血清miR-497、Sirt4水平與糖尿病視網膜病變的關系

趙愛麗，崔曉敬

1 廊坊市中醫醫院眼科，河北廊坊 065000；2 廊坊市中醫醫院心血管病科

2 型糖尿病（T2DM）是臨床最常見的糖尿病類型。近年來，隨著居民生活習慣改變和人口老齡化加劇，我國T2DM 的患病率呈明顯上升趨勢。據報道，2021 年我國20～79 歲人群糖尿病患者約1.41億人，其中90%以上為T2DM，疾病負擔居全球首位［1］。糖尿病視網膜病變（DR）是T2DM 最常見的微血管并發癥，也是導致T2DM 患者致盲的重要原因［2］。因此，早期預測DR 發生對減少T2DM 患者視力喪失、提高生命質量至關重要。炎癥反應和氧化應激反應是DR 發生、發展的重要病理生理機制［3］。有研究報道，微小RNA（miRNA）可通過炎癥反應和氧化應激反應參與DR 的發生、發展［4］。miR-497 是一種高度保守的miRNA。有學者通過miRNA 表達譜分析發現，miR-497 在DR 患者與健康人群血清中存在差異表達［5］。沉默信息調節因子4（Sirt4）是一種去乙酰化酶，能夠通過調節多個信號通路抑制炎癥反應和氧化應激反應［6］。但目前血清miR-497、Sirt4 水平與DR 關系的報道較少。鑒于些，本研究探討了血清miR-497、Sirt4 水平與DR 的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年1 月—2022 年6 月廊坊市中醫醫院收治的T2DM 患者203 例，根據《糖尿病視網膜病變國際臨床分級標準》［7］，合并DR 61 例（合并DR 組）、未合并DR 142 例（未合并DR 組）。T2DM 的診斷依據《2 型糖尿病基層診療指南（實踐版·2019）》［8］。納入標準：①符合T2DM 診斷標準；②臨床資料完整；③患者或其家屬對本研究知情，并能配合檢查和治療。排除標準：①有先天性眼部疾病或眼部手術史者；②年齡＜18 歲者；③合并其他內分泌代謝疾病者；④合并重要臟器嚴重疾病者；⑤合并惡性腫瘤、血液系統疾病或自身免疫性疾病者；⑥近期接受激素或免疫抑制劑治療者；⑦近3 個月內有急慢性感染者。其中，男109 例、女94 例，年齡38～86（61.03 ± 10.89）歲，BMI 18.05～32.02（25.07 ±2.96）kg/m2，中位糖尿病病程10（7，12）年。本研究經廊坊市中醫醫院倫理委員會批準（審批編號：2022-008-1）。

1.2 血清miR-497、Sirt4 檢測 T2DM 患者入院次日采集空腹外周靜脈血6 mL，待血液自然凝固后，1 500 × g 離心10 min，留取上層血清。取部分血清，采用TRIzol 法提取血清總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按TaKaRa RNA PCR Kit說明將總RNA逆轉錄合成為cDNA。逆轉錄條件：38 ℃ 15 min，90 ℃ 5 s。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix Ex Taq?說明進行PCR 擴增。引物序列由新貝（上海）生物科技有限公司設計合成。引物序列：miR-497 上游引物5'-GAAGGGCCGAAGAGCTCAAT-3'、下游引物5'-GGCTCGCAAAGTGTCTGTTG-3'，U6 上游引物5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'、下游引物5'-GGGCAGGAAGAGGGCCTAT-3'。PCR擴增反應結束，繪制熔解曲線，獲取循環閾值（CT）數。以U6為內參，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-497水平。取剩余血清，采用ELISA法檢測血清Sirt4。

1.3 基因結合位點預測 通過TargetScan 數據庫（https：//www.targetscan.org/vert_72/）預測miR-497基因與Sirt4基因的結合位點。

1.4 資料收集分析 收集T2DM 患者性別、年齡、BMI、糖尿病病程、吸煙史、飲酒史、血壓（收縮壓、舒張壓）、TC、TG、HDL-C、LDL-C、空腹血糖（FPG）、糖化血紅白蛋白（HbA1c）以及miR-497、Sirt4 等臨床資料。比較合并DR 組與未合并DR 組上述臨床資料，分析T2DM合并DR的影響因素。

1.5 統計學方法 采用SPSS28.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，結果比較采用U檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman 相關分析法。影響因素分析采用多因素Logistic 回歸模型。預測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，曲線下面積（AUC）比較采用DeLong 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-497、Sirt4水平比較 見表1。

表1 兩組血清miR-497、Sirt4水平比較

2.2 T2DM 合并DR 的危險因素分析結果 兩組臨床資料比較見表2。以T2DM 是否合并DR 為因變量，以年齡、糖尿病病程以及LDL-C、FPG、HbA1c、miR-497、Sirt4為自變量，納入多因素Logistic 回歸模型。結果發現，糖尿病病程延長及HbA1c、Sirt4 升高是T2DM 合并DR 的獨立危險因素，而miR-497 升高則為其獨立保護因素（P均＜0.05），見表3。

表2 兩組臨床資料比較

表3 T2DM合并DR的多因素Logistic回歸分析結果

2.3 T2DM 合并DR 患者血清miR-497 水平與血清Sirt4 水平的關系 經TargetScan 數據庫預測，miR-497基因與Sirt4基因啟動子的3′端非翻譯區存在結合位點，見圖1。Spearman 相關分析顯示，T2DM 合并DR 患者血清miR-497 水平與Sirt4 水平呈負相關（rs=-0.774，P＜0.05）。

圖1 miR-497基因與Sirt4基因的結合位點示意圖

2.4 血清miR-497、Sirt4水平對T2DM合并DR的預測價值 血清miR-497、Sirt4水平聯合預測T2DM 合并DR 的AUC高于二者單獨（Z分別為2.976、2.880，P均＜0.05），見表4。

表4 血清miR-497、Sirt4水平對T2DM合并DR的預測價值

3 討論

T2DM 是臨床常見的一種慢性代謝性疾病，以胰島素抵抗和胰島素分泌不足為主要特征。DR 是T2DM 最常見的微血管并發癥，是由于血糖升高造成眼底血-視網膜屏障破壞和新生血管形成而導致的視網膜結構和功能改變［2-3］，可嚴重影響視力，從而降低患者生活質量。目前，臨床可通過玻璃體切除、激光治療、玻璃體腔內注射藥物等手段改善DR患者視力，但其視力恢復效果差強人意，部分患者復發率較高［9］。因此，早期預測DR 發生并盡早預防，對避免或延緩DR 進展和提高生活質量具有重要意義。

炎癥反應和氧化應激反應在DR 發生、發展中扮演重要角色。高血糖可造成眼底毛細血管阻塞，引起眼底毛細血管炎癥反應和氧化應激反應，促使病理性新生血管形成，這些新生血管管壁較薄，極易破裂出血，而管壁破裂后瘢痕組織形成又可牽拉視網膜使其破壞、脫落，從而導致視力降低甚至失明［4］。miRNA 可通過炎癥反應和氧化應激反應參與DR 的發生、發展［4］。miR-497 是一種高度保守的miRNA，定位于人染色體17p13.1。ZHANG 等［10］研究發現，上調miR-497 表達能夠靶向C-C 基序趨化因子配體19 抑制高糖誘導的腎細胞凋亡和炎癥反應，抑制糖尿病腎病進展。FENG 等［11］研究報道，上調miR-497 表達能夠靶向活化T 細胞核因子2 抑制高糖誘導的腎細胞炎癥反應和氧化應激反應，抑制糖尿病腎病進展。糖尿病腎病也是T2DM 患者常見的微血管并發癥之一。因此，筆者推測miR-497 也可能參與DR 的發生、發展。炎癥反應和氧化應激反應介導的新生血管形成是DR 發生、發展的重要原因［3］。既往研究報道，過表達miR-497能夠通過靶向抑制血管內皮生長因子（VEGF）而抑制腫瘤新生血管形成［12］。本研究結果顯示，合并DR 組血清miR-497 水平低于未合并DR 組；血清miR-497 水平升高是T2DM 合并DR 的獨立保護因素。結果表明，miR-497 能夠參與DR 的發生、發展，其機制可能與血清miR-497 水平降低能夠促進炎癥反應和氧化應激反應，從而促進新生血管形成有關。VEGF 是新生血管形成的關鍵因子，在DR 的發生、發展中發揮重要作用；使用抗VEGF 藥物能夠顯著改善DR 患者視力［3］。最近WANG 等［13］研究表明，上調miR-497表達能夠靶向IL-3/STAT3 減輕炎癥反應，抑制VEGF 釋放，從而改善病理性角膜新生血管形成。進一步佐證了上述結論。

蛋白質翻譯后修飾能夠使蛋白質結構更復雜、功能更完善、調節更精細、作用更專一。乙酰化修飾是生物體內普遍存在的蛋白質翻譯后修飾方式［14］。Sirt4 是NAD＋依賴的去乙酰化酶蛋白家族成員之一，主要定位于線粒體，能夠通過去乙酰化作用抑制炎癥反應和氧化應激反應。Sirt4 沉默或表達缺失可增強NF-κB 核轉位和轉錄活性，促進炎癥反應和氧化應激反應［6］。XU 等［15］研究報道，上調Sirt4表達能夠抑制腎細胞中NF-κB 磷酸化，進而減輕糖尿病腎病小鼠足細胞炎癥反應和凋亡。QIN 等［16］研究發現，上調Sirt4 表達能夠靶向AMP 依賴的蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，抑制氧化應激反應誘導的視網膜神經膠質細胞凋亡。本研究結果顯示，合并DR 組血清Sirt4水平高于未合并DR 組；血清Sirt4水平升高是T2DM 合并DR 的獨立危險因素。結果表明，血清Sirt4 水平升高能夠促進DR 的發生、發展。這與上述研究結論并不一致，其原因可能是血清Sirt4 水平升高是機體的一種保護性反饋，以抑制炎癥反應和氧化應激反應。最近研究報道，Sirt4 在高糖喂食的團頭魴腦、腎、脾臟、肌肉和肝臟等部位高表達［17］，在DR患者外周循環中亦顯著升高［18］。

本研究經TargetScan 數據庫預測發現，miR-497基因與Sirt4 基因啟動子的3′端非翻譯區存在結合位點；Spearman 相關分析發現，T2DM 合并DR 患者血清miR-497水平與血清Sirt4水平呈負相關。提示二者可能共同參與DR 的發生、發展，但其具體作用機制有待于進一步研究。本研究結果還發現，糖尿病病程延長和HbA1c 升高為T2DM 合并DR 的獨立危險因素。究其原因，糖尿病病程越長，高糖對眼底毛細血管的損害越嚴重，而HbA1c 升高則表明血糖控制不佳，故DR的發生風險更高。

本研究ROC 曲線分析顯示，血清miR-497、Sirt4水平單獨和聯合預測T2DM 合并DR 的AUC分別為0.769、0.765、0.850，血清miR-497、Sirt4 水平聯合預測T2DM 合并DR 的AUC高于二者單獨。結果表明，血清miR-497、Sirt4水平對T2DM合并DR均有一定預測價值，二者聯合預測價值更高。

綜上所述，T2DM 合并DR 患者血清miR-497 水平降低、血清Sirt4 水平升高，二者可能共同參與DR進程；血清miR-497、Sirt4水平對T2DM合并DR均有一定預測價值，二者聯合預測價值更高。