基于頂空氣相色譜-離子遷移譜的不同品種香稻米快速鑒別方法

卞景陽(yáng)，孫興榮*，劉琳帥，邵凱，馮鵬，車(chē)野，胡禧熙，顧鑫，徐磊，李杰

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319；2.國(guó)家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心東北中心，黑龍江哈爾濱 163316）

水稻是世界上主要的糧食之一，黑龍江省水稻產(chǎn)量占全國(guó)水稻產(chǎn)量的近五分之一[1]。目前，人們不僅僅滿足于食品的營(yíng)養(yǎng)與安全，更對(duì)食品的風(fēng)味有更高的要求[2-3]。香氣是食品最重要的風(fēng)味特征之一，是決定食品是否被消費(fèi)者所接受的關(guān)鍵因素。香稻米深受消費(fèi)者喜愛(ài)，具有濃郁的香味，多種微量元素含量高，是一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的稻米[4]。香味是香稻米品種最重要的品質(zhì)性狀之一，因此探究不同香稻米品種中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品種香稻米的品質(zhì)評(píng)價(jià)，對(duì)香稻米的育種和開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

目前，許多分析技術(shù)已被開(kāi)發(fā)用于評(píng)價(jià)不同樣品的揮發(fā)性成分以及樣品的鑒定分析。然而，這些傳統(tǒng)方法的樣品前處理的提取過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)樣品的快速分析，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectromete，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）和超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（super-high performance liquid chromatography-mass spectrum in series，UPLC-MS）。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種全新的、綠色的、無(wú)預(yù)處理的、快速、高靈敏度的光譜分析方法。氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是由氣相色譜和離子遷移譜組成的一種可用于對(duì)高揮發(fā)性的有機(jī)化合物總量（volatile organic compounds，VOCs）進(jìn)行評(píng)估分析和精確定量預(yù)測(cè)的超靈敏分析預(yù)測(cè)技術(shù)，具有快速分析能力。氣相色譜（gas chromatography，GC）是測(cè)定揮發(fā)性物質(zhì)的常用方法，離子遷移譜（ion mobility spectrumetry，IMS）是根據(jù)氣體離子通過(guò)電場(chǎng)時(shí)不同的遷移速率來(lái)分離離子。兩種方法結(jié)合時(shí)，先用GC 預(yù)分離，控制分析物的濃度，分離雜質(zhì)，再用IMS 進(jìn)行分離。兩次分離得到的停留時(shí)間和遷移時(shí)間可以準(zhǔn)確地確定分析物的二維特性[5-7]。相比傳統(tǒng)的食品風(fēng)味物質(zhì)分析方法如電子舌、電子鼻[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-吸聞法、氣相色譜-質(zhì)譜/吸聞法[10-12]，GC-IMS 具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、樣品制備步驟簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。

目前氣相色譜-離子遷移譜在風(fēng)味物質(zhì)分析、產(chǎn)品鑒別、品種溯源等領(lǐng)域得到了很好的應(yīng)用。Zhang等[15]采用氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）對(duì)青稞在生、洗、漂、預(yù)冷、冷凍、蒸、煮、煎加工后的揮發(fā)性物質(zhì)成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，證實(shí)了通過(guò)GC-IMS 可以快速可視化和識(shí)別綠色小麥樣品的揮發(fā)性成分，并根據(jù)揮發(fā)性成分的差異對(duì)樣品進(jìn)行明確的分類(lèi)。He 等[16]利用頂空-高效氣相色譜-離子遷移譜（headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy，HS-GC-IMS）檢測(cè)不同產(chǎn)地麥冬特征風(fēng)味化合物，快速鑒別了浙江省三門(mén)市、慈溪市兩產(chǎn)地的麥冬。Zhang等[17]采用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)對(duì)黑芝麻不同加工階段的加工產(chǎn)物進(jìn)行鑒別。利用儀器內(nèi)置的數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)樣品的揮發(fā)性成分響應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，識(shí)別不同的成分，鑒定出20 種化合物。Pu 等[18]采用氣相色譜-離子遷移譜和感覺(jué)支配時(shí)間的動(dòng)態(tài)感官評(píng)價(jià)方法，研究白面包在口腔加工過(guò)程中的香氣釋放和知覺(jué)。Yuan 等[19]建立一種基于HS-GC-IMS 的綠色、快速的百合鑒別方法，為百合不同物種的鑒別提供科學(xué)數(shù)據(jù)。Qin 等[20]采用GC-IMS 分析比較不同煙草樣品香氣的差異。Chen 等[21]以紹興黃酒、山東黃酒和湖北黃酒為研究對(duì)象，對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行鑒別。

本研究利用GC-IMS 技術(shù)，檢測(cè)香稻米品種“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”3 種稻米中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，通過(guò)比較“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜，對(duì)試驗(yàn)所選牡丹江地區(qū)3 個(gè)不同品種稻米進(jìn)行區(qū)分，以期為不同品種稻米品種區(qū)分、品質(zhì)評(píng)價(jià)、品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻米：“牡育稻78 號(hào)”（MD1）、“牡科稻5 號(hào)”（MD2）、“牡科稻7 號(hào)”（MD3）：由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院優(yōu)質(zhì)水稻種植推廣示范稻基地；Flavour-Spec?風(fēng)味分析儀：德國(guó)G.A.S 公司；MXT-5 色譜柱（15 m×0.53 mm）：美國(guó)RESTEK 公司；外標(biāo)正酮C4～C9：國(guó)藥化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱(chēng)取“牡育稻78 號(hào)”（MD1）、“牡科稻5 號(hào)”（MD2）、“牡科稻7 號(hào)”（MD3）稻米樣品各2 g 于進(jìn)樣瓶中孵育后進(jìn)樣。

1.2.2 GC-IMS 檢測(cè)條件

表1 GC-IMS 檢測(cè)條件Table 1 GC-IMS detection conditions

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用儀器配套的分析軟件對(duì)IMS 數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量分析。通過(guò)LAV 軟件處理IMS 數(shù)據(jù)，計(jì)算揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)（retention index，RI），利用Reporter、Gallery Plot 內(nèi)置插件進(jìn)行譜圖分析。Reporter生成了稱(chēng)為地形圖的光譜，它可以通過(guò)二維俯視圖和三維光譜直接比較樣品之間的光譜差異；Gallery Plot比較不同樣品之間的VOCs 差異，通過(guò)所選VOCs 的峰值強(qiáng)度來(lái)比較不同樣品中VOCs 的含量；利用GCIMS Library 檢索軟件對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PCA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種香稻米氣相色譜-離子遷移譜圖（GCIMS）和譜圖對(duì)比分析

采用GC-IMS 對(duì)來(lái)自牡丹江地區(qū)的3 個(gè)不同品種的香稻米揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS 三維譜圖Fig.1 Three-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice

由圖1 可知，3 種不同品種的香稻米品種GC-IMS三維譜圖非常近似，難以直接通過(guò)揮發(fā)性成分進(jìn)行品種區(qū)分，但揮發(fā)性物質(zhì)含量存在一定的變化，物質(zhì)峰的信號(hào)強(qiáng)度在“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7號(hào)”3 種不同品種香稻米中有所不同。

為了對(duì)“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7號(hào)”3 種不同稻米中揮發(fā)性成分進(jìn)行區(qū)分，對(duì)反應(yīng)峰的離子遷移時(shí)間和位置進(jìn)行歸一化處理，得到如圖2所示的GC-IMS 的二維俯視譜圖，其中x軸為離子相對(duì)遷移時(shí)間，y軸為氣相色譜的保留時(shí)間。由圖2 可知，譜圖中顯示了“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”3 種香稻米中的總揮發(fā)性化合物，揮發(fā)性化合物的信號(hào)峰均出現(xiàn)在遷移時(shí)間1.0～2.0 s 和保留時(shí)間100～800 s 的范圍內(nèi)。信號(hào)強(qiáng)度用不同顏色表示，物質(zhì)含量低呈現(xiàn)白色，物質(zhì)濃度高呈現(xiàn)紅色[22-23]。通過(guò)GCIMS 技術(shù)“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7號(hào)”3 種不同品種香稻米中揮發(fā)性物質(zhì)可實(shí)現(xiàn)較好地分離，為了能夠進(jìn)一步比較分析出樣品特征間可能的差異，通過(guò)差異對(duì)比分析模式，對(duì)“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”進(jìn)行分析，如圖3所示。選取“牡育稻78 號(hào)”作為參比，其它樣品扣除參比，顏色變淺，代表其揮發(fā)性物質(zhì)濃度低于其參比，顏色變深代表其揮發(fā)性物質(zhì)含量高于其參比（如白色、紅色、藍(lán)色等分別代表其揮發(fā)性物質(zhì)一致、揮發(fā)性物質(zhì)高于參比、揮發(fā)性物質(zhì)低于參比）。

圖2 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS 二維譜圖（俯視圖）Fig.2 Two-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice（vertical view）

圖3 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS 二維譜圖（差異對(duì)比圖）Fig.3 Two-dimensional GC-IMS of volatile components in different varieties of fragrant rice（difference contrast）

2.2 不同品種香稻米GC-IMS 揮發(fā)性風(fēng)味成分定性分析

“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”3 種香稻米揮發(fā)性化合物定性譜圖如圖4所示（以“牡育稻78 號(hào)”為例），每種揮發(fā)性成分在圖中顯示為標(biāo)記點(diǎn)。通過(guò)與正酮C4～C9 標(biāo)準(zhǔn)品比較，計(jì)算“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”中揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)[24-26]，結(jié)果如表2所示。

圖4 香稻米揮發(fā)性成分離子遷移譜定性分析Fig.4 IMS qualitative analysis of volatile components in different varieties of fragrant rice

表2 香稻米中揮發(fā)性物質(zhì)分析Table 2 Analysis of volatile components in fragrant rice

由圖4 和表2 可知，牡育稻78 號(hào)、牡科稻5 號(hào)、牡科稻7 號(hào)中含有38 種單體及二聚體物質(zhì)：酮類(lèi)7 種、醛類(lèi)16 種、醇類(lèi)9 種、呋喃1 種、醚類(lèi)1 種、吡啶1 種、芳香烴2 種、單萜類(lèi)1 種，其中鑒定的單體、二聚體的CAS 號(hào)相同，僅形態(tài)不同。醛類(lèi)物質(zhì)具有濃郁的香味；醇類(lèi)化合物產(chǎn)生柔和的氣味，這些風(fēng)味物質(zhì)使稻米呈現(xiàn)不同的風(fēng)味[26-28]。

2.3 不同品種香稻米離子遷移色譜（GC-IMS）指紋譜圖分析

試驗(yàn)選用的牡丹江地區(qū)3 種不同香稻米品種“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”的指紋譜圖如圖5所示。圖中橫向顯示牡丹江地區(qū)3 種不同品種香稻米同一樣品進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，縱向顯示不同品種香稻米中相同揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[29]。

圖5 不同品種香稻米中揮發(fā)性物質(zhì)的指紋譜圖Fig.5 Fingerprint spectrum of volatile components in different varieties of fragrant rice

由圖5 可知，3 種不同品種的香稻米揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)豐富，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定了38 種風(fēng)味物質(zhì)，不同品種香稻米中揮發(fā)性物質(zhì)有明顯的不同之處。紅色區(qū)域框內(nèi)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在“牡育稻78 號(hào)”中最豐富，其次為“牡科稻5 號(hào)”，“牡科稻7 號(hào)”中最少，主要為化合物羅勒烯、檸檬烯單體、檸檬烯二聚體。綠色區(qū)域框內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)如乙醇、二甲基-1-丁醇，在“牡科稻7 號(hào)”中最多，其次為“牡科稻5 號(hào)”，“牡育稻78 號(hào)中”最少。黃色區(qū)域框內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)如2-甲基-2-丙醇、2-甲基丁酮、2-正戊基呋喃、2-己烯醛單體、（E）-2-庚烯醛二聚體、2-己烯醛二聚體，苯乙醛、2-己烯醛單體、在“牡育稻78 號(hào)”中最豐富，其次為“牡科稻7 號(hào)”，“牡科稻5 號(hào)”中最少。紫色區(qū)域框內(nèi)物質(zhì)如辛6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛單體、辛醛二聚體，在“牡科稻5 號(hào)”中含量最少，在其它樣品中差異不大。

2.4 不同品種香稻米特征風(fēng)味物質(zhì)的相似度分析

采用主成分分析法對(duì)GC-IMS 數(shù)據(jù)降維，區(qū)分“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”中揮發(fā)性物質(zhì)特征，顯示數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。主成分分析用于將一組原始相關(guān)變量轉(zhuǎn)化為幾個(gè)獨(dú)立的不相關(guān)變量，這些不相關(guān)變量能夠解釋原始變量的大部分變化。本研究將牡丹江地區(qū)3 種不同品種的香稻米的GC-IMS 譜圖風(fēng)味成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖6A所示。采用儀器軟件計(jì)算試驗(yàn)中牡丹江地區(qū)“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”不同品種稻米樣本之間的歐幾里得距離，歐氏距離圖如圖6B所示，通過(guò)檢索最小距離確定樣品間的相似程度[30]。

圖6 不同品種香稻米揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相似度分析Fig.6 Similarity analysis of volatile flavor components in different varieties of fragrant rice

由圖6A 可知，主成分PC1 貢獻(xiàn)率為63%，PC2 的貢獻(xiàn)率為21%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到84%，能夠較好代表和解釋原始數(shù)據(jù)的大部分特征，3 個(gè)樣品能夠有效的分開(kāi)。PC1、PC2 的總貢獻(xiàn)率包含了不同品種香稻米樣品的大部分信息，能代表不同品種香稻米揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。“牡科稻5 號(hào)”和“牡育稻78 號(hào)”距離最遠(yuǎn)，表明這兩種香稻米的風(fēng)味存在較大差異，“牡科稻5 號(hào)”、“牡育稻78 號(hào)”與“牡科稻7 號(hào)”距離較近，表明稻米間的風(fēng)味差異較小。本研究采用GC-IMS 較好地區(qū)分不同品種的香稻米。由圖6B 可知，“牡育稻78號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”之間距離最近，相似度高，雖然，“牡育稻78 號(hào)”檢測(cè)平行樣品出現(xiàn)一個(gè)異常值，但整體結(jié)果與PCA 結(jié)果一樣，因此可以通過(guò)歐式距離直接對(duì)不同品種香稻米進(jìn)行區(qū)分。

3 結(jié)論

采用GC-IMS 可以較好地鑒別牡丹江地區(qū)“牡科稻5 號(hào)”、“牡育稻78 號(hào)”與“牡科稻7 號(hào)”3 種不同的香稻米品種。研究發(fā)現(xiàn)：香稻米中的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括酮類(lèi)7 種、醛類(lèi)16 種、醇類(lèi)9 種、呋喃1 種、醚類(lèi)1 種、吡啶1 種、芳香烴2 種、單萜類(lèi)1 種。本研究利用GC-IMS 技術(shù)檢測(cè)香稻米香氣成分，通過(guò)對(duì)“牡育稻78 號(hào)”、“牡科稻5 號(hào)”、“牡科稻7 號(hào)”、3 種不同品種的香稻米香氣成分的分析和比較，確定了特征香氣成分及其特征峰，如辛醛單體、辛醛二聚體、6-甲基-5-庚烯-2-酮，在“牡科稻5 號(hào)”中含量最少，在其它樣品中差異不大。羅勒烯、檸檬烯單體、檸檬烯二聚體在“牡育稻78 號(hào)”中含量多；乙醇、二甲基-1-丁醇，在“牡科稻7號(hào)”中最多。通過(guò)主成分分析和歐氏距離分析表明，“牡科稻5 號(hào)”、“牡育稻78 號(hào)”與“牡科稻7 號(hào)”3 種不同香稻米可通過(guò)GC-IMS 譜圖數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)區(qū)分。