光活化消毒輔助治療慢性牙周炎的療效

錢為民 ，曹良菊 ，蔣 愉 ，蒲 丹 ，母鳳婷 ，潘永圣

（1）昆明市第一人民醫(yī)院口腔科;2）檢驗科;3）科教科，云南 昆明 650224）

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是一種由菌斑微生物及其產(chǎn)物為始動因子的感染性疾病，齦下刮治及根面平整術(shù)（scaling and root planing，SRP）清除局部牙石及菌斑是慢性牙周炎最重要的非手術(shù)治療措施。當(dāng)探診深度（probing depth，PD）＞6 mm，臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）≥5 mm 和探診出血（bleeding on probing，BOP）增加時，病變呈中、重度牙周炎狀態(tài)[1?2]，單純的SRP 療效有限，需要添加其他的輔助治療以提高療效。SRP 后牙周袋內(nèi)局部注入鹽酸米諾環(huán)素軟膏是目前臨床認(rèn)可最為常用和有效的輔助治療。然而，抗生素長期頻繁使用存在牙周病原體耐藥性增加的困擾，所以臨床需要其他更安全有效的牙周輔助治療。

光活化消毒（photo-activated disinfection，PAD）屬于新型的光動力類殺菌技術(shù)，該技術(shù)作為一種非侵入性局部治療手段正逐步應(yīng)用于口腔臨床醫(yī)療。文獻(xiàn)回顧均表明[3?4]：在牙周診療中輔助使用光動力類技術(shù)能為機械清創(chuàng)術(shù)提供了額外的效益，包括殺滅多種牙周致病菌，以及減少PD、BOP 和 CAL。但是該技術(shù)與抗生素療效的對比研究罕見報道，同時使用光活化消毒與抗生素聯(lián)合輔助治療的研究也未見報道。

選取中重度慢性牙周炎患者為研究對象，先進行常規(guī)SRP，再根據(jù)不同的輔助治療進行分組，A 組：鹽酸米諾環(huán)素（陽性對照組）；B 組：PAD（實驗組1）；C 組：鹽酸米諾環(huán)素+PAD（實驗組2）；D 組為無輔助治療（空白對照組）。記錄治療前后各組患牙的臨床牙周指標(biāo)PD、CAL 和BOP；同時觀察A、B、C 3 個輔助治療組牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）和福賽坦氏菌（tannerella forsythia，Tf）的變化，以評論PAD 對中重度慢性牙周炎的輔助治療效果。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2019 年 1 月至2022 年 1 月，從就診于昆明市第一人民醫(yī)院口腔科的慢性牙周炎患者中篩選適宜研究對象。

入選標(biāo)準(zhǔn)[5?6]：（1）慢性牙周炎患者，20～60歲，能配合治療及復(fù)查；（2）不少于20 顆完全萌出的牙以保證相對穩(wěn)定的咬合關(guān)系；（3）至少在口腔的2 個象限有不少于4 個位點的牙周袋深度≥5 mm，樣本采集牙為天然后牙（取PD≥5 mm 的位點分析），松動度≤II 度。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）吸煙者；（2）妊娠或哺乳期女性；（3）治療前 1 個月曾使用抗生素治療者，需長期使用抗生素、免疫抑制劑者；（4）某些可能影響研究結(jié)果的全身系統(tǒng)性疾病患者（如未控制的糖尿病、免疫缺陷等）；（5）既往有甲苯胺藍(lán)過敏史者；（6）其他不能配合治療及研究的患者。本研究謹(jǐn)遵守 1975 年赫爾辛基宣言（2000 年修訂）[7]，經(jīng)昆明市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：YLS2020-24。

1.2 診療及收據(jù)采集過程

基線時，受試者患牙接受簡單清潔去除牙面尤其是牙頸部大塊齦上牙石及菌斑后接受第9 代FP32 牙周電子探針檢查（Florida Probe，USA），記錄初始牙周指標(biāo)數(shù)據(jù)；隔濕，Gracey 齦下刮治器（Hu?Friedy，USA）采集目標(biāo)牙的全部齦下菌斑標(biāo)本放入裝有1.5 mL PBS 緩沖液的Eppendorf 管中，密封，標(biāo)本用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen，北京）行DNA 的提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

牙周基礎(chǔ)治療過程由牙周專科醫(yī)生使用牙周治療儀（Odontogain，Danmark）及Gracey 齦下刮治器（Hu-Friedy，USA）進行SRP，3%雙氧水及0.9%生理鹽水交替沖洗。根據(jù)輔助治療不同分為4 組：A 組患牙鹽酸米諾環(huán)素軟膏（派麗奧，日本）牙周袋內(nèi)上藥，每周1 次，共4 次；B 組患牙PADTMPLUS 光活化治療儀（Denfotex，UK）袋內(nèi)殺菌，2 周1 次，持續(xù)2 次；C 組患牙PAD 殺菌，2 周1 次，共2 次，同時鹽酸米諾環(huán)素軟膏上藥，每周1 次，共4 次；D 組患牙無輔助治療。

同一患者同側(cè)牙列采取同種輔助治療措施，研究牙位均為天然后牙。在操作中醫(yī)生使用棉卷隔濕，助手配合吸唾盡量降低同一患者因不同輔助治療潛在的沾染問題；操作順序為先上頜后下頜，先PAD 袋內(nèi)殺菌，完成操作后使用大量生理鹽水反復(fù)沖洗干凈并拭干牙齦后，后行鹽酸米諾環(huán)素軟膏牙周袋內(nèi)上藥。

復(fù)診及采樣：SRP 完成后6 周及12 周復(fù)診，按基線時方法進行各組牙周電子探針檢查（Florida Probe，USA）記錄牙周臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)，同時輔助治療組目標(biāo)牙齦下菌斑標(biāo)本采集，細(xì)菌DNA 提純及保存。

1.3 齦下菌斑標(biāo)本中Pg 和Tf 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測

根據(jù)文獻(xiàn)[8?9]報道的方法設(shè)計Pg 和Tf 2 種牙周致病菌的引物。

Pg（F）AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG 729-1132（404）

（R）ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT

Tf（F）GCG TAT GTA ACC TGC CCG CA 120-760（641）

（R）TGC TTC AGT GTC AGT TAT ACC T

使用PCR 擴增儀SLAN 96 進行real-time PCR SYBR green I 檢測模式進行檢測，反應(yīng)結(jié)束后得出Pg Ct 值和Tf Ct 值。

在熒光定量PCR 產(chǎn)物擴增曲線的指數(shù)增長階段，當(dāng)累積了足夠的擴增產(chǎn)物，可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時，這個循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即Ct，Ct 值主要由擴增反應(yīng)體系中模板的初始濃度決定。如果模板初始濃度高，只需要較少的擴增循環(huán)就可以累積足夠的產(chǎn)物，產(chǎn)生高過背景的熒光信號，因此，反應(yīng)就有一個小或早出現(xiàn)的Ct；相反，如果模板初始濃度低，需要較多的擴增循環(huán)才能產(chǎn)生高過背景的熒光信號，反應(yīng)就有一個大或遲出現(xiàn)的Ct。因此，Ct 值可反向反映某細(xì)菌在樣本中相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

選取SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，采用隨機對照實驗的方法探討不同治療方式的療效，牙周臨床指標(biāo)計量資料不滿足正態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位間距描述，組間組內(nèi)比較用廣義估計方程模型。牙周致病菌計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，不同治療方式各個時間點的比較采用重復(fù)測量方差分析。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本研究共納入受試者21 例，男性10 例，女性11 例，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患牙位點共218 個，其中A 組56 個（25.7%），B 組53 個（24.3%），C 組55 個（25.2%），D 組54 個（24.8%）。

2.2 牙周臨床指標(biāo)

PD 的比較中治療方式和時間存在交互作用（χ2=48.862，P＜ 0.001）。縱向比較：4 個組在治療后PD 值較基線均下降，其中A、B、C 3 組PD值呈持續(xù)下降，A 組不同時間點PD 值差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；而B、C、D 3 組6 周和12 周的PD 數(shù)據(jù)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。橫向比較：治療6 周，A、B、C3 組PD 值均較D組低（P＜ 0.05），其中B 組、C 組PD 值下降趨勢較A 組、D 組明顯（P＜ 0.05）；治療12 周，A、B、C3 組PD 值均較D 組低，C 組PD 值低于A 組，以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 4 組不同時間點PD 的比較[M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of PD at different time points in the four groups [M（P25，P75）]

CAL 的比較中治療方式和時間存在交互作用（χ2=233.168，P＜ 0.001）。縱向比較：4 個組在治療后CAL 值均較基線時下降，其中A、B、C 3組CAL 值隨著時間呈持續(xù)下降，各時間點間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），而D 組治療6 周和12 周差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。橫向比較：治療6 周和12 周A、B、C 3 組CAL 值均低于D 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表2。

BOP 的比較中治療方式和時間存在交互作用（χ2=13.257，P=0.039）。縱向?qū)Ρ龋? 個組BOP值在治療后較基線時均下降，治療后6 周和12 周差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。橫向?qū)Ρ龋褐委熀?2 周，A、B、C 3 組BOP 值均低于D 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），而A、B、C3 組間在各時間段BOP 值均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.05），見表3。

表3 4 組不同時間點BOP 的比較[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of BOP at different time points in the four groups [M（P25，P75）]

2.3 牙周致病菌數(shù)據(jù)分析

不同處理方式時相間Pg 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.307，P＜ 0.001），不同治療方式Pg 隨時間的變化趨勢差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.591，P=0.204）。

不同處理方式時相間Tf 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=46.132，P＜ 0.001），不同治療方式Tf 隨時間的變化趨勢差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.301，P=0.275）。

基線時，A、B、C 3 組初始Pg Ct 值和Tf Ct值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），在治療6 周后，3 組Pg Ct 值和Tf Ct 值均較基線增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001），不同組Pg Ct 值和Tf Ct值隨時間的變化趨勢差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在治療12 周后，3 組組內(nèi)比較顯示Pg Ct值和Tf Ct 值均較基線增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001），12 周各組數(shù)據(jù)較6 周時差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），不同組Pg Ct 值和Tf Ct 值隨時間的變化趨勢差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表4。

表4 3 個輔助治療組不同時間點Pg Ct 值和Tf Ct 值的比較 M（P25，P75）Tab.4 Comparison of Pg Ct and Tf Ct at different time points in the three groups M（P25，P75）

3 討論

治療前4 個組牙周臨床數(shù)據(jù)均達(dá)到中、重度牙周炎標(biāo)準(zhǔn)，進行治療后6 周和12 周各組的PD、CAL 和BOP 均低于基線，證實了牙周非手術(shù)治療的有效性。

輔助治療組與空白對照組牙周臨床指標(biāo)進行比較：治療后6 周和12 周3 個輔助治療組PD 和CAL 均低于無輔助治療的空白對照組，12 周3 個輔助治療組BOP 亦低于空白對照組。12 周時，3個輔助治療組PD 較6 周時仍持續(xù)下降，而空白對照組則出現(xiàn)了PD 較6 周上升。以上牙周臨床指標(biāo)改變情況說明：在SRP 基礎(chǔ)上使用3 種輔助治療的任意一種對牙周臨床指標(biāo)的改善程度和持續(xù)性均優(yōu)于單純的SRP。

眾所周知，完善的SRP 后牙周組織炎癥和骨吸收得到控制。然而磨牙區(qū)可能存在深而窄及形態(tài)不規(guī)則的牙周袋、根分叉區(qū)或根面凹陷區(qū)等特殊的解剖位置，在標(biāo)準(zhǔn)的SRP 操作下仍存在19%～66%的殘留牙石菌斑，成為牙周再感染的原因，所以對中重度牙周炎患牙常行輔助治療[10]。米諾環(huán)素有較好的抗菌作用，能顯著抑制膠原酶活性，減輕炎癥，促進成纖維細(xì)胞的附著及生長[11]。光活化消毒 以特定波長的光激發(fā)光敏劑，后者吸收光子而釋放出具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧和活性氧（reactive oxygen species，ROS）。單線態(tài)氧通過損傷微生物的細(xì)胞壁和核酸引起其裂解、死亡，有效殺滅微生物[12?13]。ROS 可誘導(dǎo)牙周炎癥組織中廣泛浸潤的巨噬細(xì)胞凋亡，減少牙槽骨吸收，減輕局部免疫炎癥的同時抑制破骨細(xì)胞活動、加速骨形成[14]。

陽性對照組與實驗組臨床指標(biāo)進行比較：治療后6 周，3 個輔助治療組的PD、CAL 均低于基線，使用過PAD 滅菌的2 個實驗組PD 值的下降情況均較使用鹽酸米諾環(huán)素局部上藥的陽性對照組明顯；治療后12 周，3 個輔助治療組的PD 均較6 周時進一步下降，使用過鹽酸米諾環(huán)素的兩個組PD 的下降程度較PAD 組更明顯，鹽酸米諾環(huán)素組PD 下降至與PAD 組同等程度，而同時使用了鹽酸米諾環(huán)素和PAD 的聯(lián)合輔助治療組對PD 控制效果最佳。各組BOP 和 CAL 控制效果均較好，改善程度差異不明顯。以上牙周臨床指標(biāo)變化情況可知：PAD 組對PD 改善效果在短期內(nèi)優(yōu)于鹽酸米諾環(huán)素組，鹽酸米諾環(huán)素軟膏具有緩釋性，至12 周時2 組療效可達(dá)到同樣程度；而聯(lián)合輔助治療的位點在各時間段的療效均優(yōu)于其他組，兼具鹽酸米諾環(huán)素組和PAD 組的優(yōu)勢。

陽性對照組與實驗組牙周致病菌數(shù)據(jù)進行比較：在基線時3 個組Pg 和Tf 含量無差異，在治療6 周和12 周后，3 個組Pg 和Tf 含量均較基線時明顯下降。12 周時牙周致病菌Pg 和Tf 含量維持6 周時的濃度，組間比較均無差異。以上牙周致病菌數(shù)據(jù)變化情況可知：3 種輔助治療方式對Pg 和Tf 的控制效果一致。

Pg、Tf 都是有代表性的牙周致病菌能分泌大量毒力因子產(chǎn)生致病酶，抑制或逃避宿主的非特異性免疫功能，損害牙周組織，對宿主全身免疫系統(tǒng)也具有一定攻擊。Pg 是慢性牙周炎病變區(qū)或活動部位最主要的優(yōu)勢菌，與牙周炎治療后復(fù)發(fā)或病情加重有關(guān)。Tf 則常存在于活動性重度牙周炎附著喪失處的齦下菌斑。用于牙周的鹽酸米諾環(huán)素呈軟膏狀有流動性和黏著性，牙周藥物濃度可長時間維持，7 天后仍有0.1 ug/ml。光動力治療可殺滅多種牙周致病菌[15?17]，Pg、Tf 對該系統(tǒng)敏感[18]。PAD 能在短時間內(nèi)殺滅大量致病菌，縮短愈合時間，減少術(shù)后菌血癥的發(fā)生[19?20]。PAD的光敏劑甲苯胺藍(lán)（toluidineblueO，TBO）呈液態(tài)易于滲入牙周袋，TBO 對生物膜中的細(xì)菌也有活性，能更為高效地殺滅致病菌[21]。Meta 分析認(rèn)為光活化消毒可為機械清創(chuàng)術(shù)提供了額外的短期效益，而支持其臨床中長期療效的證據(jù)不足[22?23]。本次研究每名受試者觀察時間達(dá)12 周，脫離醫(yī)生的時間較長，但是牙周臨床指標(biāo)仍然保持在較好水平，這說明療效維持至少12 周。

對于光動力治療的使用頻率，Ge[24]認(rèn)為該技術(shù)能很好地控制牙齦出血，療效與使用頻率無關(guān)；其他研究則認(rèn)為增加使用頻率可以加強其殺菌效能[25]。參考了前期學(xué)者的經(jīng)驗，考慮到存在患者因治療時間長而張口受限，SRP 后牙周袋內(nèi)滲血、齦溝液流量增大等情況，而這些情況對PAD 殺菌效果的影響尚未可知，所以本研究中PAD 滅菌均分2 次進行，第1 次在完成SRP 及止血沖洗后進行，目的是殺滅高濃度的致病菌；2 周時再進行一次PAD 以確保滅菌效果。PAD 組患者就診次數(shù)少于鹽酸米諾環(huán)素袋內(nèi)用藥的患者，可獲得更為舒適便捷的診療體驗。

在安全性方面，光活化反應(yīng)中所生成的單線態(tài)氧生命周期不超過 0.3 μs，作用范圍不超過0.05 μm，不會對牙周組織造成損傷[26?28]。PAD 在牙周袋內(nèi)進行消毒時對牙髓溫度的升高低于3 ℃，對牙髓完全無損害[29]。通過隨訪，患者在PAD治療過程中及治療后均沒有感受到疼痛或其他不適。光活化消毒沒有鹽酸米諾環(huán)素的耐藥性疑慮，更有研究發(fā)現(xiàn)PAD 可殺滅多重耐藥菌[30]；其對牙周致病菌的殺滅具有選擇性，不影響人體正常口腔組織和其他寄生菌群的生長，細(xì)胞毒性在常規(guī)水平內(nèi)。由此可知，PAD 的使用安全方面優(yōu)于鹽酸米諾環(huán)素。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療12 周后單純進行SRP 治療的空白對照組PD 較6 周時升高，多個組Pg、Tf 濃度較6 周時亦略有增加，盡管這些改變無統(tǒng)計學(xué)意義，可是菌斑是細(xì)菌定植的臨床標(biāo)志，探診深度是臨床評估牙周支持組織喪失程度主要指標(biāo)，故這一現(xiàn)象仍值得重視和分析。經(jīng)過積極的牙周基礎(chǔ)治療后牙周炎癥得到控制，當(dāng)牙周臨床指標(biāo)BOP（+）位點在20%～ 25%以下，PD≤3 mm，通常認(rèn)為病變進入靜止期狀態(tài)[31]，牙周治療以維護牙周健康狀態(tài)為主。然而，牙菌斑是不斷再附著的，僅由患者的自我保健措施無法做到菌斑控制，治療后2～3 個月后附著的菌斑可導(dǎo)致牙周組織炎癥呈現(xiàn)不同程度的反彈，所以及時清除患者口腔內(nèi)重新沉積的牙石及再附著的菌斑是牙周炎治療成功的關(guān)鍵所在。牙周炎患者復(fù)診間隔不應(yīng)超過半年，牙周積極治療完成第1 年內(nèi)常規(guī)每3個月復(fù)查1 次，至少每6 個月進行一次專業(yè)有效的機械性菌斑清除。

綜上所述，PAD 可替代鹽酸米諾環(huán)素作為中重度慢性牙周炎SRP 后的輔助治療，控制牙周致病菌減輕組織炎癥；同時使用PAD 和鹽酸米諾環(huán)素作為SRP 的輔助治療能更好地改善牙周探診深度，但是仍然需要進一步高質(zhì)量的隨機對照試驗來驗證。