β-煙酰胺單核苷酸對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞自噬的影響

田夢(mèng)芝,龍佳欣,陳笑一,陳惠媚,2,金澤龍,李思特,謝明霞,杜 可*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué);2中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙410208

缺血性腦血管疾病包括短暫性腦缺血和腦梗死兩型。其中腦梗死在中醫(yī)診斷學(xué)中命名為缺血性腦卒中(ischemia stroke,IS),是由于各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙,導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死,進(jìn)而產(chǎn)生一系列神經(jīng)功能障礙的疾病。其致死率、致殘率高且病理機(jī)制復(fù)雜,每年給全球造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。腦細(xì)胞氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)是最常用的IS體外模型,廣泛用于基礎(chǔ)和臨床前腦卒中的研究[2]。

細(xì)胞自噬(autophagy)廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi),在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和死亡的過程中起著重要的作用[3,4]。大量研究提示自噬與IS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),有研究表明[5]神經(jīng)元自噬能減輕缺血性腦損傷,也有研究報(bào)道[6]神經(jīng)元自噬能加重缺血性腦損傷,但具體機(jī)制尚不明確。

β-煙酰胺單核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)存在于多種食物中,對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和維持機(jī)體正常功能至關(guān)重要,參與許多重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究報(bào)道,體外給予NMN能迅速轉(zhuǎn)化成NAD+而調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和維持機(jī)體正常功能[7]。NMN可以補(bǔ)償IS導(dǎo)致NAD+的減少而改善腦缺血神經(jīng)元的損傷[8]。這提示NMN在IS中發(fā)揮著一定的作用。有研究表明[9],NMN能夠促進(jìn)神經(jīng)血管再生、改善腦微血管內(nèi)皮功能、抗炎、抗凋亡。也有少量研究提示[10],其可通過調(diào)控自噬來發(fā)揮抗缺血性腦損傷的作用,然而NMN調(diào)控自噬抗IS的具體機(jī)制尚不明確。

本研究旨在構(gòu)建氧糖剝奪PC12細(xì)胞模型,通過體外實(shí)驗(yàn)MTT測(cè)細(xì)胞存活率,透射電鏡檢測(cè)自噬小體、自噬溶酶體,MDC觀測(cè)自噬小體熒光強(qiáng)度,Western blot檢測(cè)LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、P-mTOR/mTOR自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況,以期明確NMN對(duì)OGD誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞自噬損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞株(商品號(hào):TCR9),購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫,本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑

β-煙酰胺單核苷酸(貨號(hào):S31451-100 mg,上海源葉);3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(批號(hào):265839,MCE);雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)(批號(hào):HY-10219,MCE);胎牛血清(批號(hào):2307029,VivaCell);1%青鏈霉素混合液(批號(hào):42A0378K,普諾賽);DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(批號(hào):WHB823P261,普諾賽);DMEM無糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(批號(hào):WH1022K081,普諾賽);BCA試劑盒(批號(hào):23135865,Biosharp);蛋白酶抑制劑PMSF(批號(hào):21355980,Biosharp);Beclin1(批號(hào):10024164,Proteintech group);LC3(批號(hào):00115896,Proteintech group);mTOR(批號(hào):10018370,Proteintech group);P-mTOR(批號(hào):10020406,Proteintech group);β-actin(批號(hào):21004031,Proteintech group);羊抗鼠二抗(批號(hào):D20802-25,LI-COR);羊抗兔二抗(批號(hào):D21207-05,LI-COR);二甲基亞砜(批號(hào):22102134,Solarbio);細(xì)胞自噬檢測(cè)試劑盒(MDC法)(批號(hào):20221217,Solarbio);2.5% Gluta固定液(批號(hào):20230208,Solarbio)。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(SJ-CJ-2FD,蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司);倒置顯微鏡(AE2000,麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);三氣培養(yǎng)箱(150i,美國Thermo Fisher公司);酶標(biāo)儀 (ELX800,美國Bio-Tek公司);多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)(CytationTM5,美國Bio Tek公司);紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey CLX,美國LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC12細(xì)胞接種于含有10%的胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2及濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),適時(shí)換液,經(jīng)1～2次傳代后,收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞備用。

1.2.2 OGD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬損傷模型制備

從培養(yǎng)箱中取出PC12細(xì)胞,棄掉培養(yǎng)液,用PBS清洗2遍,加入適量的DMEM無糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(缺糖),置于94% N2,5% CO2,1% O2條件下缺氧6 h(缺氧)。

1.2.3 MTT法測(cè)各組PC12細(xì)胞存活率

收集對(duì)數(shù)增長期細(xì)胞,以6×103個(gè)/孔接種于96孔板。設(shè)置正常對(duì)照組(Con)、OGD組、NMN(200、400、800、1 600、3 200 μmol/L)組,共計(jì)7組,每組5個(gè)復(fù)孔,每孔100 μL。37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱下培養(yǎng)24 h。OGD組在上述條件下培養(yǎng)24 h后,換DMEM 無糖培養(yǎng)基,再在94% N2,5% CO2,1% O2條件下培養(yǎng)6 h進(jìn)行氧糖剝奪處理。NMN各濃度組藥物干預(yù)24 h,換DMEM無糖培養(yǎng)基,再在94% N2,5% CO2,1% O2條件下培養(yǎng)6 h 進(jìn)行氧糖剝奪處理。采用MTT法測(cè)細(xì)胞存活率,每孔加50 μg/mL、100 μL MTT,37 ℃孵育4 h后于490 nm 波長處測(cè)定各組吸光度(A)值,按如下公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率(R)。

R=[(A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A正常對(duì)照-A空白)]×100%

1.2.4 透射電鏡觀察PC12細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體

細(xì)胞以1.5×106個(gè)/mL的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中,設(shè)置Con組、OGD組、NMN組、3-MA組、3-MA+NMN組、RAPA組、RAPA+NMN組。37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱下培養(yǎng)24 h。NMN(800 μmol/L)進(jìn)行干預(yù),3-MA(5 mmol/L)、RAPA(100 nmol/L)分別在加NMN前30 min加入。各組干預(yù)24 h后,除正常組外,其余組換DMEM無糖培養(yǎng)基在 94% N2,5% CO2,1% O2條件下培養(yǎng)6 h,使細(xì)胞處于氧糖剝奪狀態(tài)。棄除舊培養(yǎng)基,用含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,收集到1.5 mL EP管中,在臺(tái)式冷凍離心機(jī)4 ℃下1 500 r/min離心10 min后棄去上清,用2.5% Gluta固定液固定細(xì)胞團(tuán),4 ℃冰箱保存過夜,1%鋨酸后固定2 h,依次以50%、70%、90%、100%的丙酮脫水,包埋、染色后,用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)體數(shù)目和形態(tài),并進(jìn)行拍照,肉眼計(jì)數(shù)。

1.2.5 MDC熒光法觀測(cè)PC12細(xì)胞自噬小體

細(xì)胞以1×106個(gè)/mL密度接種于6孔板,同“1.2.4”一樣操作處理后,棄舊培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入60 μL MDC熒光染色液,37 ℃孵育15 min;去除染色液,用PBS清洗3次后在CytationTM5細(xì)胞成像多功能檢測(cè)儀CFP 20倍鏡下觀察各組自噬小體的熒光斑點(diǎn),并拍照記錄,用Image J分析并計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Western blot檢測(cè)LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、mTOR、P-mTOR的表達(dá)情況

收集對(duì)數(shù)增長期細(xì)胞,以2.5×106個(gè)/mL密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中。按“1.2.4”分組培養(yǎng)處理后,棄除舊培養(yǎng)基,預(yù)冷PBS清洗2次,含有1% PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min,4 ℃下12 000 r/min冷凍離心10 min后取上清。定量、電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,2.5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,4 ℃孵育一抗過夜,次日室溫孵二抗1.5 h。Odyssey CLX雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、mTOR、P-mTOR的蛋白表達(dá)情況,β-actin為內(nèi)參,計(jì)算相對(duì)灰度值及P-mTOR/mTOR比值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率情況

如圖1所示,與Con組比,OGD 組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)。與OGD組比,NMN 400、800、1 600 μmol/L濃度組的細(xì)胞存活率均顯著提高(P<0.01),NMN 200 μmol/L、3 200 μmol/L濃度組的細(xì)胞存活率無明顯差異(P>0.05)。

圖1 各組細(xì)胞存活率情況

2.2 透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體情況

如圖2所示,Con組細(xì)胞形態(tài)正常,胞質(zhì)均勻,有少量自噬溶酶體。與Con組比,OGD組胞質(zhì)間隙變大,自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與OGD組相比,NMN組及3-MA組自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體均減少,而RAPA組出現(xiàn)大量空泡及自噬小體和自噬溶酶體,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與3-MA組相比,3-MA+NMN組自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體減少,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與RAPA組相比,RAPA+NMN組自噬空泡、自噬小體及自噬溶酶體均減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 透射電鏡觀察各組PC12細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體

2.3 MDC熒光染色觀測(cè)各組PC12細(xì)胞自噬小體的情況

如圖3和表1所示,Con組可見僅有少量熒光斑點(diǎn),熒光強(qiáng)度較弱。與Con相比,OGD組熒光斑點(diǎn)增多,且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.01)。與OGD組相比,NMN組、3-MA組熒光斑點(diǎn)顯著減少,熒光強(qiáng)度減弱(P<0.01);而RAPA組熒光斑點(diǎn)顯著增多,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.01)。與3-MA組相比,3-MA+NMN組熒光斑點(diǎn)減少,熒光強(qiáng)度減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與RAPA組相比,RAPA+NMN組熒光斑點(diǎn)顯著減少,熒光強(qiáng)度減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 MDC熒光染色觀測(cè)各組PC12細(xì)胞自噬小體的情況

圖3 MDC熒光染色觀測(cè)各組PC12細(xì)胞自噬小體的情況(×20)

2.4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

如圖4所示,與Con相比,OGD組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),P-mTOR/mTOR、p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01);與OGD組相比,NMN組和3-MA組細(xì)胞中LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),P-mTOR/mTOR、p62顯著上調(diào)(P<0.01),而RAPA組則剛好相反;與RAPA組相比,RAPA+NMN組細(xì)胞中的LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),P-mTOR/mTOR、p62顯著上調(diào)(P<0.01)。

圖4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

2017年柳葉刀研究顯示[11],腦卒中是造成我國生命損失年數(shù)的主要疾病,其病情進(jìn)展快、致死率和致殘率高。其中IS占整個(gè)腦卒中的60%～70% ,IS是由于血管阻塞導(dǎo)致大腦某一區(qū)域的血液供應(yīng)減少而引起的[12]。腦組織缺血缺氧后,會(huì)引發(fā)細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等一系列病理生理反應(yīng)[13]。IS幸存者康復(fù)周期長,加大了全球經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前,市場(chǎng)上用于防治IS的藥物存在諸多禁忌。故不斷探索防治IS的藥物是非常有必要的。OGD是體外研究IS的經(jīng)典模型[2]。PC12細(xì)胞系是研究神經(jīng)元損傷最常用的細(xì)胞系之一,常用于缺血缺氧損傷的研究[14]。故本實(shí)驗(yàn)采用OGD PC12細(xì)胞模型展開體外研究。

NMN是人體內(nèi)天然存在的物質(zhì),也存在于很多食物之中,分子量為334.22。為煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的產(chǎn)物,也是NAD+的關(guān)鍵前體之一[7]。有研究發(fā)現(xiàn)[15],通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)NMN的水平,對(duì)心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病及老化退行性疾病等有較好的治療和修復(fù)作用。也有研究報(bào)道[16],給予NMN可減少大鼠MCAO模型的梗死面積和神經(jīng)功能損傷。在本實(shí)驗(yàn)中,通過MTT證明了OGD能使PC12細(xì)胞存活率降低,NMN在400、800、1 600 μmol/L濃度可提高OGD PC12細(xì)胞存活率,其中800 μmol/L濃度時(shí)存活率最高;而在 NMN 200、3 200 μmol/L濃度時(shí)的細(xì)胞存活率無明顯差異,這說明200 μmol/L濃度還未能達(dá)到提高OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的有效濃度,而3 200 μmol/L濃度則可能是濃度過高而對(duì)細(xì)胞本身產(chǎn)生了一定的損害。

細(xì)胞自噬被稱為Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡,是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下,利用溶酶體降解自身受損、變性或衰老的大分子物質(zhì)以及細(xì)胞器以維持其生存、分化、生長及穩(wěn)定的過程[3]。研究表明[17],IS后會(huì)誘發(fā)自噬,同時(shí)自噬也伴隨著IS病理過程的發(fā)生發(fā)展,在IS的急性期、亞急性期、恢復(fù)期和后遺癥期四個(gè)分期中扮演不同的調(diào)控作用[18]。

mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,相對(duì)分子質(zhì)量為289 kDa。其不同蛋白質(zhì)結(jié)合,可形成2種不同復(fù)合物,即mTORCl和mTORC2。mTORCl對(duì)雷帕霉素敏感,負(fù)責(zé)整合生長因子和營養(yǎng)信號(hào),主要調(diào)控細(xì)胞自噬、核糖體生物發(fā)生、蛋白翻譯和脂質(zhì)合成等[19]。mTOR被認(rèn)為是自噬的閥門。研究表明,磷酸化mTOR可以減輕氧糖剝奪損傷,發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[20]。3-MA是一種常用的自噬抑制劑[21]。RAPA是mTOR抑制劑,可通過抑制mTORC1誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,也被叫作自噬激活劑[22]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3-MA、RAPA 組,用以干預(yù)調(diào)控OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬;同時(shí)也設(shè)置了3-MA、RAPA與藥物聯(lián)用組來觀察NMN是否能對(duì)抗3-MA或RAPA對(duì)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬的影響。

Beclin-1、LC3和p62蛋白水平可作為自噬作用的重要檢測(cè)指標(biāo)。Beclin1是一個(gè)成熟的自噬調(diào)節(jié)因子,與自噬呈正相關(guān)。Beclin1與VPS15、VPS34 、ATG14等蛋白相互作用來執(zhí)行自噬和膜運(yùn)輸功能[23]。LC3是酵母中的泛素樣修飾劑 ATG8的同源物,被認(rèn)為在自噬過程中起作用。LC3經(jīng)過ATG4處理后失去C末端殘基轉(zhuǎn)變成LC3-I。LC3-I經(jīng)歷泛素化樣酶促反應(yīng)級(jí)聯(lián),共價(jià)連接至自噬體膜的脂質(zhì)分子磷脂酰乙醇胺,轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ[24],LC3-II/LC3-I比值升高則說明自噬水平升高[25]。p62是反映自噬活性的標(biāo)記蛋白,其蛋白的水平與自噬呈負(fù)相關(guān),即出現(xiàn)自噬時(shí),在細(xì)胞質(zhì)中p62蛋白不斷被降解;當(dāng)自噬活性減弱、自噬功能缺陷時(shí),p62蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積[26]。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot技術(shù)證實(shí)了NMN能夠下調(diào) Beclin1、LC3-II/LC3-I蛋白相對(duì)表達(dá)量,上調(diào)P-mTOR/mTOR、p62蛋白表達(dá)量。此外還運(yùn)用透射電鏡技術(shù)和MDC法證實(shí)了NMN可減少OGD PC12細(xì)胞的自噬小體、自噬溶酶體數(shù)量及熒光斑點(diǎn)和強(qiáng)度。以上說明NMN能夠抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬。

綜上,提示一定劑量的NMN可抗OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬損傷,從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用,并且這種保護(hù)作用可能和mTOR相關(guān)通路有關(guān)。本研究可為NMN防治OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬損傷提供一定的靶標(biāo)參考,為天然化合物NMN的開發(fā)積累一定實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。