黃連素抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成作用機制研究

劉冬梅 郭夢雨 費冰 李永偉 劉瑩 任彥穎 劉心偉

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種重要的機會性和醫源性感染病原體，通常會在醫療器械和物體表面形成生物膜，生物膜使細菌抗性增加，臨床分離的KP 高耐藥率與之密切相關，給診療帶來了一定的壓力[1]。黃連素是從三顆針、黃柏、黃連等植物中提取的一種重要生物堿，是公認的“中藥抗菌藥物”[2]。我國是植物藥大國，研究發現[3]，多種植物藥對KP 均有良好的抗菌活性。其中黃連素是一種具有低毒、不易耐藥、在抗炎抗菌方面作用顯著等特點的植物性抗菌藥物。常用鹽酸黃連素又稱鹽酸小檗堿，已被證實對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、白色念珠菌等多種細菌/真菌具有抗生物膜作用[4～6]。國內也有其他學者證實，聯合使用黃連素可使左氧氟沙星和亞胺培南西司他丁對KP 發揮更優的抑菌活性[7，8]。但目前黃連素是否能影響KP 生物膜的機制尚不清晰。本研究通過測定黃連素對KP 的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC），評估黃連素對KP的體外抑菌效果。采用結晶紫半定量法觀察不同濃度黃連素對KP 生物膜形成過程的影響，利用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測高、中、低劑量黃連素對KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛fimA、fimH、mrkA、mrkD、fimK、mrkH基因表達的影響，分析生物膜相關基因與生物膜形成能力之間的關系，初步探討生物膜形成的相關機制，以期為黃連素抗KP 生物膜相關感染提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源KP NTUH-K2044 菌株由國立臺灣大學某教授饋贈。

1.2 儀器與試劑哥倫比亞血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司），NS-100B 臺式空氣浴恒溫搖床，鹽酸小檗堿、二甲基亞砜、MH 液體培養基、LB 液體培養基、結晶紫、總RNA 提取試劑（Trizol）、MightyScript 第一鏈cDNA 合成混液（生工生物工程上海股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 測定黃連素對KP 的MIC 采用微量肉湯稀釋法測定MIC，具體操作按臨床和實驗室標準協會M100-S27 標準進行。肉眼觀察MH 液體培養基中細菌渾濁程度，以完全抑制細菌可見生長的藥物濃度作為MIC。

1.3.2 結晶紫染色法半定量檢測生物膜 將細菌培養至對數期（OD600約為0.5），用LB 液體培養基稀釋100 倍，分別加入96 孔板實驗組和對照組中。實驗組再加入黃連素，終濃度分別為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，對照組再加入等體積LB 液體培養基。根據KP 生物膜形成的周期特點，于37℃恒溫培養箱中靜態培養24h、72h、120h，各組結晶紫染色后，使用酶標儀在 570nm 處測定OD 值。

1.3.3 RT-PCR 測定 ①總RNA 提取：使用Trizol試劑提取總RNA，具體操作按試劑說明書進行。②RT-PCR 反應測定：使用MightyScript 第一鏈cDNA 合成Master Mix，按照說明書完成逆轉錄，合成cDNA。設計KP 生物膜形成相關基因和管家基因16sRNA 特異性引物，以16sRNA 為內參，LB 組為對照，檢測不同濃度黃連素對上述基因表達的影響，引物見表1，按2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 KP 生物膜形成相關基因和管家基因引物信息

1.4 統計學方法使用SPSS 25 軟件進行統計學分析，計量數據近似正態分布以統計，文中用柱狀圖表示；組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。采用GraphPaid Prism 9.0 軟件繪制圖片。

2 結果

2.1 黃連素對KP 的MIC 值結果顯示，當黃連素濃度低于2 048μg/mL 時，MH 液體培養基中細菌呈現不同程度生長；當黃連素濃度為2 048μg/mL和4 096μg/mL 時，培養基中無細菌生長。即黃連素對KP 的MIC 值為2 048μg/mL。

2.2 黃連素對KP 生物膜形成總量的作用培養24h 后，各組細菌均有生物膜形成，生物膜形成量在第72h 達到最大值，進入成熟期；在第120h 有所下降，進入分散期。與對照組相比，1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC 黃連素組細菌生物膜形成量在24h、72h、120h 均有所降低（P＜0.05）；生物膜形成的各時期，黃連素濃度越高，生物膜形成量越低，不同濃度黃連素組間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 黃連素對KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關基因表達的作用采用RT-PCR 法檢測黃連素對KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關基因表達的影響，結果顯示，與對照組相比，不同濃度黃連素對KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛結構基因fimA、fimH、mrkA、mrkD及調控基因fimK、mrkH表達均表現出不同程度的抑制作用（P＜0.05），并且隨著黃連素濃度的增加，抑制作用呈上升趨勢。見圖2。

圖2 不同濃度黃連素對KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關基因mRNA 表達的影響

3 討論

KP 是臨床分離病原菌中常見的一種革蘭陰性桿菌，因較強的生物膜形成能力而在一定程度上增強其耐藥性，隨著中醫藥的不斷發展和研究的逐步深入，大量具有抗菌作用的中藥被發現，這些中藥因其成分復雜，既有抗感染的作用，又有調節機體的綜合作用，使細菌不易產生耐藥性而被廣泛研究，黃連素是其中一種抗菌作用明顯且應用廣泛的中藥[10]。本研究中測得黃連素對KP 的MIC 值為2 048μg/mL，細菌生長幾乎被完全抑制，表明黃連素對KP 的生長具有抑制作用。

研究表明，黃連素對多種細菌/真菌的生物膜均具有抑制作用，其作用機制主要包括減少白色念珠菌菌絲形成，抑制生物膜中多糖胞間黏附素的合成和eDNA 的釋放，以及抑制多藥耐藥沙門氏菌生物膜形成相關基因luxS、rpoE和ompR的表達等[16，17]。本課題組的前期研究也表明，黃連素能夠抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成和生物膜成分藻酸鹽的合成[4]。本研究中，結晶紫半定量實驗結果顯示，在生物膜形成的各個階段，不同濃度黃連素均顯著抑制KP 生物膜形成總量，且抑制作用呈劑量依賴性增加，說明黃連素能抑制KP 生物膜的形成。結合生物膜形成的階段性特征，我們推測，在生物膜形成時，相較于對KP 生長與增殖的抑制作用，黃連素對KP 表面黏附的抑制作用可能更明顯。在生物膜形成初期，黃連素主要依靠抑制KP 的表面黏附發揮作用，使得黏附于介質表面的細菌數量明顯減少；隨著生物膜的不斷成熟，已經黏附的細菌不斷增殖并分泌細胞外聚合物，此時黃連素對生物膜內細菌的作用主要表現為對其生長增殖的抑制；隨著培養時間的延長，生物膜進入分散期，生物膜的主動分散使得其強度相較于成熟期有所下降，對黃連素的耐受作用也相對降低，導致黃連素對膜內細菌的抑制作用在一定程度上增加。

KP 在生物或非生物介質表面的黏附主要由Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛介導，Ⅰ型菌毛存在于大腸桿菌、沙門菌、KP 等多種革蘭氏陰性細菌表面，呈絲狀結構，由fim基因簇編碼，其頂端主要由FimA 亞基和FimH 亞基組成，FimH 可以與膀胱細胞表面的甘露糖殘基結合，有助于KP 對膀胱細胞的侵襲和泌尿道感染膀胱中生物膜的形成[18，19]。fimA編碼具有DNA 結合域的調控子，通過與fimA上游啟動子區特異性地結合而激活fimA的轉錄作用[20]。Ⅲ型菌毛呈螺旋狀結構，由mrk基因簇編碼，主要結構為MrkA 亞基，末端連接MrkD 亞基，MrkA 可直接結合到非生物體如醫療器械表面，而MrkD 可與暴露在受損組織和植入裝置上的細胞外基質結合。MrkH 是一種c-di-GMP 依賴型轉錄調控子，可直接與RNA 聚合酶相互作用來激活mrkA表達[21]。Wang等[22]研究證明，Ⅲ型菌毛缺陷菌株形成生物膜的能力明顯低于野生株。Stahlhut 等[23]研究表明，KP的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛均能促進導管上生物膜的形成，并且二者的促進作用相互協同，當Ⅰ型和Ⅲ型菌毛都不存在時，KP 形成生物膜的能力嚴重減弱。本研究通過RT-PCR 檢測不同濃度黃連素對KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關基因表達的影響，1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC 黃連素均不同程度抑制KP Ⅰ型和Ⅲ型菌毛結構基因fimA、fimH、mrkA、mrkD和調控基因fimK、mrkH的表達，并且隨黃連素濃度增加，抑制作用越明顯，說明黃連素可通過下調fimA、fimH、fimK、mrkA、mrkD和mrkH的表達，減少KP的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛形成，但黃連素調控這些基因表達的相關機制需進一步研究。

綜上所述，我們認為黃連素可通過下調KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛結構基因fimA、fimH、mrkA、mrkD以及調控基因fimK、mrkH的表達減少Ⅰ型和Ⅲ型菌毛表達量，降低KP 的表面黏附能力，進而有效抑制KP 生物膜形成，為KP 感染的相關診療提供理論依據。