格列齊特灌胃對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜屏障功能的影響及機制

練強

成都市第三人民醫院藥學部，成都610000

潰瘍性結腸炎（UC）是一種復發和緩解反復變化的炎癥性腸病，表現為疲勞、腹痛、血性腹瀉和大便失禁，其病因涉及環境、免疫系統、腸道微生物群和疾病遺傳易感性之間的相互作用［1］。研究表明，UC 的發生發展與腸黏膜屏障功能的改變密切相關［2］。晚期糖基化終末產物（AGE）通過糖化蛋白質或脂質與糖結合產生，是人類多種疾病發生的主要病理因素。AGE 受體（RAGE）是AGE 促炎反應的主要受體，且大多數RAGE 激活劑可導致下游炎癥級聯反應的發生，但該通路是否參與UC 的發展尚不明確［3-4］。格列齊特（GLZ）是第二代磺脲類藥物，屬于一種抗糖尿病藥物，可直接刺激β 細胞分泌胰島素，但研究證明磺脲類藥物同時具有抗炎作用［5］。有學者報道，GLZ 通過抑制結腸炎癥治療UC［6］，但相關的機制研究極少。2022 年3 月—2023 年1 月，我們就GLZ 調節AGE/RAGE 信號通路對UC 大鼠腸黏膜屏障功能的影響進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 8 周齡SD 大鼠54 只，體質量180～220 g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）2019-0003；三硝基苯磺酸（TNBS），美國Sigma 公司提供；GLZ，上海寶曼生物科技有限公司提供；D-乳酸（D-LA）試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司提供；二胺氧化酶（DAO）試劑盒，Elabscience公司提供；蘇木素伊紅染色試劑盒，索寶萊科技有限公司提供；RAGE 過表達慢病毒載體及慢病毒空載體，Genechem 公司提供；RAGE、磷酸化核轉錄因子κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65 一抗，abcam 公司提供；AGE 抗體，Santa Cruze 公司提供；電轉系統及電泳儀、轉膜儀，Biorad 公司提供；酶標儀（Tecan infinite M200 型），瑞士Tecan 公司提供；光學顯微鏡（BX43型），日本OLYMPUS公司提供。

1.2 UC大鼠模型制備、分組及干預 將大鼠飼養于標準條件的鼠籠里，溫度20～26 ℃，光照、黑暗時間各為12 h，相對濕度40%～70%，按照標準實驗室方法進行喂食喂水，實驗嚴格按照倫理委員會批準的相關倫理標準和規定進行。大鼠適應性喂養7 d后，隨機分為造模組（42只）和空白組（12只）。造模組按照文獻造模方法［7］采用TNBS、乙醇灌腸方法建立UC大鼠模型。空白組采取相同的方法以生理鹽水灌腸。于造模第2天同一時間從造模組、空白組各隨機選取2只大鼠制作結腸組織病理切片，觀察潰瘍形成情況，驗證UC大鼠造模成功，并將造模組剩余40只大鼠隨機分為UC組、GLZ組、GLZ+空載體組、GLZ+RAGE過表達組。剩余10只空白組及UC 組大鼠以生理鹽水灌胃干預，GLZ 組大鼠以10 mg/kg 格列齊特灌胃干預，GLZ+空載體組大鼠在GLZ組的基礎上進行尾部注射0.15 μL慢病毒空載體干預，GLZ+RAGE過表達組大鼠在GLZ 組的基礎上進行尾部注射0.15 μL RAGE過表達慢病毒載體干預。以上各組每日干預1次，連續干預14 d。干預結束后，觀察各組大鼠一般情況及精神狀況，并記錄大鼠體質量變化。

1.3 各組大鼠疾病活動指數（DAI）評分 以糞便性狀、糞便血及體質量對大鼠進行DAI 評分。糞便正常計為0 分，糞便成型且為軟便計為2 分，糞便不成型且為軟便計為3分，腹瀉計為4分。大鼠體質量下降率小于1%計為0 分，體質量下降率1%～5%計為1 分，下降率＞5%～10%計為2 分，下降率＞10%～15%計為3分，下降率＞15%計為4分；糞便潛血試劑盒檢測（-）計0 分，（+）計1 分，（++）計2 分，（+++）計3 分，（++++）計4 分。DAI 評分為（糞便性狀評分+體質量下降率評分+糞便血評分）/3。

1.4 血清DAO、D-LA水平檢測 麻醉各組大鼠，腹部主動脈取血1 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA 法嚴格按照試劑盒說明書檢測血清DAO、D-LA水平。

1.5 結腸組織病理學變化及評分變化檢測 取各組大鼠適量結腸組織以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成3 μm 厚切片。經洗滌、水化后用蘇木精伊紅染色，于鏡下觀察結腸組織損傷情況并參照文獻［8］進行組織病理評分。

1.6 結腸組織髓過氧化物酶（MPO）活性檢測 取適量結腸組織，用磷酸緩沖液在冰上勻漿，勻漿液超聲粉碎10 s 后反復凍融3 次，4 ℃ 5 000 r/min 離心20 min，離心后取組織上清液加入0.1%過氧化氫的磷酸鈉緩沖溶液、0.000 5%鄰聯二茴香胺，在460 nm處進行2 min的掃描，以第30秒至第90秒的1 min內光密度變化代表酶活性改變，25 ℃條件下1 min 降解1 μmol的過氧化氫記作MPO活性為1 U。

1.7 結腸組織RAGE、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達檢測 取適量結腸組織，RIPA裂解提取總蛋白，通過SDS-PAGE 分離蛋白質并轉移至PVDF 膜上。將PVDF 膜在室溫下用10%脫脂牛奶中封閉1 h，并加入RAGE、p-NF-κB p65、NF-κB p65 一抗的抗體在4 ℃條件下過夜孵育，洗滌后在37 ℃下加入二抗孵育2 h，PBS 充分洗滌。以β-actin 為內參，采用Image J 軟件進行p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白半定量分析，并計算p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值。

1.8 結腸組織中AGE 蛋白表達測定 制備結腸組織切片，常規脫蠟水洗后進行抗原修復，PBS 沖洗，加入1∶100 稀釋的AGE 一抗4 ℃條件下過夜孵育，在37 ℃下加入二抗孵育30 min。PBS洗滌后經二氨基聯苯胺顯色，水洗后蘇木素復染，經梯度乙醇脫水后封片，于鏡下觀察AGE 蛋白表達情況，以積分光密度值計算AGE蛋白表達。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀況及DAI 評分 空白組大鼠精神狀態良好，大便正常；UC組大鼠精神狀態較差，大便量增加且帶濃血，出現拱背、活動量減少等癥狀，體質量降低。與UC 組相比，GLZ 組、GLZ+空載體組大鼠精神狀態明顯改善，大便量減少，未見黏液膿血，體質量增加；與GLZ+空載體組相比，GLZ+RAGE 過表達組大鼠精神狀態變差，黏液膿血依然存在，體質量降低。空白組、UC 組、GLZ 組、GLZ+空載體組、GLZ+RAGE 過表達組DAI 評分分別為（0.00 ± 0.00）、（3.02 ± 0.31）、（2.04 ± 0.21）、（2.09 ± 0.21）、（2.93 ± 0.30）分。UC 組與空白組比較，GLZ 組、GLZ+空載體組與UC 組比較，GLZ+RAGE 過表達組與GLZ+空載體組比較，DAI 評分差異有統計學意義（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清DAO、D-LA 水平比較 各組大鼠血清DAO、D-LA水平比較見表1。

表1 各組大鼠血清DAO、D-LA水平比較（± s）

表1 各組大鼠血清DAO、D-LA水平比較（± s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與UC 組相比，bP＜0.05；與GLZ+空載體組相比，cP＜0.05。

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2.3 各組大鼠結腸組織病理學變化 空白組大鼠結腸黏膜外觀正常，上皮完整，大鼠結腸組織結構清晰，未見明顯病變。UC 組有水腫、充血、潰瘍現象，結腸組織與黏膜、腸道粘連；黏膜處有多處潰瘍形成，存在中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。經GLZ 干預后，結腸組織粘連減輕，炎性浸潤降低；GLZ+RAGE過表達組依然可見有水腫、充血、潰瘍現象，炎性浸潤及腸道粘連明顯?？瞻捉M、UC 組、GLZ 組、GLZ+空載體組、GLZ+RAGE 過表達組大鼠結腸病理學評分分別為（2.57 ± 0.26）、（12.33 ± 1.24）、（5.34 ±0.54）、（5.45 ± 0.54）、（11.08 ± 1.11）分。UC 組與空白組比較，GLZ 組、GLZ+空載體組與UC 組比較，GLZ+RAGE 過表達組與GLZ+空載體組比較，結腸組織病理評分差異有統計學意義（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠結腸組織MPO 活性變化 空白組、UC 組、GLZ 組、GLZ+空載體組、GLZ+RAGE 過表達組大鼠結腸組織MPO 活性分別為（0.10 ± 0.01）、（2.47 ± 0.25）、（1.22 ± 0.13）、（1.25 ± 0.13）、（2.28 ± 0.23）U/mg。UC 組與空白組比較，GLZ 組、GLZ+空載體組與UC 組比較，GLZ+RAGE 過表達組與GLZ+空載體組比較，結腸組織MPO 活性差異有統計學意義（P均＜0.05）。

2.5 各組大鼠結腸組織AGE/RAGE 信號通路相關蛋白表達 各組大鼠結腸組織AGE、RAGE、p-NFκB p65、NF-κB p65 蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65見表2。

表2 各組大鼠結腸組織AGE/RAGE信號通路相關蛋白表達比較（xˉ± s）

3 討論

UC 是一種主要影響直腸和結腸的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，治愈率低，復發率高，也是腸道腫瘤發生的危險因素［9］。目前臨床上使用氨基水楊酸、免疫抑制劑、糖皮質激素治療UC，但治療效果不佳［10］。因此，進一步探討UC的病因和發病機制以便研發新的有效治療藥物成為近年來臨床研究熱點。

GLZ 為第二代磺脲類抗糖尿病藥物，對1 型糖尿病和2 型糖尿病都有理想效果［11］。潘文強等［12］研究發現，在糖尿病大鼠模型中，GLZ可以抑制細胞凋亡，降低氧化應激成熟進而發揮保護大鼠心肌組織的作用。MAFRA 等［13］研究證明，GLZ可明顯改善口腔潰瘍癥狀，加快黏膜恢復，表現出較好的抗氧化、抗炎作用。牙周病模型研究顯示，GLZ 可降低巨噬細胞、中性粒細胞的遷移，減少炎癥反應，防止骨丟失［14］。ARAFA 等［6］研究發現，GLZ 可通過降低靶器官結腸的炎癥反應減輕UC 病理損傷。本研究發現，UC 組大鼠結腸組織存在嚴重病理損傷，體質量降低，DAI及結腸組織病理評分增大，結腸組織MPO活性、DAO、D-LA 水平升高。但經GLZ干預后，大鼠形態組織變化及病理損傷程度改善，體質量顯著增加，DAI 及結腸組織病理評分減小，結腸組織MPO活性、DAO、D-LA 水平明顯降低，提示GLZ可以改善UC 大鼠病理損傷癥狀，抑制炎性浸潤，保護腸黏膜屏障功能。

AGE及其細胞受體RAGE與多種疾病的病情發展相關。AGE 的升高會促進活性氧的產生，進而通過RAGE 觸發氧化應激，導致NF-κB 易位激活，進而激活許多細胞因子的促炎基因，促進炎癥發生［15］。NF-κB p65 是NF-κB 家族的一個亞基，其存在可以激活NF-κB通路，導致其轉錄活性上升，進而調控細胞內多個信號通路和炎癥反應。p-NF-κB p65 是NF-κB p65 的一種磷酸化修飾形式，也是NF-κB p65的活化形式，主要定位在細胞核，磷酸化狀態可以影響NF-κB p65 的轉錄活性。相對于p-NF-κB p65 或NF-κB p65 單獨變化，p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值變化可以更加清晰顯示NF-κB p65 在UC 大鼠體內的狀態，反映NF-κB p65 由質入核的情況。在d-核糖引起的小鼠腎臟損傷及腎小球系膜細胞研究中，d-核糖以RAGE 依賴的方式誘導NF-κB 產生炎癥反應，被認為是腎病發生的觸發機制［16］。在糖尿病周圍神經病變大鼠模型研究中，肌苷可通過降低RAGE 表達和p-NF-κB p65/NF-κB p65 值阻斷AGEs/RAGE 信號通路，發揮降血糖、抑制氧化應激作用，以減輕糖尿病周圍神經病變［17］。本研究發現，UC 組大鼠結腸組織中AGE、RAGE 蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均升高，說明AGEs/RAGE信號通路和NF-κB p65處于活化狀態，結腸損傷誘導NF-κB p65 磷酸化，改變NF-κB p65 的定位，由細胞質迅速轉入細胞核內，啟動細胞核轉錄，進而促進炎癥反應的發生，提示RAGE過表達參與UC的發展過程。經GLZ 干預后，大鼠結腸組織中AGE、RAGE 蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65 值均降低。提示GLZ 可能通過抑制AGEs/RAGE 通路發揮保護腸黏膜屏障功能的作用。為驗證此研究結果，本研究設立GLZ+RAGE 過表達組，發現RAGE 過表達可逆轉GLZ 對UC 大鼠結腸組織的保護作用，進一步表明GLZ 減輕腸道炎癥反應、促進結腸黏膜愈合可能與抑制AGEs/RAGE通路有關。

綜上所述，GLZ 可通過阻斷AGEs/RAGE 信號通路，減輕NF-κB p65 激活引發的炎癥反應，保護腸黏膜屏障功能，有可能成為未來臨床治療UC 的新型藥物。