基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗心血管疾病作用機(jī)理研究

邢炎華 張建 黃壯壯， 王程 李煒 劉峰，

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全世界每年約有1 750 萬人死于心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD），而這一數(shù)字到2030 年將會達(dá)到2 420 萬[1]。CVD 的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，研究顯示其致病因素涉及遺傳、環(huán)境等諸多方面，所以單一的用藥治療方式難以取得理想效果。中藥復(fù)方在預(yù)防和治療CVD 方面具有很大的潛力[2，3]，因?yàn)槠渚哂卸喟悬c(diǎn)和多通道整體調(diào)節(jié)作用。

補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒為證候類中藥新藥復(fù)方制劑，由紅芪、三七、澤瀉、當(dāng)歸、川芎、蟬蛻組成，主要治療氣虛血瘀證，具有化毒通絡(luò)、補(bǔ)氣活血的功效。該藥為步長公司目前在研的治療證候類疾病的一款新藥，前期通過動物藥效學(xué)試驗(yàn)研究，結(jié)果也表明補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒具有補(bǔ)氣活血，化毒通絡(luò)之功效，可用于心肌缺血、腦梗死、糖尿病腎病等多種疾病中氣虛血瘀證的治療。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計算機(jī)等多門學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，系統(tǒng)地闡明了藥物在機(jī)體中的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)重在強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)性，與中醫(yī)理論的“整體觀”相一致[4，5]。臨床顯示中醫(yī)補(bǔ)氣活血法治療冠心病、糖尿病、高血壓等療效較好[6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒治療CVD 的藥效成分及其作用機(jī)制，以期為證侯類中藥復(fù)方的藥效成分探析提供一種研究路徑。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫建立前期利用UPLC-Q-TOF-MSE 技術(shù)對補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，共鑒定72 個化合物。使用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）收集其化學(xué)成分，建立其成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 ADME 潛在活性成分預(yù)測利用計算機(jī)技術(shù)對補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中的物質(zhì)進(jìn)行ADME 預(yù)測和初篩，同時利用王永華等[7]建立的obioavail 1.1和pre-Caco-2 預(yù)測模型對成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中的物質(zhì)口服生物利用度（OB，OB ≥30%）和Caco-2（Caco-2≥-0.40）進(jìn)行計算和篩選，預(yù)測出潛在活性成分。

1.3 靶點(diǎn)-疾病從UniProt 數(shù)據(jù)庫篩選出與CVD相關(guān)的基因信息，再通過TTD 數(shù)據(jù)庫篩選出與CVD 基因信息相關(guān)的藥物作用靶點(diǎn)，從而得到補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的靶標(biāo)。

1.4 成分-靶點(diǎn)構(gòu)建與蛋白互作（PPI）分析基于篩選的活性物質(zhì)與相關(guān)靶點(diǎn)，利用生物信息學(xué)（Cytoscape3.6.1）軟件構(gòu)建成分與靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，同時利用軟件相關(guān)插件對成分與靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的參數(shù)（度、介數(shù)中心數(shù)）進(jìn)行優(yōu)化。將所篩選的靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0 數(shù)據(jù)庫，生物種類設(shè)為“Homo sapiens”，互作評分設(shè)置為＞0.9，其余設(shè)置默認(rèn)并對游離節(jié)點(diǎn)進(jìn)行隱藏，構(gòu)建靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 KEGG 和GO 富集分析利用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫對KEGG 和GO 進(jìn)行富集分析，最后篩選出補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的相關(guān)作用機(jī)制。

1.6 分子對接基于上述篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)與度值靠前排名的活性物質(zhì)，用分子對接軟件（Sybyl-X）進(jìn)行分子對接。在PDB 數(shù)據(jù)庫中選擇已篩選出的關(guān)鍵蛋白，利用Sybyl-X 中的Sulflex 模型與候選化合物進(jìn)行模擬對接。選用Sybyl/Sketch 模塊構(gòu)建底物分子，選擇Powell's 能量梯度方法進(jìn)行優(yōu)化，選擇Tripos進(jìn)行能量最小化，能量收斂設(shè)定為0.005 kcal/mol，化合物電荷類型選擇Gasteiger-Hückle，最佳構(gòu)象重復(fù)次數(shù)設(shè)定為1 000 次。

2 結(jié)果

2.1 ADME 潛在活性成分篩選利用pre-Caco-2和obioavail 1.1 模型按照設(shè)置條件對自建數(shù)據(jù)庫中的72 個化合物進(jìn)行篩選，最終獲得15 個具有較好潛在活性的化合物。見表1。

表1 ADME 性質(zhì)較好的化合物

2.2 靶點(diǎn)-疾病對篩選出的15 個化合物進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)”構(gòu)建，去重復(fù)后得到135 個關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)，同時將135 個靶點(diǎn)和15 個化合物關(guān)聯(lián)至TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，以心血管相關(guān)疾病種屬為篩查目標(biāo)，對上述化合物和靶點(diǎn)進(jìn)行二次篩選，最終篩選出10 個化合物，分別為異甘草素、甘草素、芒柄花黃素、Z-藁本內(nèi)酯、蛇床內(nèi)酯、新蛇床內(nèi)酯、丙氨酸、酪氨酸、異莪術(shù)醇、肉桂醛。并篩選出與化合物相關(guān)的26個靶點(diǎn)，見表2。

表2 補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒與抗CVD 相關(guān)的26 個潛在靶點(diǎn)

2.3 成分-靶點(diǎn)構(gòu)建與PPI 分析利用Cytoscape3.6.1 軟件進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，網(wǎng)構(gòu)圖共有36 個節(jié)點(diǎn)，54 條邊，黃色節(jié)點(diǎn)代表10 個化合物，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表26 個靶點(diǎn)，每條邊代表成分與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系（見圖1）。使用Cytoscape3.6.1 軟件對“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)構(gòu)圖進(jìn)行分析，以度值和介數(shù)中心度值為指標(biāo)進(jìn)行計算（見表3），36 個節(jié)點(diǎn)的平準(zhǔn)度值為3，介數(shù)中心度值平準(zhǔn)值為0.048，二者均值在平均值以上的確定為關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)，包括4 個關(guān)鍵化合物分別為異苷草素、芒柄花黃素、Z-藁本內(nèi)脂、酪氨酸；3 個關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為PTGS1、PTGS2、ADRB2。PPI 分析結(jié)果表明，補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒的成分作用于多個靶點(diǎn)，且各靶點(diǎn)之間具有相互協(xié)同作用（見圖2）。

圖1 補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的“藥效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖2 補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 相關(guān)靶點(diǎn)PPI 圖

表3 活性成分及靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

2.4 KEGG 通路和GO 富集分析26 個靶點(diǎn)共富集于7 條與CVD 相關(guān)的通路上。KEGG 通路分析顯示，補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的主要通路為Insulin signaling pathway、Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction 等（見圖3）。靶點(diǎn)GO 富集結(jié)果顯示，補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的靶點(diǎn)在blood circulation、circulatory system process、regulation of blood pressure 等心血管方面有明顯的富集作用，靶點(diǎn)富集的數(shù)量分別為13、13 和10 個（見圖4）。

圖3 補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的KEGG 信號通路圖

圖4 補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的靶點(diǎn)GO 富集通路圖

2.5 分子對接3 個關(guān)鍵靶蛋白ADRB2（PDB ID：3NYA）、PTGS1（PDB ID：6Y3C）和PT-GS2（PDB ID：5IKQ）與度值排名前三的化合物酪氨酸、異甘草素和芒柄花黃素分子對接結(jié)果顯示，ADRB2 與酪氨酸對接的打分值為5.4932，PTGS1 與異甘草素的打分值為5.1074，PTGS2 與芒柄花黃素的打分值為4.1662，結(jié)果表明關(guān)鍵靶蛋白和對應(yīng)的化合物對接良好，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的結(jié)果準(zhǔn)確性。其中ADRB2 和酪氨酸對接打分值最高，表明其對接效果最好。三組對接實(shí)驗(yàn)獲得靶蛋白與分子相互結(jié)合的活性位點(diǎn)見圖5，其中黃色線條為氫鍵作用力，是靶蛋白與活性分子相結(jié)合的主要作用力。

圖5 補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵活性成分的分子對接圖

3 討論

隨著對藥物研發(fā)要求的不斷提升，單靶點(diǎn)高選擇性的研發(fā)思路具有一定的局限性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，利用系統(tǒng)觀和整體觀的思想，采用多靶點(diǎn)研究思路進(jìn)行藥物的設(shè)計、篩選，為新藥研究提供了一種新方法，以達(dá)到增效減毒功效。由于疾病、藥物在生物信息相互關(guān)聯(lián)方面的復(fù)雜性，同時針對這一網(wǎng)絡(luò)研究缺少特異性，因此通過網(wǎng)絡(luò)模塊或子網(wǎng)絡(luò)將這一復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行解構(gòu)和降維，再將網(wǎng)絡(luò)模塊和子網(wǎng)絡(luò)作為有針對性、特異性的中藥靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析。利用多靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析的方法在研究中藥配伍、減毒增效等方面將發(fā)揮更大作用[8]。

本研究網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析的關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì)中，異甘草素、芒柄花黃素、酪氨酸3 個化合物的度值大于10 并且遠(yuǎn)高于其他化合物。異甘草素屬于異黃酮類物質(zhì)，是甘草中主要藥效成分之一。李德芳等[9]綜述了異甘草素的藥理作用，發(fā)現(xiàn)異甘草素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎作用，并對心血管系統(tǒng)有較好的保護(hù)作用。任歡歡等[10]采用Langendorff 建立離體心臟灌流模型的方法，發(fā)現(xiàn)異甘草素對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。芒柄花黃素也是一種異黃酮類化合物，廣泛存在于黃芪、甘草及葛根等豆科植物中，王健等[11]綜述了芒柄花黃素的現(xiàn)代研究進(jìn)展，藥理研究表明該化合物具有抗腫瘤、降血脂、抗心律不齊、改善動脈粥樣硬化以及抑制血管平滑肌增殖等作用。王建康等[12]發(fā)現(xiàn)人體血清游離酪氨酸等氨基酸及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與冠心病關(guān)系密切，在疾病治療過程中應(yīng)注意對其進(jìn)行有效地干預(yù)。網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)中度值位于前兩位的靶點(diǎn)PTGS2 能與9 個化合物相關(guān)聯(lián)，PTGS1 能與6 個化合物相關(guān)聯(lián)。汪圣等[13]研究發(fā)現(xiàn)蔥白可作用于MAPK8 和PTGS2 關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控NF-κB 通路，起到抑制炎癥，改善機(jī)體血脂水平，從而起到防止動脈粥樣硬化作用。李楊等[14]發(fā)現(xiàn)活血化瘀中藥可通過抑制AS 小鼠PTGS2 的產(chǎn)生而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。Licis 等[15]發(fā)現(xiàn)冠狀動脈疾病患者心肌梗死發(fā)病率的降低與編碼PTGS1 基因中一種常見的啟動子變體有明顯相關(guān)性。上述關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)從文獻(xiàn)的角度驗(yàn)證了補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的成分及作用機(jī)理。

補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒中的活性成分通過作用于多個信號通路發(fā)揮抗CVD 的作用。鈣信號傳導(dǎo)通路與補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)量最多，有7 個，分別為ADRA1A、ADRB1、ADRB2、F2R、GRIN1、NOS2 和NOS3。Neuroactive ligand-receptor interaction 信號通路與補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 相關(guān)的靶點(diǎn)有7 個，分別為ADRA1A、Adra2a、Adra2b、ADRB1、ADRB2、F2R、GRIN1。Insulin signaling pathway 信號通路與補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)量有4 個，分別為GSK3B、PDE3A、PYGM 和PTPN1。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 的藥效物質(zhì)進(jìn)行了篩選，同時對其作用機(jī)制進(jìn)行了闡述。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選共獲得4 個與抗CVD 高度關(guān)聯(lián)的活性成分和3 個關(guān)鍵靶點(diǎn)，應(yīng)用KEGG 通路分析獲得7 條抗CVD 的作用通路。本研究的結(jié)論體現(xiàn)了中醫(yī)藥理論“系統(tǒng)觀和整體觀”的思想，同時為補(bǔ)氣通絡(luò)顆粒抗CVD 藥效物質(zhì)篩選以及證候類中藥復(fù)方藥效物質(zhì)篩選提供了一種新的研究思路。