骨形態發生蛋白9對肝細胞癌腫瘤干細胞干性、增殖和侵襲的影響及機制

盧金喜，余紅梅，齊孝安，方超，魏新寶，李立鑫

武漢市新洲區人民醫院普通外科，武漢430400

肝細胞癌（HCC）是肝癌的主要類型，是腫瘤相關死亡的主要原因［1-2］，目前我國HCC 5 年生存率僅12.1%［3-5］。腫瘤干細胞（CSCs）亦稱為腫瘤起始細胞，是腫瘤中一小部分具有內在干細胞樣特征，能自我更新和分化的癌細胞，其在腫瘤發生、維持和復發過程中發揮重要作用［6-7］。靶向治療CSCs 是治療多種癌癥最有希望的療法［8］。骨形態發生蛋白（BMP）在組織形態發生、器官發生和成人組織穩態中發揮作用［9］。文獻報道，BMP2 可正向調節HCC 中癌細胞惡性行為和腫瘤生長［10］。BMP9 在HCC 中表達增加并參與肝實質組織纖維化和肝硬化發生、進展［11］。2020 年1 月—12 月，我們探討了BMP9 對HCC的CSCs干性、增殖和侵襲的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HCC 細胞系（HCC-LM3、SMMC77721、Huh7、Hep3B和HepG2）、正常肝細胞L-02、HepG2干細胞（HepG2 CSCs）均由華中科技大學同濟醫學院實驗室饋贈、Eagle培養基（Gibco公司，美國）、10%胎牛血清（美國Gibco 公司）、BMP9 慢病毒干擾載體［BMP9-short hairpin RNA（shRNA）］及其陰性對照（NC）（scramble）由廣州銳博生物科技有限公司構建、LipofectamineTM3000 轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司、MAPK/ERK 通路激活劑DIPQUO 購自美國MedChemExpress 公司、TRIzol試劑購自日本TaKaRa公司、BMP9 一抗、ERK1/2 一抗、p-ERK1/2 一抗、MEK1/2 一抗、P-MEK1/2 一抗、GAPDH 一抗均購買自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養及分組 HCC 細胞系（HCC-LM3、SMMC77721、Huh7、Hep3B 和HepG2）、正常肝細胞L-02 及HepG2 CSCs 均培養于Eagle 培養基中，均于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。待培養至對數增長期后，將慢病毒干擾載體sh-BMP9 轉染HepG2-CSCs，并分成HepG2-CSCs 組、HepG2-CSCs-BMP9 敲低組。以行HepG2-CSCs 干細胞特性、細胞增殖和侵襲實驗。加入DIPQUO（MEK/ERK 信號通路激活劑）后，將細胞分為三組：HepG2-CSCs 組、HepG2-CSCs 敲低組及HepG2-CSCs 敲低+ DIPQUO 組。以行HepG2-CSCs 干細胞特性維持和細胞功能及MAPK/ERK信號通路實驗。

1.3 BMP2 干擾載體轉染 慢病毒干擾載體BMP2-shRNA 及其NC 滴度為4×108CFU/mL，將新構建載體按照LipofectamineTM3000 轉染試劑盒要求轉染至肝HepG2 CSCs中。

1.4 BMP9 mRNA 表達檢測 采用RT-qPCR 法。使用TRIzol 試劑提取總RNA，超微分光光度計測量RNA 濃度和純度。將符合要求的RNA（20 μg）按照反轉錄試劑盒說明書操作獲得cDNA。RT-qPCR 檢測使用 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）在ABI 7900HT 快速PCR 實時系統上進行，反應條件：95 ℃10 min（預變性）、95 ℃ 10 s（變性）、60 ℃ 20 s（退火）、72 ℃ 34 s（延伸），持續40個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內部參考，2-ΔΔCt方法用于計算目的基因相對表達。引物序列：BMP9 正向引物：5?-ATCACCTGAACTCCACGAA-3?，反向引物：5?-TACCACCTTCTCATTCTCATC-3?；CD44 正向引物：5?-CCTCTCATTACCCACACACG-3?，反向引物：5?-CCCATGTGAGTGTCCATCTG-3?；SOX2 正向引物：5?-GAGAACCCCAAGATGCACAA-3?；反向引物：5?-GGCAGCGTGTACTTATCCTT-3?；OCT4 正向引物：5?-TCTGCAGAAAGAACTCGAGC-3?；反向引物：5?-TTGTTGTCAGCTTCCTCCAC-3?。GAPDH 正向引物：5?-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3?；反向引物：5?-CTCGCTTCGGCAGCACA-3?。

1.5 MAPK/ERK 通路蛋白表達檢測 采用蛋白質印跡實驗。RIPA 裂解液分別裂解HepG2-CSCs 組、HepG2-CSCs-BMP9 敲低組、HepG2-CSCs 敲低+DIPQUO 組細胞。使用二辛可寧酸蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度。各組細胞分別取等量蛋白經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移法轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，封閉非特異性結合抗原。4 ℃下與一抗孵育過夜后，沖洗膜并在室溫下與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，然后加入增強化學發光工作溶液。采用Image Pro Plus 6.0量化圖像中每個波段灰度值，以GAPDH 為內參。實驗中使用的抗體如下：BMP9（1∶500）、ERK1/2（1∶800）、p-ERK1/2（1∶400）、MEK1/2（1∶400）、P-MEK1/2（1∶500）、GAPDH（1∶500）。

1.6 HepG2-CSCs 細胞干性檢測 采用RT-qPCR法測定HepG2-CSCs 細胞中干性分子CD44、SOX2及OCT4 mRNA 表達。方法同1.4。采用Western blotting 檢測HepG2-CSCs 細胞中干性分子CD44 蛋白表達。HepG2-CSCs 經培養至對數生長期后，采用RIPA 裂解液裂解HepG2-CSCs 細胞。使用二辛可寧酸蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度。各組細胞分別取等量蛋白經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移法轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，封閉非特異性結合抗原。4 ℃下與一抗孵育過夜后，沖洗膜并在室溫下與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，然后加入增強化學發光工作溶液。采用 Image Pro Plus 6.0量化圖像中每個波段灰度值，以GAPDH 為內參。CD44抗體濃度為1∶300。

1.7 HepG2-CSCs 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。將 HepG2-CSCs 接種到 96 孔板（1 × 106個細胞/孔）中，HepG2-CSCs 組、HepG2-CSCs-BMP9 敲低組、HepG2-CSCs 敲低+ DIPQUO 組各設12 個復孔。將細胞培養1～7 d，每個時間點設置3個復孔。CCK-8溶液添加到無細胞培養基中作為空白對照，分別培養24、48、72 和96 h，在每個時間點將10 μL CCK-8溶液加入相應孔中，然后繼續孵育2 h，使用酶標儀測量細胞在450 nm處的吸光度值（A450）。

1.8 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 實驗。HepG2-CSCs 組、HepG2-CSCs-BMP9 敲低組、HepG2-CSCs 敲低+ DIPQUO 組 細胞轉染48 h 后，在Transwell 上室中置入細胞懸液（200 μL，1×105個細胞），并將含有20% FBS培養基（800 μL）加入每個基底下室，稀釋方法為200 μL 無血清培養基在4 ℃稀釋同體積的Matrigel 基質膠添加至Transwell 上下室中間。將細胞置于培養箱中培養24 h 后取出，PBS 洗滌2次，甲醛中浸泡10 min，清水洗滌3次，室溫下用0.1%紫羅蘭染色細胞30 min，PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察遷移和侵襲細胞數目。

1.9 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。符合正態分布的計量數據以-x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，隨后采用Tukey 多重比較檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMP9 在HCC 細胞中的表達 RT-qPCR 結果示，正常肝細胞（THLE3）中BMP9 mRNA 相對表達量為0.89 ± 0.12，而HCC 細胞（HepG2、Hep3B、SMMC7721 和Huh7）中 BMP9 mRNA 相對表達量依次為3.63 ± 0.42、3.47 ± 0.52、3.41 ± 0.39、2.91 ±0.68，HCC細胞中BMP-9表達高于正常肝細胞（P均＜0.05）。Western blotting 結果示，BMP9 蛋白在正常肝細胞中相對表達量為0.69 ± 0.11，而HCC 細胞（HepG2、Hep3B、SMMC7721 和Huh7）中BMP2 相對表達量依次為2.99 ± 0.55、2.64 ± 0.52、2.41 ±0.29、1.91 ± 0.78，與正常肝細胞（THLE3）相比，BMP9在HCC中高表達（P均＜0.05）。

2.2 HepG2-CSCs 細胞干性鑒定 CD44、SOX2 及OCT4 mRNA 表達在HepG2-CSCs 中較HepG2 細胞增加（P均＜0.05）。HepG2-CSCs 中CSC 標記分子CD44 蛋白表達較HepG2 增加（P＜0.05），見表1。上述實驗結果表明 HepG2-CSCs具有干細胞特性。

2.3 HepG2-CSCs 和HepG2 細胞中BMP 9 表達比較 RT-qPCR 結果示，HepG2-CSCs 細胞、HepG2 細胞中BMP9 mRNA 相對表達量分別為7.17 ± 0.88、3.63 ± 0.42，HepG2-CSCs 細胞中BMP9 mRNA 表達高于HepG2細胞（P＜0.05）；Western blotting 結果示，HepG2-CSCs 細胞、HepG2 細胞中BMP9 蛋白相對表達量分別為6.05 ± 0.73、2.91 ± 0.45，HepG2-CSCs細胞中BMP9蛋白表達高于HepG2細胞（P＜0.05）。

2.4 敲低BMP9 對HepG2-CSCs 干細胞特性的影響 HepG2-CSCs 組、HepG2-CSCs 組BMP9 蛋白表達分別為2.01 ± 0.45、6.25 ± 0.44，兩組BMP9蛋白表達比較差異有統計學意義（P＜0.05），提示轉染成功。RT-qPCR結果顯示，BMP9 敲低后CD44、SOX2、OCT4 mRNA 表達較對照組降低（P均＜0.05），見表2。

表2 HepG2 CSCs 敲低組和HepG2-CSCs 組干細胞特性相關標記分子mRNA表達比較（-x ± s）

2.5 敲低BMP9 對HepG2-CSCs 細胞增殖和侵襲的影響 CCK-8 結果示，BMP9 敲低可顯著抑制HepG2-CSCs在48、72和96 h細胞增殖能力，即A450較HepG2-CSCs 組降低（P均＜0.05），見表3。Transwell 侵襲實驗顯示，HepG2-CSCs -BMP9 敲低組、HepG2-CSCs組侵襲細胞數分別為（60.5 ±8.6）、（102.3 ± 12.8）個，HepG2-CSCs -BMP9敲低組侵襲細胞數少于HepG2-CSCs 組（P＜0.05）。

表3 HepG2 CSCs 敲低組和HepG2-CSCs 組細胞增殖能力比較（-x ± s）

2.6 敲低BMP9 后對HepG2-CSCs 干細胞特性和細胞生物學功能的影響 敲低BMP9 后，HepG2-CSCs中p-ERK1/2 和 p-MEK1/2 蛋白表達分別為0.35 ±0.03、0.46 ± 0.07，HepG2 中表達分別為1.35 ±0.16、1.65 ± 0.27，HepG2-CSCs 中p-ERK1/2 和p-MEK1/2 蛋白表達較HepG2 降低（P均＜0.05）。與HepG2-CSCs 敲低組相比，加入DIPQUO 后，HepG2-CSCs 干細胞特性增加，即HepG2-CSCs 細胞中干細胞相關標志物CD44、SOX2、OCT4 mRNA 表達增加（P均＜0.05），可部分恢復至HepG2-CSCs 組水平（表4）。細胞功能實驗顯示，與HepG2-CSCs敲低組相比，加入DIPQUO 后，HepG2-CSCs 細胞在各時間點增殖能力得以恢復（P均＜0.05），見表5，同時細胞侵襲能力得以恢復［侵襲細胞數分別為（102.3 ± 12.8）、（60.5 ± 8.6）、（99.3 ± 16.8）個，F=29.41，P＜0.05］。

表4 三組干細胞特性相關標記分子mRNA表達比較（-x ± s）

表5 HepG2 CSCs 敲低組、HepG2-CSCs 組及HepG2-CSCs-BMP9 敲低+ DIPQUO組細胞增殖能力比較（-x ± s）

3 討論

文獻報道，在HCC 組織和細胞中均發現BMP9蛋白表達增加，其可促進HCC 細胞增殖［12］。文獻報道，在體外培養的HCC 細胞系中BMP9 高表達，并且可促進上皮間質轉化（EMT）過程［13］。HepG2-CSCs 中BMP9 mRNA 和蛋白表達高于對應肝癌細胞（HepG2）。本研究發現，肝癌細胞系中BMP9 mRNA 和蛋白表達增加。文獻報道，HepG2-CSCs 中BMP9-ID1 信號通路激活后，可維持HCC 的CSCs 干細胞特性，并通過上調Wnt/β-catenin 信號通路參與CSCs增殖和侵襲［14］。文獻證實，CSCs在多種原發性腫瘤中廣泛存在，并通過自我更新和增殖能力驅動腫瘤細胞生存、增殖、侵襲和復發［15］。本研究發現，與肝癌細胞（HepG2）相比，HepG2-CSCs 中代表干細胞的生物標志物CD44 和多能轉錄因子SOX2 和OCT4 表達均增加，證實HepG2-CSCs 細胞存在干細胞特性［6，16］。

在HepG2-CSCs 中敲低BMP9 后，HepG2-CSCs中代表干細胞的生物標志物CD44 和多能轉錄因子SOX2 和OCT4 表達均降低。而CD44、SOX2 、OCT4是HCC 的 CSCs 干性功能維持的標志物［17］，上述結果提示BMP9 可能在HepG2-CSCs 干性維持中發揮重要作用。文獻報道，在HepG2-CSCs 中BMP2 高表達，敲低BMP2 表達后可阻止HepG2-CSCs 干性維持，鑒于BMP2 和BMP9 同屬于BMP 家族，兩者可能存在功能類似性［18］。

在HepG2-CSCs 中敲低BMP9 后，HepG2-CSCs細胞增殖、遷移和侵襲能力均降低。文獻報道，HCC中BMP9 高表達可通過激活血管內皮生長因子A（VEGFA）促進HCC 血管生成、增殖和侵襲［19］。MAPK/ERK 與CSCs 干性維持關系密切。本研究推測MAPK/ERK 信號通路激活轉導有助于促進CSC增殖和遷移。本實驗結果證實，HepG2-CSCs 細胞中，BMP9被敲低后，MAPK/ERK 信號通路中關鍵蛋白p-ERK1/2 和p-MEK1/2 表達下調，提示MAPK/ERK信號通路被抑制。文獻報道，阻斷 MAPK/ERK通路抑制有助于阻礙腎臟CSCs干性維持、增殖和體內成瘤能力［20］，與本研究結果類似。加入DIPQUO后，HepG2-CSCs 細胞中干細胞特性標志物（CD44、SOX2、OCT4）表達可恢復到HepG2-CSCs 水平，同時可逆轉HepG2-CSCs 細胞增殖、遷移和侵襲受抑的現象。

綜上所述，HCC 和HCC 干細胞中BMP9 表達上調，BMP9 敲低可抑制 HepG2-CSCs 干性維持并抑制增殖和侵襲能力，機制可能與抑制MAPK/ERK 通路有關。