翟 譽,李慶蓉,李 江,何 薇,和平安,呂 梅,楊 旭

(昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科,云南 昆明 650032)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, KP)是社區和醫院中常見的一種病原菌。近年來隨著臨床對碳青霉烯類抗生素的過度使用,耐碳青霉烯類細菌的檢出率不斷增加。據中國細菌耐藥監測網數據顯示,我國新生兒2019、2020、2021年耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率分別為14.5%、15%和13.4%,遠高于老年組(>65歲)、成人組(14～65歲)和兒童組(<14歲)[1]。復旦大學附屬兒童醫院的一項研究[2]表明,新生兒CRKP感染發生率較高,是新生兒健康的一大威脅,嚴重危害公共衛生安全[3]。胃腸道定植是CRKP感染的潛在危險因素[4],新生兒因腸道屏障功能和免疫功能不全而易于定植CRKP,使CRKP腸道定植成為繼發感染的潛在原因[5]。雖然已有新生兒CRKP定植及其分子流行病學的相關報道[6],但對新生兒CRKP腸道定植及定植后繼發感染的相關因素與同源性關系的研究較少,定植與定植后繼發感染的相關因素尚不明確,且無新生兒CRKP腸道定植的保護因素的探究,因此,了解新生兒腸道定植及定植后繼發感染的影響因素有利于醫院感染控制措施的完善與實施。

本研究旨在通過收集某院新生兒科的臨床病歷信息,分析新生兒CRKP腸道定植及定植后繼發感染的危險及保護因素,并通過多位點序列分析(MLST)與脈沖場凝膠電泳(PFGE)的方法來探究新生兒腸道定植轉為感染的CRKP菌株之間的同源性關系。研究定植及定植后繼發感染的影響因素,控制危險因素,加強保護因素,降低新生兒CRKP腸道定植和定植后繼發感染的發生率。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年1月—2022年10月昆明醫科大學第二附屬醫院入住新生兒科的新生兒為研究對象。

1.2 研究方法

1.2.1 研究分組 新生兒入院后48 h內進行一次耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)主動篩查,并在住院期間每周進行一次CRE肛拭子主動篩查。納入標準:CRKP腸道定植組,糞便培養或肛周拭子CRE篩查陽性且鑒定為CRKP;非CRKP腸道定植組,48 h內兩次糞便培養或肛周拭子CRE篩查陰性。CRKP腸道定植后繼發感染組:已發生CRKP腸道定植,明確有臨床感染癥狀且標本中分離出CRKP菌株。排除標準,入院后48 h內未進行糞便/肛拭子主動篩查的新生兒和入院前有證據表明存在CRKP定植或已發生臨床感染癥狀的新生兒。

在定植相關因素分組中將發生CRKP腸道定植的新生兒作為定植組,共174例,采用隨機抽樣的分層抽樣法對非定植新生兒抽樣,保證定植組和非定植組在相同時間段入院,最終篩選出174例無CRKP腸道定植的新生兒作為非定植組。定植組與非定植組兩組的病例基礎狀態一致。同時在分析定植繼發感染的相關因素中,將研究對象分為感染組與非感染組,感染組為35例已確診腸道CRKP定植且在住院期間發生CRKP臨床感染的新生兒;非感染組為139例已確診腸道CRKP定植但在隨后住院期間未發生CRKP臨床感染的新生兒。

1.2.2 診斷標準 CRKP定植定義為新生兒僅有直腸拭子分離培養陽性,但未表現出臨床體征和/或癥狀。因CRKP菌株分離自新生兒腸道,因此定植來源為內源性。根據2001年衛生部頒發的《醫院感染診斷標準(試行)》[7]。CRKP感染定義為新生兒至少有一份臨床分離陽性標本,并且表現出臨床感染陽性體征和/或癥狀和有相應的其他實驗室陽性指標。本研究將整個住院時間作為CRKP發生定植到感染的隨訪時間。且將確定為CRKP腸道定植48 h后出現的臨床感染定義為篩查標本和臨床標本之間的“后續”感染。

1.2.3 資料收集及菌株來源 新生兒臨床資料均從電子病歷系統查閱獲得。定植相關因素納入時間為發生定植前3天,定植繼發感染相關因素的納入時間為定植后到發生繼發感染癥狀前。相關因素內容包括:(1)新生兒因素。性別、低體重(<2 500 g)、極低體重(<1 500 g)、早產兒、試管嬰兒、母乳喂養、羊水污染、Apgar評分≤7分、腹瀉、低蛋白血癥[清蛋白(Alb)<35 g/L]、中性粒細胞減少癥(外周血中性粒細胞絕對值<1.5×109/L)、神經系統疾病、消化道出血(有相應的臨床癥狀、符合消化道出血的實驗室檢查、影像學檢查結果)、鼻胃管喂養、氣管插管、機械通氣、灌腸、口服益生菌,以及使用糖皮質激素、氟康唑、碳青霉烯類抗生素、氨基糖肽類抗生素、頭孢菌素類抗生素、青霉素類抗生素。(2)母親因素。多胎妊娠、胎膜早剝、剖宮產、高齡(>35歲)、妊娠高血壓、妊娠糖尿病。(3)環境因素。入住新生兒重癥監護病房(NICU)、總住院時間。同時對定植后繼發感染的35例新生兒于2022年1—10月采集糞便/肛拭子和血/痰標本進行培養,從中培養、分離非重復CRKP菌株。將這些非重復CRKP菌株純化、冷凍干燥,保存于-80℃冰箱備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 主要儀器與試劑 儀器:VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀(法國梅里埃公司);基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)(德國布魯克公司);Thermo SeriesⅡWater Jacket CO2溫箱;法國生物梅里埃DENSICHEK電子比濁儀;郎基聚合酶鏈式反應(PCR)基因擴增儀A300(杭州郎基科學儀器有限公司);君意JY300C通用型電泳儀(北京君意儀器公司);凝膠成像分析系統-JY04S-3C(北京君意儀器公司);高速冷凍離心機(大龍興創實驗儀器有限公司);恒溫金屬浴(杭州奧盛);海爾-80℃冰箱。質控菌株:大腸埃希菌ATCC 25922。試劑:VITEK 2 GN鑒定卡和VITEK 2 AST-GN334藥敏卡(法國生物梅里埃公司);麥康凱培養基、Mueller-Hinton培養基(鄭州安圖生物工程股份有限公司);PCR擴增試劑(1×TSE101金牌mix、ddH2O、引物)、5 000 bp DNA分子量標準(DNA Marker)、含蛋白酶K的細胞裂解液、EB染料、瓊脂糖、LB瓊脂平板(北京擎科生物科技公司)。

1.3.2 菌株鑒定 使用VITEK 2全自動微生物分析儀對所有分離菌株進行鑒定。同時采用MALDI-TOF MS對平板上的單個菌落進行復核,確保試驗菌株為CRKP菌株。

1.3.3 DNA提取 采用煮沸法提取菌株DNA。挑取3個純菌落置于含有500 μL含有滅菌雙蒸水的EP管中,充分混勻制成菌懸液后于金屬浴中加熱10 min,使用高速離心機13 000 r/min離心5 min,離心后所得上清液即為DNA模板。

1.3.4 碳青霉烯酶基因檢測 參照GeneBank中目標基因的標準序列并查閱相關文獻[8]選取引物,采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增35例新生兒分離的CRKP菌株DNA模板中的碳青霉烯酶耐藥基因(blaKPC-2、blaNDM-1、blaOXA-48、blaIMP)。將得到的擴增產物送至北京擎科生物科技公司進行測序,測序結果在NCBI BLAST網站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對。引物序列見表1。

表1 CRKP菌株PCR擴增耐藥基因引物序列及產物大小

1.3.5 MLST檢測 參照MLST網站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.htmlpasteur.fr)提供的引物序列,擴增KP的7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB),將擴增產物送至北京擎科生物科技公司測序。

1.3.6 PFGE檢測 為更詳細地分析CRKP菌株之間的同源性,進行PFGE檢測。首先將標本接種于LB瓊脂平板,37℃過夜,用bioMérieux DENSIMAT比濁儀調整細菌懸液濃度,使濁度為3.8～4.2。加入1% Seakem Gold膠,混勻制備膠塊。使用含蛋白酶K的細胞裂解液(CLB)消化2 h。純水清洗膠塊2次;TE(10 mmol/L Tris:1 mmol/L EDTA,pH值8.0)清洗膠塊4次。使用XbaI內切酶進行酶切,在37℃孵育4 h。在CHEF-DRIII(Bio-Rad Laboratories公司)電泳儀中進行PFGE。電泳后將膠放入含1 μg/mL溴化乙啶(EB)染色25～30 min,置純水中脫色至少90 min,每30 min換一次純水。在讀膠儀中成像。

將獲得的PFGE圖像錄入BioNumerics(Version 8.0,Applied Maths, Belgium)軟件包進行處理,經統一的分子質量標準,分子量標準用沙門菌H9812經過XbaI酶切后的片段標定條帶位置,識別圖像條帶,必要時進行手工校正,<20.5 Kbp的條帶忽略不計。每兩個圖像之間的相似性系數用Dice系數(Dice coefficient)表示,根據每兩個圖像之間的相似性系數,用非加權配對算術平均法(unweighted pair-group method using arithmetic ave-rages, UPGMA)進行聚類,構建聚類樹。

1.4 統計學方法 應用SPSS 26.0統計軟件進行錄入與分析。對于符合正態分布的計量資料采用t檢驗,對于非正態分布的計量資料采用非參數檢驗(Mann-Whitney秩和檢驗),總住院時間以中位數(四分位數間距)[M(P25,P75)]表示;計數資料采用卡方檢驗或Fisher確切概率法,以例或百分比(%)表示。影響因素分析時,先對各種可能因素進行單因素分析,再將單因素分析中P≤0.05的因素納入多因素分析,多因素分析采用二元logistic回歸模型。P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 新生兒CRKP腸道定植的影響因素 共有174例定植組與174例非定植組新生兒進行CRKP腸道定植相關因素的分析。2021年1月—2022年10月該院新生兒腸道CRKP總定植率為12.1%(174/1 438)。單因素分析結果表明,低體重(<2 500 g)、早產兒、多胎、Apgar評分≤7分、剖宮產、母乳喂養、入住NICU、鼻胃管喂養、機械通氣、氣管插管、腸外營養、灌腸、低蛋白血癥、消化道出血、口服益生菌、總住院時間長、使用糖皮質激素,以及使用碳青霉烯類、氨基糖肽類、頭孢菌素類、青霉素類抗生素和氟康唑在定植組和非定植組間比較,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 新生兒CRKP定植影響因素的單因素分析[例(%)]

將單因素分析中有統計學意義的變量進行二元logistic回歸分析,剖宮產、使用頭孢菌素類抗生素、鼻胃管喂養是新生兒發生CRKP定植的獨立危險因素(均OR>1,P<0.05)。母乳喂養、口服益生菌、灌腸是保護因素(均OR<1,P<0.05)。見表3。

表3 新生兒CRKP定植影響因素的logistic回歸分析

2.2 新生兒CRKP腸道定植后繼發感染的影響因素 2021年1月—2022年10月,該院新生兒科CRKP定植后繼發感染的新生兒共35例,占新生兒科所有CRKP腸道定植新生兒的20.1%(35/174)。感染組35例新生兒與非感染組139例新生兒進行CRKP腸道定植后繼發感染相關因素的分析。CRKP腸道定植后繼發感染危險因素的單因素分析結果顯示:極低體重(<1 500 g)、早產兒、母乳喂養、入住NICU、低蛋白血癥、神經系統疾病、消化道出血、鼻胃管喂養、氣管插管、機械通氣、灌腸、總住院時間長、使用糖皮質激素,以及使用碳青霉烯類、氨基糖肽類抗生素、氟康唑在感染組和非感染組間比較,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 CRKP繼發感染影響因素單因素分析[例(%)]

將單因素分析中有統計學意義的變量進行二元logistic回歸分析,使用碳青霉烯類抗生素、總住院時間長是CRKP定植后繼發感染的獨立危險因素(均OR>1,P<0.05)。見表5。

表5 CRKP繼發感染影響因素的logistic回歸分析

2.3 碳青霉烯酶耐藥基因檢測結果 將從感染組分離的CRKP菌株耐藥基因序列與NCBI網站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對,結果顯示感染組CRKP菌株產碳青霉烯基因均為blaKPC-2。同時未發現攜帶blaNDM-1、blaIMP、blaOXA-48耐藥基因類型的CRKP菌株。部分CRKP菌株的KPC-2耐藥基因型檢測結果見圖1。

注:M為DNA Marker;1、2、3、4、5、10為部分新生兒的糞便(肛拭子)標本分離的定植菌;11、12、13、14、22、24為感染后其血或痰標本分離的感染菌。

2.4 MLST結果 將測序結果在MLST網站上進行比對,獲得每個管家基因的等位基因編號。參照MLST網站比對CRKP分離菌株的等位基因編號,其編號為3-3-1-1-1-1-4,根據分析得出腸道CRKP定植菌與定植后繼發感染CRKP菌株的序列分型全部為ST11型。

2.5 PFGE結果 對感染組中來自糞便(肛拭子)標本、痰或血標本中的菌株進行復蘇,共成功復蘇7株肛拭子標本和7株對應新生兒的痰或血標本中的CRKP菌株。將14株成功復蘇的CRKP菌株進行PFGE分型,PFGE聚類分析圖譜顯示,此14株CRKP菌株屬于同一型別,且同源性為100%。見圖2。

注:13、14、15、16、17、18、19為感染組中7例新生兒糞便(肛拭子)標本中分離的菌株即定植株;20、28、29、30、31為感染組7例新生兒痰標本分離的菌株即感染株;26、27為其對應的從血標本分離的菌株即感染株。

3 討論

新生兒CRKP的檢出率隨臨床碳青霉烯類抗生素的大量應用日益增加[9]。研究[2]表明,新生兒CRKP感染率逐年增高。新生兒CRKP的高檢出率及感染率引起了人們的關注。CRKP定植是感染的潛在危險因素[10],無論是成人還是新生兒。有關成人CRKP定植后繼發感染的研究[11]顯示,CRKP定植者中CRKP感染率為8.8%～42%。定植后繼發感染的差異可能是因為納入的患者群體和所在環境不同,以及對感染控制措施的實施方案不同。研究[12]采用新生兒肛拭子和咽拭子標本,CRKP定植新生兒繼發臨床感染的風險為19.1%,本研究采用肛拭子主動篩查,結果表明該院CRKP定植新生兒中20.1%后續出現臨床感染癥狀。胃腸道是最常用的耐藥菌篩查部位,特別是直腸或肛周拭子[13],但該院新生兒腸道定植后繼發CRKP感染的概率與研究[12]中新生兒由定植繼發為感染的概率相近,殷麗軍等[12]研究對象為NICU中新生兒,NICU中新生兒病情危重,侵入性操作或抗菌藥物應用頻繁,機體免疫力差,黏膜屏障功能減弱,更易發生CRKP感染。

CRE在新生兒中的感染率不斷增加[14],新生兒感染CRE后會引起各種并發癥,嚴重的會誘發死亡,因此了解新生兒感染CRE尤其是CRKP的危險及保護因素尤為重要。

新生兒由于吮吸吞咽及胃腸蠕動功能不完善,需要鼻胃管喂養。鼻胃管喂養為侵入性操作,可造成新生兒黏膜損傷導致其防御功能減弱易于CRKP定植。抗菌藥物的使用是新生兒CRKP定植的獨立危險因素,與研究[15]結果相同。其中頭孢菌素類抗生素的使用是CRKP定植的獨立危險因素,與Qin等[13]研究結果相同。而頭孢菌素類抗生素可抑制或殺滅大多數細菌,導致胃腸道菌群紊亂,易于細菌在腸道內定植。剖宮產也是新生兒CRKP定植的獨立危險因素,分娩方式會影響新生兒腸道菌群定植。剖宮產出生的新生兒腸道菌群與母親皮膚和醫院環境微生物群相似[16],這些細菌對各種抗菌藥物具有抗藥性。因此,CRKP更容易在剖宮產出生的新生兒腸道中定植。

母乳喂養是新生兒CRKP定植的保護因素[14]。除此之外,益生菌的使用也是CRKP定植的保護因素,但目前尚未有益生菌使用的相關報道。母乳中含有一些益生菌[17],母乳喂養可刺激細菌增殖,有助于建立正常的腸道菌群,從而促進腸道成熟,增強免疫保護[18]。益生菌是一類活性微生物菌,進入人體后可通過刺激其他微生物生長,調節胃腸道黏膜及全身系統的免疫反應,防止CRKP菌株在胃腸道的定植,從而阻遏CRKP由定植進一步發展為感染。

本研究發現灌腸是CRKP定植的保護因素。新生兒胃腸道未發育完全,腸道蠕動功能差,可以通過灌腸的方式刺激腸蠕動,促進糞便排泄。灌腸是首次被報道為CRKP定植的保護因素,灌腸可能是通過改善腸道內環境,減少腸道內有害菌數量,減少細菌在新生兒腸道的定植與繼發感染。

本研究結果表明,新生兒CRKP定植繼發感染的獨立危險因素與碳青霉烯類抗生素的使用相關,與其他研究[12]不同。碳青霉烯類抗生素在CRKP從定植發展為感染的過程中會破壞腸道的微生態平衡,從而使相互競爭的病原菌被消除,最終導致CRKP大量增殖。此外,Lin等[19]研究表明碳青霉烯類抗生素的長期使用可誘導獲得性KPC酶的產生,而產KPC酶定植患者更容易發生CRKP感染。同時該院夏晴[20]研究也發現新生兒的感染病原菌為產KPC酶的CRKP菌株,進一步表明碳青霉烯類抗生素的長期使用會成為新生兒CRKP定植繼發感染的獨立危險因素。研究[21]表明住院時間延長是CRKP感染的危險因素,在本研究中總住院時間是腸道定植新生兒繼發感染的獨立危險因素。隨著住院時間的延長,新生兒機體免疫力差,黏膜屏障功能受損,腸道定植細菌CRKP較易發生移位,導致CRKP感染。

國內外對于胃腸道定植與感染關系研究相對普遍,2017年國外一項探討胃腸道定植與感染之間關系的研究[22]表明,與腸道非定植患者相比,胃腸道定植患者易感染肺炎克雷伯菌。對基于基因組學進行的兩項研究的結果中也表明定植菌株與感染菌株的同源性可高達80%[23]。blaKPC-2是我國成人CRKP菌株的主要耐藥基因型,而我國新生兒流行的耐藥基因型主要為NDM-1型[24]。該院新生兒主要感染產KPC-2酶KP[20],與文獻[23]報道不一致。研究[13]顯示環境可作為人類獲得KP的貯菌源,無論是定植還是感染。因此,推測此次該院新生兒流行的KPC-2的CRKP菌株可能是由成人病房傳播或因醫院環境污染引起,也可能是新生兒免疫力低發生的宿主菌自身性感染,需要進一步研究。

為進一步驗證CRKP定植與感染菌株之間的同源性,本研究對定植和感染菌株進行了PFGE分析。雖然MLST和PFGE均可以用作細菌分型,但相比較而言,PFGE檢測分辨率高、分型能力強。而MLST檢測分辨率較低,難以對細菌進行準確的同源性分析。因此通過使用MLST和PFGE兩種分子檢測方法能更好確定其同源性,以便進一步的分析研究。PFGE結果顯示,14株CRKP菌株同源性為100%,與MLST結果一致,表明腸道定植與繼發感染的CRKP菌株間具有同源性。

本研究仍具有一定的局限性,首先沒有將新生兒感染的CRKP菌株與醫院其他科室流行的CRKP菌株進行比較,對傳播流行的原因不清楚。其次,護理人員與同一病房住院新生兒之間的個人接觸是最可能的傳播途徑,但沒有對醫院的環境及人員進行微生物檢測,不能排除環境或者護理人員手衛生消毒不徹底這一傳播因素。最后,目前為止仍然無法確定這種克隆型菌株是如何傳播至新生兒病房,未來有待進一步研究。

總之,本研究通過分析CRKP定植及定植繼發感染的影響因素,可為降低新生兒科CRKP感染率提供科學依據。在新生兒科定期主動篩查CRE,及時監測耐藥菌及其分子流行病學特征,盡早開始母乳喂養與使用益生菌,并采取醫院感染防控措施,有助于避免CRKP在新生兒病房中的暴發流行。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。