基于HPLC指紋圖譜結合一測多評法的葛花質量控制研究

張立軍,張新玥,李 鵬,張轉平*,朱遠鋒,劉 麗,王 磊,吳春燕

1安康市食品藥品檢驗檢測中心;2安康市天源植物提取有限公司,安康 725000;3商洛市藥品檢驗所,商洛 726000;4北京中醫藥大學藥學院,北京 100029

葛花(Puerariae Flos)為豆科葛屬植物野葛(Puerarialobata(Willd.) Ohwi)或粉葛(PuerariathomsoniiBenth.)的干燥花蕾,又名野葛花、甘葛花、粉葛花或鹿藿花,收載于《名醫別錄》《滇南本草》《本草綱目》中,具有解酒醒酒、清濕熱、除煩止嘔的功效[1-3]。現代研究表明,葛花具有解酒毒、降血糖、降血脂、抗氧化、心肌保護及雌激素樣等作用,被廣泛用于解酒保肝、降血糖血脂、抗骨質疏松及調節免疫等保健產品開發的原料藥[4]。化學成分研究顯示,葛花中主要含有黃酮類、萜類、甾體類及香豆素類等,其中葛根素(puerarin,Pu)、大豆苷(daidzin,Da)、大豆苷元(daidzein,Dae)、染料木苷(genistin,Ge)、染料木素(genistein,Gee)、葛花苷(kakkalide,Ka)、黃豆苷(glycitin,Gl)、鳶尾苷(tectoridin,Td)、鳶尾苷元(tectorigenin,Tg)、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷(tectorigenin-7-O-xylosylglucoside,Tx)等為主要化學成分[4]。葛花主要分布于東南亞地區,其中在我國分布最廣,陜西、四川、廣西及云南等地是葛花主產區[5,6]。部頒標準和各省地方中藥材標準已明確規定野葛和粉葛的花蕾作為我國葛花2個藥用正品來源,為了研究區分,將前者稱為葛花,后者稱為粉葛花。我們課題組研究發現,二者化學成分存在明顯差異。目前葛花僅有部頒標準和地方標準,品種鑒別存在混亂,質控指標僅性狀、鑒別與檢查,過于簡單,有關完善的質量控制標準尚未見報道[7,8]。

指紋圖譜是一種綜合、宏觀、可量化的色譜鑒定手段,該技術被廣泛用于中藥的質量評價,可較全面地反映中藥中化學成分差異特征,從而達到甄別真偽優劣的目的[9-11]。故本研究采用HPLC建立不同產地葛花藥材的指紋圖譜;同時,在此基礎上建立了一測多評分析方法(QAMS),用于葛花中Pu、Da、Dae、Ge、Gee、Ka、Gl、Td、Tg及Tx的含量測定,系統評價不同產區葛花藥材的質量差異,為全面、系統地控制葛花質量提供實驗依據,為葛花優質種質資源的選育和育種提供參考。

1 試驗材料

1.1 儀器與試劑

BS224S電子分析天平(德國Sartorius公司);AS10200BT超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);Shimadzu LC-20AT、Shimadzu LC-2030高效液相色譜儀(日本島津公司);Agilent 1200 Series型高效液相色譜儀,Agilent 5 TC C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱2(美國Agilent科技有限公司);Phenomenex ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱1;Waters sunfire C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱3。葛根素(批號110752-201816,純度95.40%)、大豆苷(批號111738-201904,純度93.40%)、大豆苷元(批號111502-202003,純度99.30%)、染料木苷(批號111709-201702,純度99.90%)、染料木素(批號111704-202104,純度98.80%)(中國食品藥品檢定研究院)。葛花苷(批號CHB201122,純度98.00%)、黃豆苷(批號CHB201230,純度98.00%)、鳶尾苷(批號CHB201104,純度98.50%)、鳶尾苷元(批號CHB201219,純度98.50%)、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷(批號CHB201201,純度98.00%)均購于中國成都克洛瑪生物科技有限公司。

1.2 葛花藥材

20批葛花(GH)與10批粉葛花(FGH)藥材分別采集于陜西、四川、廣西及云南等地區(見表1),經安康市食品藥品檢驗檢測中心張轉平主任藥師鑒定分別為豆科葛屬植物野葛(Puerarialobata(Willd.) Ohwi)和粉葛(PuerariathomsoniiBenth.)的干燥花蕾。

表1 20批葛花和10批粉葛花藥材產地信息

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備

葛花、粉葛花分別粉碎過40目篩,取約0.2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W;頻率55 kHz;水溫30 ℃)30 min,放冷,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,進樣前用0.45 μm微孔膜過濾,作為供試品溶液。

2.2 混合對照品溶液制備

取葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、葛花苷、黃豆苷、鳶尾苷、鳶尾苷元及鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制備質量濃度分別為8.933 3、10.266 7、11.800 0、56.333 3、11.200 0、796.666 7、74.666 7、48.000 0、14.400 0、700.000 0 μg/mL的混合對照品溶液,4 ℃冰箱中存貯備用。

2.3 色譜條件

色譜柱:Phenomenex ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:0.2%磷酸水溶液,流動相B:乙腈;梯度洗脫:0～5 min,15%→20%B;5～17 min,20→25%B;17～25 min,25%→33%B;25～45 min,33%B;45～55 min,33%→75%B,流速1.0 mL/min;進樣量10 μL,檢測波長265 nm;柱溫35 ℃。

2.4 葛花藥材HPLC指紋圖譜建立

2.4.1 方法學考察

2.4.1.1 空白溶劑考察

取甲醇按“2.3”項下色譜條件進樣分析,結果表明溶劑無干擾。

2.4.1.2 精密度試驗

取GH-1供試品溶液按“2.3”項下色譜條件進樣分析,連續進樣6次,記錄色譜圖。以23號峰(Ka)為參照峰,計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積,結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)均分別小于0.56%、1.2%(n=6),說明該儀器的精密度良好。

2.4.1.3 穩定性試驗

取GH-1供試品溶液按“2.3”項下色譜條件進樣,分別于0、3、6、9、12、24、48 h測定,以Ka參照峰,計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積,結果各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均分別小于0.93%、1.8%,表明48 h內樣品的穩定性良好。

2.4.1.4 重復性試驗

取GH-1樣品按“2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣分析,以Ka參照峰,計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積,結果各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均分別小于0.57%、1.8%(n=6),表明本法有良好的重復性。

2.4.1.5 耐用性考察

取GH-1供試品溶液,分別采用“1.1”項下3臺不同HPLC儀,在3根不同品牌色譜柱條件下,按“2.3”項下色譜條件進行分析并記錄其色譜圖。以Ka為參照峰,各色譜峰出峰順序均未改變,各色譜峰相對保留時間RSD均分別小于2.9%,表明本法有良好的耐用性。

2.4.2 指紋圖譜建立及相似度評價

分別取葛花、粉葛花樣品供試液,按“2.3”項下色譜條件進樣分析,分別記錄色譜圖,并將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版),采用中位數法進行多點校正生成指紋圖譜共有模式及對照指紋圖譜,確定葛花、粉葛花的各自共有峰分別為18、27個(見圖1)。通過與對照品比對,指認出10個共有峰(見圖2)。對照指紋圖譜與各批次樣品圖譜進行相似度評價(見表2),20批葛花和10粉葛花樣品相似度均大于0.85,說明不同產地葛花和粉葛花共有峰相似度較高,藥材質量較均一。

圖1 葛花(A)、粉葛花(B)指紋圖譜和對照圖譜

圖2 葛花、粉葛花樣品鏡像HPLC圖(A)及混合對照品的HPLC圖(B)

表2 20批葛花和10批粉葛花樣品的相似度結果

2.5 多指標成分含量測定

為了更好地評價不同產地葛花質量,在特征圖譜的基礎上,建立了QAMS方法測定Pu、Da、Gl、Tx、Ge、Td、Dae、Ka、Gee、Tg 10個主要特征成分含量。其供試品制備、對照品溶液制備、色譜條件分別見“2.1”“2.2”及“2.3”項下所示。

2.5.1 精密度、穩定性及重復性試驗

精密度、穩定性及重復性測定方法同“2.4.1”項,記錄Pu、Da、Gl、Tx、Ge、Td、Dae、Ka、Gee及Tg 10個主要成分的峰面積,并計算其質量分數的RSD值。結果表明,各成分精密度的RSD均小于1.6%、穩定性的RSD值均小于1.7%、重復性的RSD值均小于2.0%,說明該方法穩定、可靠。

2.5.2 線性方程、定量限與檢測限

精密吸取混合對照品貯備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mL,用甲醇定容至5.0 mL,搖勻。分別按“2.3”項下色譜條件進樣分析,測定峰面積,以峰面積(Y)對質量濃度(X)進行線性回歸。將對照品溶液進行逐級稀釋,分別以信噪比的3倍和10倍計算檢測限與定量限,見表3。

表3 10種葛花黃酮類成分的線性關系、定量限與檢測限考察

2.5.3 加樣回收率試驗

取已知含量的GH-1樣品粉末0.1 g共6份,精密稱定,分別置于精密加有“2.2”項下2.00 mL混合對照品的干燥具塞錐形瓶中,按“2.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣分析,計算Pu、Da、Gl、Tx、Ge、Td、Dae、Ka、Gee及Tg的平均回收率,回收率范圍在95.22%～105.7%,RSD均小于2.9%,表明方法的回收率良好。

2.5.4 一測多評方法(QAMS)建立

2.5.4.1 相對校正因子(f)計算

精密吸取“2.6.2”項下各混合對照品溶液適量,按“2.3”項下色譜條件進樣分析,以Ka為參照物,按如下公式計算Pu、Da、Gl、Tx、Ge、Td、Dae、Gee及Tg的相對校正因子(f)[11,12],結果見表4。

表4 相對校正因子(f)測定結果

f=fi/fs=(Ai/Wi)/(As/Ws)

(1)

式中,Ai和As分別表示待測化合物和參照化合物的峰面積(或峰高);Wi和Ws分別為待測化合物與參照化合物的質量濃度。

2.5.4.2 耐用性考察

不同高效液相色譜儀和色譜柱對f值的影響:采用“1.1”項下3種不同HPLC儀,分別考察了3種不同品牌的色譜柱對f值的影響,結果顯示3種品牌色譜柱在不同HPLC儀上所測定的f的RSD均小于3.0%,表明葛花中10個黃酮成分在不同色譜系統及不同色譜柱上的耐用性較好(見表5)。

表5 不同色譜柱和HPLC系統對f的影響

不同色譜柱溫對f值的影響:實驗采用LC-20AT HPLC儀,色譜1號柱,考察不同柱溫(30、35、40 ℃)對f的影響,結果顯示各待測成分f的RSD 均小于3.0%,表明葛花中10個黃酮成分在柱溫為30～40 ℃時耐受性較好(見表6)。

表6 不同柱溫對f的影響

不同流速對f值的影響:實驗采用LC-20ATHPLC儀,色譜1號柱,考察了不同流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)對f的影響,結果顯示各待測成分f的RSD 均小于3.0%,表明葛花中10個黃酮成分在流速0.8～1.2 mL/min時耐受性較好(見表7)。

表7 不同流速對f的影響

2.5.4.3 待測成分色譜峰的定位

在QAMS的運用中,目前常用的色譜峰定位方法有相對保留時間(Rt)法、保留時間差(Δt)法、時間校正法、對照提取物法等[12]。Rt計算公式:Rti/s=ti/ts。Δt計算公式:Δti/s=ti-ts。采用“1.1”項下HPLC儀,分別考察了3根不同品牌色譜柱條件下各待測成分的Rt及Δt。結果發現,不同儀器和不同色譜柱對Δt法的影響較大,RSD>7.0%;相對而言,Rt法的差異較小。本實驗采用Rt法對待測組分色譜峰進行定位,結果Pu、Da、Gl、Tx、Ge、Td、Dae、Gee及Tg相對于Ka的Rt均值分別為0.245、0.359、0.382、0.473、0.533、0.553、0.940、1.251及1.271,RSD≤2.586%,表明采用待測組分與參照峰Rt值來定位具有可行性(見表8)。

表8 不同儀器、不同色譜柱對Rt的影響

2.5.4.4 QAMS和外標法測定結果比較

分別隨機從陜西抽取葛花8批、粉葛花2批;四川抽取葛花1批;云南抽取粉葛花1批;廣西抽取葛花1批、粉葛花2批,按“2.1”項下供試品制備方法,“2.3”項下色譜條件進樣分析,分別采用QAMS與ESM計算各成分含量,QAMS定量計算公式如下[11,12]。

(2)

式中,Ai和As分別表示待測化合物和參照化合物的峰面積(或峰高);Wi和Ws分別為待測化合物與參照化合物的質量濃度;f為待測標志物i的相對校正因子。

將QAMS計算值與外標法實測值進行配對t檢驗,結果P值均>0.05,表明兩種方法測定的含量結果無顯著性差異;進一步以相對誤差(relative deviation,RD)對兩種方法測定結果進行準確性評價[11]。

(3)

計算結果,除了FGH中Dae、Gee及Tg含量的RD小于9.0%外,其余的RD均小于5.0%,表明2種測定方法的結果無顯著性差異(見表9)。

同時對外標法測定結果進行聚類熱圖分析,結合SPSS 24.0軟件對其進行獨立樣本t檢驗分析,結果顯示葛花、粉葛花在成分種類和含量存在明顯的差異,其中葛花中Ka、Dae、Gee含量顯著高于粉葛花(P<0.01),未檢測到Da、Gl;粉葛花中Tx、Td、Ge含量顯著高于葛花(P<0.01);聚類熱圖可將葛花、粉葛花分為2大類。不同產地來源的葛花、粉葛花藥材中10個成分含量均存在較大差異,其中位于秦巴山區安康旬陽、紫陽、漢中鎮巴及商洛鎮安等縣的葛花各成分含量較高,質量較優;位于廣西、云南等地粉葛花各成分含量較高,質量較優。研究結果清晰地表明了不同產地葛花藥材的質量差異(見表9和圖3)。

圖3 葛花、粉葛花差異性標志物含量聚類熱圖

3 討論與結論

實驗采用二極管陣列檢測器,對10個黃酮類成分進行了200～400 nm全波長掃描,結果顯示Pu、Da、Dae、Ge、Gee、Ka、Gl、Td、Tg及Tx 10個成分的紫外光譜圖較為相似,均在256～274 nm波長處有最大吸收。選擇在265 nm波長條件下,分析發現10種待測成分具有良好的基線分離,且基線平穩,可以滿足定量分析的要求。實驗考察了75%乙醇;95%乙醇;75%甲醇及甲醇各25 mL作為提取溶劑,結果選擇甲醇作為提取溶劑時,色譜峰數目適宜,便于分離。實驗也考察了超聲及熱回流處理方式,最終選擇超聲30 min,方法簡便且效率高。實驗還考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液及乙腈-0.2%甲酸水溶液等流動相體系。最終選擇乙腈-0.2磷酸水溶液梯度洗脫體系,分離效果好,拖尾得到很好的改善。

為有助于葛花全面質量控制,實驗分別選擇了活性明確、含量較高的各類代表性成分作為QAMS法含量測定的指標成分,主要包括Pu、Da、Dae、Ge、Gee、Ka、Gl、Td、Tg及Tx等為主要化學成分[4,13]。從各成分含量測定結果、各成分色譜分離情況、對照品價格與易得情況看,Ka含量較高,分離效果好,在譜圖中容易識別,處于色譜圖的中位,利于其他成分色譜峰的相對保留時間計算和色譜峰的識別,且Ka性質穩定、價廉易得,具有降血脂血糖、改善微循環及激活乙醇脫氫酶的活性[14,15]。因此,本研究選擇Ka作為QAMS法含量測定的參照物。

本實驗建立的指紋圖譜可很好表征葛花中化學成分的信息,在指紋圖譜基礎上建立的QAMS法可有效測定葛花、粉葛花中主要有效成分Pu、Da、Gl、Tx、Ge、Td、Dae、Ka、Gee及Tg的含量,可全面反映葛花藥材的整體質量信息。根據含量測定結果與聚類熱圖可直觀看出,葛花、粉葛花分為2大類,來自不同產區的20批葛花、10批粉葛花藥材中主要有效成分種類及含量差異很大。差異成分為Ka、Da、Gl、Tx、Td及Ge。其原因與葛花和粉葛花來源不同有關。

葛花目前收錄野葛和粉葛的干燥花蕾共同作為藥材來源,鑒于葛花和粉葛花中主要有效成分存在較大差異,兩者的臨床療效應該也有所不同,因此,在產品開發和臨床應用中應當加以區分使用。同時葛花具有較大保健產品開發前景,亟需建立規范的葛花質量評價體系。本研究所建立的指紋圖譜結合一測多評方法在減少對照品使用的情況下,可實現葛花藥材的多成分、多指標質量控制;同時能很好地區分葛花、粉葛花藥材,并且能對不同產地葛花藥材進行有效的質量評價;實驗結果可為葛花質量標準修改完善提供參考依據,可以為葛花優質種質資源的選育和育種提供參考,在中藥整體質量評價模式中具有良好的應用前景。