于高世代的斑茅雜交后代來說, 選擇高糖分和纖維表現更好的材料作為回交親本是非常必要的。本研究中的YCE05-164 與LC05-136 雜交后代89 組合中斑茅染色體與甘蔗染色體發生了重組且遺傳類型豐富。今后可結合重要農藝性狀差異進一步挖掘其有益的斑茅基因或染色體片段, 為提高斑茅雜交利用效率奠定基礎。

4 結論

本研究以甘蔗與斑茅雜交BC4群體為研究對象,利用FISH 手段揭示了斑茅染色體在后代的遺傳特征與后代群體染色體構成。結果表明, 斑茅染色體在后代雜交群體主要以n+n的遺傳方式, 占整個群體的60%。在減數分裂過程中, 有40%出現非均等分離且被遺傳至子代。在這一過程中, 甘蔗與斑茅發生染色體水平的重組有16.67%, 并且斑茅與不同血緣甘蔗重組的概率趨近一致。斑茅血緣的導入降低了近現代栽培甘蔗中熱帶種血緣與重組血緣的占比, 并同時提高了割手密血緣的比例。利用分子細胞遺傳學的手段對甘蔗與斑茅雜交世代群體的染色體遺傳與構成研究, 為進一步提高斑茅在甘蔗遠緣雜交的利用奠定了分子細胞遺傳學基礎。