老年乳腺癌組織中PTBP3、USP28表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

張小雪,劉曉婷,李陽(yáng),于韜,鄔曉明,高巋然

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,我國(guó)乳腺癌發(fā)病率52.81/10萬(wàn),死亡率約13.40/10萬(wàn)[1]。近年來(lái)隨著人口老齡化,60歲以上老年乳腺癌患者患病例數(shù)逐漸增多[2]。多聚嘧啶結(jié)合蛋白3(polypyrimidine tract binding protein 3,PTBP3)是一種RNA結(jié)合蛋白,通過(guò)RNA識(shí)別基序與RNA相互作用,在RNA剪接、成熟、定位和翻譯中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。研究表明,PTBP3的表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展有關(guān),如乳腺癌中PTBP3的高表達(dá)能阻止ZEB1 mRNA降解來(lái)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展[4]。泛素特異性蛋白酶28(ubiquitin specific peptidase 28,USP28)是去泛素化蛋白水解酶家族成員,主要表達(dá)于心臟和肌肉中,參與DNA損傷、細(xì)胞凋亡等過(guò)程的調(diào)控[5]。研究表明,USP28能夠穩(wěn)定促癌蛋白賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的肝細(xì)胞樣特征和腫瘤惡性進(jìn)展[6]。目前PTBP3、USP28在老年乳腺癌患者中的表達(dá)及臨床意義尚不明確。本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌組織中PTBP3、USP28表達(dá),分析兩者與臨床病理特征的關(guān)系及在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的評(píng)估價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年2月—2020年2月遼寧省腫瘤醫(yī)院乳腺外科診治老年乳腺癌患者178例,均為女性,年齡60～81(68.41±7.63)歲;病程6～58(12.14±6.89)d;合并高血壓42例、糖尿病21例;有乳腺癌家族史4例;病理類型:浸潤(rùn)性癌88例,非浸潤(rùn)性癌90例;腫瘤分化程度:高分化40例,中分化68例,低分化70例;腫瘤TNM分期:Ⅱ期92例,Ⅲ期86例;根據(jù)病理檢查中雌激素受體、孕激素受體及表皮生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)情況,分為L(zhǎng)uminal A型53例,Luminal B型50例,HER2型36例,三陰性型39例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(201705K1),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①均接受乳腺癌改良根治術(shù)治療,經(jīng)術(shù)后病理組織檢查明確診斷為乳腺癌;②首次診治,術(shù)后結(jié)合放療及化療;③臨床和病理資料完整;④年齡≥60歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①男性患者;②合并急慢性炎性疾病或自身免疫性疾病;③合并其他惡性腫瘤;④雙側(cè)乳腺癌或腫瘤已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 組織中PTBP3、USP28表達(dá)檢測(cè):采用免疫組織化學(xué)法,試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司,貨號(hào) PV-9004。留取術(shù)中獲取的癌和癌旁組織,分別約100 mg,以10%中性甲醛固定,石蠟包埋切片,65℃烤片2 h,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,檸檬酸鹽溶液中微波爐中抗原熱修復(fù)10 min,3%雙氧水消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,3%羊血清封閉2 h,加入兔抗人PTBP3單克隆抗體(稀釋比為1∶200,購(gòu)自賽默飛公司,貨號(hào)PA5-30344),USP28單克隆抗體(稀釋比為1∶100,購(gòu)自Abcam公司,貨號(hào)ab70893),4 ℃孵育16 h,二抗室溫孵育2 h,DAB顯色10 min,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,自來(lái)水中返藍(lán)。在光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號(hào)BX43)下觀察進(jìn)行半定量染色評(píng)分,染色強(qiáng)度(0分:無(wú)染色,1分:淺黃色,2分:棕褐色),染色面積(0分:≤25%,1分:>25%～50%,2分:>50%)。兩項(xiàng)乘積為最終免疫組化評(píng)分,<2分判定為陰性,≥2分判定為陽(yáng)性。

1.3.2 隨訪:所有患者以門診復(fù)診及電話回訪方式進(jìn)行隨診,隨訪3年,第1年每3個(gè)月隨訪1次,第2～3年每6個(gè)月隨訪1次。隨訪截止至2023年3月1日。記錄末次隨訪時(shí)間,患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時(shí)間。隨訪終點(diǎn)為患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或隨訪時(shí)間結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示,2組樣本率(%)比較采用卡方檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析PTBP3、USP28表達(dá)對(duì)老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響;單因素及多因素Cox回歸分析影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織中PTBP3、USP28表達(dá) 乳腺癌組織中PTBP3棕褐色陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核;USP28棕褐色陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)。乳腺癌組織中PTBP3、USP28陽(yáng)性率分別為65.17%(116/178)、67.42%(120/178),顯著高于癌旁組織12.92%(23/178)、11.24%(20/178),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=102.080/<0.001、117.725/<0.001)。

圖1 乳腺癌和癌旁組織中PTBP3、USP28表達(dá)(免疫組化染色,×200)Fig.1 Expression of PTBP3 and USP28 in breast cancer and adjacent tissues (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 乳腺癌中PTBP3、USP28表達(dá)在不同臨床病理參數(shù)中的差異 乳腺癌組織中PTBP3、USP28陽(yáng)性率在 TNM分期Ⅲ期、中低分化程度高于TNM分期Ⅱ期、高分化程度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌中PTBP3、USP28表達(dá)在不同臨床病理參數(shù)中的差異比較 [例(%)]Tab.1 Comparison of PTBP3 and USP28 expressions in different clinicopathological parameters in breast cancer

2.3 PTBP3、USP28表達(dá)對(duì)老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響 178例患者隨訪3年,失訪1例,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移38例。3年無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為78.53%(139/177)。3年無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率PTBP3陽(yáng)性組為70.43%(81/115),低于陰性組的93.55%(58/62)(Log Rankχ2=12.521,P<0.001);3年無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率USP28陽(yáng)性組為72.27%(86/119),低于陰性組的91.38%(53/58)(Log Rankχ2=8.511,P=0.003),見(jiàn)圖2。

圖2 PTBP3、USP28表達(dá)對(duì)老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響Fig.2 Effect of PTBP3 and USP28 expression on postoperative recurrence and metastasis of elderly breast cancer patients

2.4 多因素Cox回歸分析影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素 以老年乳腺癌患者是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移為因變量(1=是,0=否),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示: PTBP3陽(yáng)性、USP28陽(yáng)性、腫瘤分期Ⅲ期、中低分化程度是影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,見(jiàn)表2。

表2 多因素Cox回歸分析影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素Tab.2 Multifactor Cox regression analysis of factors affecting postoperative recurrence and metastasis of elderly breast cancer patients

3 討 論

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤,是全球范圍內(nèi)女性癌癥相關(guān)死亡的首要原因[7]。手術(shù)聯(lián)合輔助化療和放療能夠有效提高乳腺癌患者生存率,但老年乳腺癌患者具有重要器官功能衰退、合并基礎(chǔ)疾病增多及手術(shù)耐受力變差等特點(diǎn),容易發(fā)生術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]。因此,尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)老年乳腺癌預(yù)后的指標(biāo),對(duì)于選擇個(gè)體化的治療方案,減少術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生,具有重要意義。

PTBP3屬于多嘧啶序列結(jié)合蛋白家族成員,其作為RNA 結(jié)合蛋白,在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),PTBP3在胃癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)升高[9-10],其能上調(diào)TWIST等基因的表達(dá),促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。本研究中,乳腺癌組織中PTBP3陽(yáng)性表達(dá)率更高,提示PTBP3參與乳腺癌的腫瘤發(fā)生。乳腺癌中PTBP3的表達(dá)受缺氧微環(huán)境的調(diào)節(jié)。有學(xué)者報(bào)道,乳腺癌中缺氧微環(huán)境能夠促進(jìn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA BCRT1的過(guò)度表達(dá),其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA-1303,阻止PTBP3 mRNA的降解,導(dǎo)致乳腺癌中PTBP3蛋白表達(dá)升高,PTBP3一方面促進(jìn)乳腺癌腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和侵襲,還能夠通過(guò)外泌體途徑,介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化,降低機(jī)體抗腫瘤的免疫殺傷作用,促進(jìn)乳腺癌腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤過(guò)度增殖[11]。本研究中,PTBP3表達(dá)與乳腺癌不良臨床病理特征有關(guān),提示PTBP3的表達(dá)參與促進(jìn)乳腺癌的腫瘤進(jìn)展。有研究報(bào)道,PTBP3能夠通過(guò)結(jié)合ZEB1 mRNA的3’非編碼區(qū),阻止其降解,ZEB1作為轉(zhuǎn)錄因子,能夠上調(diào)間質(zhì)性標(biāo)志物N-鈣黏素及波形蛋白等的表達(dá),誘導(dǎo)乳腺腫瘤細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和干細(xì)胞特性形成,增強(qiáng)乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致腫瘤TNM分期增高,降低腫瘤細(xì)胞的分化程度[12]。本研究中,PTBP3陽(yáng)性老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,表明PTBP3表達(dá)有助于評(píng)估老年乳腺癌患者預(yù)后。分析其原因,一方面是PTBP3陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng),肉眼難以分辨的微小轉(zhuǎn)移病灶術(shù)中難以徹底切除,造成術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[13]。另一方面可能是PTBP3陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)干細(xì)胞特征,對(duì)紫杉醇等化療藥物的耐藥性增強(qiáng),老年乳腺癌患者術(shù)后輔助化療治療的敏感性降低。研究發(fā)現(xiàn),PTBP3能夠與自噬相關(guān)蛋白-12 mRNA的3’-非編碼區(qū)中的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合,導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白-12的過(guò)度表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞自噬,增加腫瘤細(xì)胞對(duì)吉西他濱等化療藥耐藥性的形成[14]。因此,PTBP3可能是新的評(píng)估老年乳腺癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

USP28基因位于人類11號(hào)染色體,具有N端泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能夠輔助識(shí)別和招募泛素鏈底物,發(fā)揮去泛素水解酶的活性。研究表明,USP28在肺鱗癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá),其能夠增強(qiáng)叉頭盒C1等癌基因的蛋白穩(wěn)定性,促進(jìn)腫瘤有氧糖酵解,促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[15-16]。本研究中,乳腺癌組織中USP28陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁組織更高,與腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān),表明USP28參與乳腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展。乳腺癌中USP28的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子1α的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌缺氧環(huán)境會(huì)上調(diào)腫瘤細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá),缺氧誘導(dǎo)因子1α能夠通過(guò)激活SUMO特異性蛋白酶1,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)USP28的表達(dá)[17]。另外,USP28作為具有腫瘤促進(jìn)作用的去泛素化酶,進(jìn)一步促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的去泛素化修飾,增加缺氧誘導(dǎo)因子-1α的穩(wěn)定性,激活下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等促癌基因表達(dá),導(dǎo)致腫瘤血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。Chen等[18]發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞衍生的外泌體顯著促進(jìn)了乳腺癌MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞中miR-500a-5p的表達(dá),miR-500a-5p與USP28結(jié)合協(xié)同促進(jìn)腫瘤增殖。本研究中,USP28陽(yáng)性老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)明顯增加,提示USP28是新的評(píng)估老年乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)后腫瘤標(biāo)志物。研究表明,USP28的表達(dá)升高能夠募集到DNA損傷位點(diǎn),增強(qiáng)DNA 重組修復(fù)基因Np63的表達(dá),降低對(duì)順鉑等化療治療的敏感性[19]。尚有研究證實(shí),應(yīng)用USP28特異性抑制劑能夠增強(qiáng)p53蛋白穩(wěn)定性,促進(jìn)DNA損傷中p53依賴的G2/M期阻滯,增加放化療治療的敏感性[20]。因此,乳腺癌中USP28的表達(dá)促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展,可能是評(píng)估老年乳腺癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述,老年乳腺癌組織中PTBP3、USP28表達(dá)升高,與腫瘤TNM分期、腫瘤分化程度有關(guān),均參與老年乳腺癌的腫瘤進(jìn)展。PTBP3陽(yáng)性、USP28陽(yáng)性是影響老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,是新的評(píng)估老年乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)志物。本研究也存在局限,樣本量有限,未能對(duì)不同臨床特征的患者進(jìn)行分層研究,有待今后設(shè)計(jì)大樣本前瞻性多中心臨床研究,進(jìn)一步研究?jī)烧叩呐R床價(jià)值。

利益沖突:所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張小雪:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫;劉曉婷:實(shí)施研究過(guò)程,數(shù)據(jù)收集,分析整理;李陽(yáng):課題設(shè)計(jì),收集病例,資料整理收集,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);于韜:論文審核,論文修改;鄔曉明:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,資料整理收集;高巋然:提出研究思路,課題設(shè)計(jì),論文修改