針灸預處理對無水乙醇致急性胃黏膜損傷大鼠香草酸亞型1、降鈣素基因相關肽蛋白表達的影響

蘭永利 霍新慧 李盼 阿斯卡爾·牙生 韋芳

急性胃黏膜損傷又被稱為應激性潰瘍,通常是由于胃黏膜自身防御屏障功能被破壞下降而又被攻擊因子刺激所致[1]。而酒精刺激是造成急性胃黏膜損傷的主要原因之一,酗酒或者過量飲酒會強烈刺激胃黏膜[2],而且乙醇導致急性胃黏膜損傷的發病率呈逐年上升趨勢[3],對人們健康存在嚴重威脅。

中醫自古以來就有“以人為本”“治未病”的思想,“治未病”指施以治療手段防止疾病發生、發病之后防止發展,及時有效控制病情的發生發展[4],而國家積極倡導“健康中國”戰略,把保障人民健康放在優先發展的位置[5],這與中醫思想不謀而合,而針灸作為中醫學的重要組成部分,以其綠色、簡便、高效的治療手段很容易被人們普遍接受。本課題組前期實驗證明:針灸預處理能夠加強胃黏膜微循環屏障,上調與屏障相關的保護因子,下調損傷因子,達到對胃黏膜組織的保護作用[6]。

香草酸亞型1(transient receptor potential vanillic acid subtype 1,TRPV1)是一種在細胞膜表面存在的陽離子通道蛋白,對維持胃黏膜穩態具有積極作用[7];降鈣素基因相關肽(calcitonin gene and related peptide,CGRP)是一種生物活性多肽,可通過改善大鼠胃黏膜血流量,對乙醇誘導的胃黏膜損傷起到保護作用[8],而CGRP的合成分泌受到TRPV1調控。本研究通過觀察大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達水平的影響,探討針灸預處理抗無水乙醇致急性胃黏膜損傷的可能機制,以便為應用于預防疾病提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌雄各半大鼠52只,體質量(180～220)g,購自新疆醫科大學動物實驗中心,動物合格證號:SYXK(新)2018-0003。大鼠自由攝食、攝水,飼養室溫度:20～25℃,相對濕度:50%～54%,自然晝夜交替。

1.2 藥品與試劑

無水乙醇(天津市凱通化學試劑有限公司,執行標準:Q/STXH 286-2019),阿司匹林腸溶片(拜耳醫藥保健有限公司,規格100 mg×30片/盒,國藥準字:J20130078),ELISA試劑盒名稱:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),上海優選生物科技有限公司(批號:YX-E21174 批次:202205);白細胞介素6(interleukin-6,IL-6),上海優選生物科技有限公司(YX-E21122 批次:202205);表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF),上海優選生物科技有限公司(YX-E20968 批次:202205);三葉因子1(trefoil factor 1,TFF1),上海優選生物科技有限公司(YX-E28755 批次:202205)

1.3 主要儀器

一次性針灸針(華佗牌,規格0.25×13 mm),艾灸條(南陽漢醫艾絨有限責任公司,規格4 mm×120 mm),固定支架(知福堂,蘄春上工記艾灸器具開發有限公司),酶標分析儀(型號:Infinite F50,上海優選生物科技有限公司),高速冷凍離心機(德國,型號:Eppendorf 5415C),分光光度計(日本,型號:SHIMAZDU UV-2540),蛋白印跡儀(臺灣威泰克有限公司,型號:Yrdimes SW07D0567),臺式恒溫振蕩器(中國上海精宏實驗設備有限公司,型號:THZ-312),凝膠成像分析系統(臺灣威泰克有限公司,型號:KETA M多用凝膠成像系統)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組與干預方式 隨機將大鼠分為四組:正常組、模型組、預灸組、預針刺組,每組13只。在適應性飼養7天之后,每日上午10:00開始進行實驗操作。

腧穴的取穴依據《實驗針灸學》常用動物穴位定位法進行確定[9]。正常組和模型組:艾灸支架固定,20分鐘/次,不做處理,1次/天,連續7天。預灸組:艾灸支架固定,溫和灸懸灸中脘、足三里(雙),20分鐘/次,1次/天,持續7天。預針刺組:艾灸支架固定,一次性針灸毫針針刺中脘、足三里(雙),平補平瀉,20分鐘/次、1次/天,持續7天。每次處理結束之后,解除大鼠支架固定,回飼養室進行正常喂養。

1.4.2 造模 在預處理7天結束之后,第8天禁食不禁水,第9天開始對模型組、預灸組、預針刺組進行胃黏膜損傷模型的制備。應用動物實驗室常用灌胃手法,采用無水乙醇與阿司匹林混懸液法灌胃制備模型,阿司匹林腸溶片與生理鹽水(2 000 mg∶100 mL)配置成阿司匹林混懸液,先用無水乙醇0.6 mL/100 g進行灌胃,1小時后再予以阿司匹林混懸液200 mg/kg進行灌胃造模,造模4天。

1.4.3 標本采集 造模結束后,當天22:00禁食禁水,次日上午10:00開始取材。采用10%水合氯醛麻醉,起效后,腹主動脈取血,使用離心機離心后取上層血清。取完血后,統一解剖將全胃取出,在4%多聚甲醛中固定,用于指標檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 一般情況 對大鼠攝水攝食、毛發、大便、活動度,精神、體質量等一般情況進行觀察[10],體質量每4天測量一次。

1.5.2 評定胃黏膜損傷指數(ulcer index,UI) 采用Guth PH等[11]的方法計算:將胃黏膜組織應用生理鹽水沖洗干凈,然后平鋪于濾紙上,在10倍放大鏡下,用肉眼觀察,卡尺測量評估損傷程度:1分為損傷(包括糜爛點)不大于1 mm;2 mm≥損傷>1 mm為2分;3 mm≥損傷>2 mm為3分;4 mm≥損傷>3 mm為4分;損傷大于4 mm為5分;損傷寬度大于2 mm的時候計分加倍。UI評分為胃黏膜各處損傷計分后值的累加。

1.5.3 HE染色法觀察胃黏膜組織病理變化 胃黏膜損傷指數評定完成之后,應用10 %多聚甲醛溶液對胃組織進行固定、脫水、石蠟包埋等常規操作,而后選取胃黏膜糜爛程度最明顯地方切厚度為5 μm的薄片,之后進一步脫蠟脫水、HE染色,完成之后應用光學顯微鏡觀察大鼠胃黏膜的病理變化(×400)。

1.5.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、EGF、TFF1濃度 腹主動脈取血,3 000 r/min離心20分鐘,收集上清液,并在-80℃冰箱中儲存待測。嚴格遵照ELISA試劑盒方法說明進行操作,計算TNF-α、IL-6、EGF、TFF1的濃度水平。

1.5.5 免疫組化法檢測胃黏膜組織TRPV1、CGRP表達 取材結束后,每組隨機選擇5只大鼠,嚴格按照試劑盒方法進行操作,將常規石蠟包埋和組織切片經抗原修復后,用正常羊血清液封閉20分鐘,將配置好的TRPV1、CGRP一抗工作液(1∶100稀釋)滴加在組織上,4℃過夜,PBS洗滌后滴加生物素化第二抗體、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),DAB顯色、復染、封片后,400×的顯微照相,并進行圖像分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

一般情況:預處理期間,四組大鼠攝水攝食及二便情況正常,毛發有光澤、靈活好動,精神良好。造模后,模型組大鼠攝水攝食量較前明顯減少,大便夾有血絲,毛發暗淡,精神萎靡;預灸組和預針刺組大鼠較模型組情況有所改善。體質量比較:與造模前相比,各組大鼠針灸預處理后的體質量顯著上升(P<0.05);與針灸預處理后相比,模型組和預針刺組大鼠體質量顯著下降(P<0.05),而預灸組大鼠體質量顯著上升(P<0.05);與預針刺組相比,預灸組大鼠體質量有所上升(P<0.05),提示艾灸效果強于針刺。如表1。

表1 各組大鼠在制備胃黏膜損傷模型前后體質量對比

2.2 各組大鼠UI評分

正常組胃黏膜組織表面光滑。與正常組相比,模型組胃黏膜組織表面出現顯著出血灶,UI指數明顯上升(P<0.01),提示模型制備成功;與模型組相比,預灸組和預針刺組胃黏膜組織表面只有少量出血灶,UI指數下降(P<0.01),提示針灸預處理對預防胃黏膜損傷有效;與預針刺組相比,預灸組UI指數下降(P<0.05),提示艾灸效果強于針刺。如圖1,表2。

圖1 胃黏膜組織在肉眼下的形態觀察

表2 各組大鼠制備胃黏膜損傷模型UI評分比較

2.3 各組大鼠胃黏膜組織病理學形態變化比較

正常組大鼠胃黏膜組織未見病理改變,無滲出紅細胞;模型組大鼠存在嚴重的胃黏膜損傷,有大量紅細胞滲出;預灸組大鼠胃黏膜與正常組相似,未見病理改變;預針刺組大鼠胃黏膜大部分完整,只有少量紅細胞滲出。如圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織病理學形態變化的比較(HE染色,×400)

2.4 ELISA法檢測各組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、EGF、TFF1濃度水平的情況

與正常組相比,模型組TNF-α、IL-6濃度上升(P<0.05),EGF濃度下降(P<0.05),TFF1濃度有下降趨勢,但無統計學意義(P>0.05);與模型組相比,預灸組和預針刺組大鼠TNF-α、IL-6濃度下降(P<0.05),EGF水平上升(P<0.05),TFF1濃度有上升趨勢,但無統計學意義(P>0.05);與預針刺組相比,預灸組大鼠TNF-α、IL-6濃度下降(P<0.05),EGF水平上升(P<0.05),TFF1濃度有上升趨勢,但無統計學意義(P>0.05)如表3。

表3 ELISA檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6、EGF、TFF1濃度比較

2.5 免疫組化法檢測針灸預處理對胃黏膜損傷大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達的影響

與正常組比較,模型組大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達水平上升(P<0.05);與模型組相比,預灸組和預針刺組大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達水平下降(P<0.05);與預針刺組相比,預灸組大鼠TRPV1、CGRP蛋白表達水平下降(P<0.05)。如圖3、4,表4所示。

圖3 免疫組化法檢測針灸灸預處理對急性胃黏膜損傷大鼠TRPV1蛋白表達的影響(×200)

圖4 免疫組化法檢測針灸預處理對急性胃黏膜損傷大鼠CGRP蛋白表達(×200)

表4 免疫組化染色顯示各組大鼠胃黏膜組織中TRPV1、CGRP蛋白表達水平比較

3 討論

急性胃黏膜損傷的臨床表現為胃黏膜淺表性潰瘍、糜爛或者出血[12],一般是由于胃黏膜受到攻擊因子刺激使自我防御和修復功能遭到破壞。隨著醫療、科學技術水平的不斷提高,現代醫學應用各種抑制劑藥物治療胃黏膜損傷已經取得不錯效果,但隨著人們養生意識的不斷增強,“未病先防”思想越來越強烈,《素問·四氣調神大論篇》提到“是故圣人不治已病治未病,不治已亂治未亂”,明確強調了“未病先防”的重要性[13]。而針刺和灸法較于中醫其他手段來講,其簡便、安全、綠色的優點更容易被人們所接受,特別是灸法,孫思邈在《備急千金要方》中為其“治未病”奠定了理論基礎[14]。

本研究采用胃經的合穴足三里和募穴中脘配合使用,以防止胃黏膜損傷的方法為“合募配穴[15]。急性胃黏膜損傷以其臨床表現在中醫學屬于“胃脘痛”,為脾胃系統疾病[16],而足三里和中脘穴作為治療脾胃系統疾病的常用穴位,相互配合使用,可激發胃氣、調理中焦氣機、祛邪扶正,調和陰陽。有研究表明,在治療脾胃疾病方面,足三里、中脘運用頻次最高,每一證型及癥狀均選取兩穴為主穴[17]。

本文通過應用無水乙醇制備大鼠急性胃黏膜損傷模型,為防止大鼠胃黏膜損傷后的自愈,1小時后給予阿司匹林混懸液灌胃。大量飲酒后,乙醇代謝不及時,在胃內潴留,刺激胃黏膜,降低胃黏膜自我修復因子的保護作用,并顯著影響胃黏膜的生理功能[18]。在本次實驗取胃黏膜組織后,與正常組對比,模型組大鼠肉眼觀察下的胃黏膜組織出血、糜爛明顯,且HE染色發現胃黏膜上皮細胞固有層充血、出血明顯,提示大鼠無水乙醇致急性胃黏膜損傷模型制備成功。

TNF-α、IL-6是常見的炎癥因子,其濃度水平上升提示炎癥反應,胃黏膜組織遭到破壞。EGF可促進細胞再生能力,提高胃黏膜自我防御,TFF1主要在胃黏膜表面表達,可促進黏膜的再生與修復[19],其濃度下降表明是胃黏膜發生了病理性改變。TRPV1可參與炎癥反應的發生,在胃黏膜損壞發病機理中至關重要。CGRP是重要的具有負向調節功能的免疫調節肽[20]。本實驗研究中,與正常組相比,模型組大鼠TNF-α、IL-6水平上升,EGF、TFF1水平下降,TRPV1、CGRP蛋白表達水平上升;與模型組相比,預灸組和預針刺組大鼠TNF-α、IL-6水平下降,EGF、TFF1水平上升,TRPV1、CGRP蛋白表達水平下降;與預針刺組比較,預灸組大鼠TNF-α、IL-6水平下降,EGF、TFF1水平上升,TRPV1、CGRP蛋白表達水平下降,提示針刺和艾灸預處理可通過調控TRPV1、CGRP蛋白表達水平,降低炎性因子濃度,提高抗炎因子濃度,從而增強胃黏膜的自我修復和防御能力,減輕胃黏膜的損傷程度。艾灸預處理效果強于針刺預處理。

綜上所述,應用針灸預處理“治未病”可預防胃黏膜損傷,進而減輕由胃黏膜損傷引發的消化系統其他病癥,作用機制可能是通過影響TRPV1、CGRP蛋白表達水平來實現的,可為臨床預防胃黏膜損傷提供理論基礎,但是針灸預防胃黏膜損傷還有其他作用機制,需要進一步進行實驗探討。