急性髓系白血病患者外周血中Tfh和Tfr細胞及相關因子變化特點的初步研究

張冉冉, 沙巴艾提·吐達洪, 張 瑞, 謝仁古麗·阿力木, 龔 珊, 曲建華

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液病中心, 新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所, 烏魯木齊 830054)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一種造血干細胞的惡性克隆性疾病,其特征是骨髓和外周血中未成熟髓系細胞的積累和擴增,從而導致正常造血衰竭。其發(fā)病率隨AML患者年齡增長有明顯增高的趨勢,該病有較高的死亡率[1]。大多數(shù)患者在使用傳統(tǒng)的化療及異基因造血干細胞移植(all-HSCT)的治療方案后,有一定的完全緩解率(CR),但其復發(fā)率較高,且預后較差[2]。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)AML患者免疫治療的重要性,并取得了一定的治療效果。有關研究報道,AML患者發(fā)病機制與機體異常的細胞免疫有關,免疫紊亂在AML疾病的進展中起到重要作用,特別是T細胞免疫功能[3]。

濾泡輔助性T細胞(Follicular helper T cell,Tfh)是一群特異性表達趨化因子受體5(C-X-C chemokine receptor type,CXCR5)的CD4+T細胞新亞群,其通過表達表面分子程序性死亡受體1(Programmed death-1,PD-1)、關鍵轉錄因子B細胞淋巴瘤6(B-cell lymphonma 6,BCL-6)和分泌細胞因子IL-21作用于B淋巴細胞,促進B細胞的增殖活化及形成生發(fā)中心(Germinal center,GC),是機體適應性免疫的重要組成部分[4]。濾泡調(diào)節(jié)性T細胞(Follicular regulatory T cell,Tfr)是另一種新的CD4+T亞群,其具有Treg細胞和Tfh細胞的雙重特性,可以表達Treg細胞特征分子如特異轉錄因子叉頭翼狀轉錄因子3(Foxp3)、B淋巴細胞誘導的成熟蛋白1(Blymphocyte induced maturation protein 1,Blimp-1)和分泌細胞因子IL-10,還可以表達Tfh細胞相關因子如PD-1、CXCR5、BCL-6等,主要功能參與負性調(diào)控Tfh細胞,抑制生發(fā)中心Tfh細胞和B細胞功能,防止過強的體液免疫應答[5-6]。已有研究證實循環(huán)濾泡輔助性T細胞(Tfh細胞)和濾泡調(diào)節(jié)性T細胞(Tfr細胞)數(shù)量及功能異常與多種疾病有關,包括自身免疫性疾病、風濕性疾病、腫瘤疾病等,二者處于動態(tài)平衡狀態(tài),共同維持機體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定[7]。有關研究報道,AML患者存在 Tfh/Tfr比例失衡,可能是導致發(fā)病的主要原因[8]。目前,關于Tfh及Tfr細胞在AML疾病發(fā)展中的研究機制尚不清楚,本研究通過檢測AML患者外周血Tfh細胞、Tfr細胞、相關轉錄因子及細胞因子的表達情況,并分析其與AML預后不良的相關性,為AML的免疫治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2022年5月至2023年6月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科收治的初診AML(非M3型)患者60例(AML組)作為研究對象,排除嚴重心、肺、肝臟疾病病史。其中男性41例(66.67%),女性19例(33.33%),中位年齡47.5歲(37.75,57.75)。按照2021版WHO的分子遺傳學預后危險度分級標準[9]:NPM1突變但不伴有FLT3-ITD突變,或者伴有低等位基因比FLT3-ITD突變或CEBPA雙突變?yōu)轭A后良好;inv(16)(p13;q22)或(t16;16)(p13;q22)伴有C-kit突變或(t8;21)(q22;q22)伴有C-kit突變,NPM1野生型無FLT3-ITD突變或伴有低等位基因比FLT3-ITD突變(不伴有遺傳學預后因素)或NPM1突變伴有高等位基因比FLT3-ITD突變?yōu)轭A后中等;TP53突變、RUNX1(AML1)突變、ASXL1突變、NPM1野生型伴高等位基因比FLT3-ITD突變?yōu)轭A后不良;分組為預后良好組16例,預后中等組23例,預后不良組19例,數(shù)據(jù)缺失組2例。所有AML病例診斷均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學、細胞遺傳學和分子生物學檢查確診。另選取同時期于本院體檢中心就診的健康體檢者40例作為對照組,其中男性26例(65.00%),女性14例(35.00%),中位年齡58.5歲(45.25,69.25)。兩組受試者年齡及性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究嚴格遵循《赫爾辛基宣言》、世界衛(wèi)生組織與國際醫(yī)學科學組織理事會共同制定的《涉及人的生物醫(yī)學研究國際倫理準則》的有關規(guī)定,獲得新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號:K202306-11),所有受試者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集及處理 分別采集AML組和對照組空腹靜脈血8 mL,置于二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝試管中,顛倒混勻后靜置,于2 h內(nèi)送檢。采集好的外周血經(jīng)室溫150 r/min離心5 min,收集上層血漿,立即凍存于-80℃冰箱,下層血細胞使用人淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC),調(diào)整細胞濃度至107/mL,加入二甲基亞砜(DMSO)后凍存-80℃冰箱。

1.2.2 試劑及儀器 流式專用溶血素和流式抗體FITC anti-human CD4(貨號:566802)和BB700 anti-human CD196(貨號:566526)購自美國BD公司,而抗體PE anti-human CXCR5(貨號:356904)購自美國Biolegend公司;WB抗體BLIMP-1 Mouse Monoclonal antibody(貨號:AG1250)購自碧云天和BCL-6 Rabbit Polyclonal antibody(貨號:21187-1-AP)、Vinculin Rabbit Monoclonal antibody(貨號:26520-1-AP)購自Proteintech中國公司;Human IL-10(貨號:JM-03221H1)及IL-21(貨號:JM-04810H1)的ELISA Kit購自上海晶抗有限公司,Human TGF-β1(貨號:ADS-1920H2)的ELISA Kit購自江蘇艾迪生有限公司。高速離心機和酶標儀購自美國Thermo公司;蛋白成像儀購自美國Azure Biosystems公司;流式細胞分析儀購自美國貝克曼公司等。

1.2.3 流式細胞儀檢測外周血濾泡輔助性T細胞(Tfh)和濾泡調(diào)節(jié)性T細胞(Tfr)的表達水平 將采集好的外周靜脈血加入抗凝管內(nèi),吸取100 μL全血置于流式管內(nèi),分別加入抗體CD4-FITC、CXCR5-PE/Dazzle各1 μL,在避光環(huán)境下溫育20 min;后加入1 mL溶血劑混勻,在避光環(huán)境下靜置20 min;隨后經(jīng)150 r/min下離心5 min,倒去上清;加入500 μL的破膜/固定液,渦旋混勻后,4℃避光孵育40 min;再次離心洗滌細胞后,倒去上清,加入FOXP3-PerCP/Cyanine 5.5抗體1 μL, 靜置40 min;再加PBS溶液300 μL混勻,上流式細胞儀檢測Tfh(CD4+CXCR5+FOXP3-)和Tfr(CD4+CXCR5+FOXP3+)細胞的比例。

1.2.4 Western blot檢測外周血中BCL-6和Blimp-1的蛋白表達水平 Ficoll法梯度離心收集PBMC細胞后,將凍存的PBMC細胞統(tǒng)一冰上解凍,加入RIPA裂解液,30 min后通過離心(4℃,10 000 r/min,30 min)收集總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度,等量的蛋白質樣品(20 μg每孔)通過10%的SDS-PAGE電泳,并在110 V電壓2 h條件下轉移到PVDF膜上。加入5%脫脂牛奶(室溫,2 h)封閉,1×TBST洗滌2次,再將PVDF膜放置在抗BCL-6和抗Blimp-1的一抗稀釋液中4℃冰箱過夜(1∶1 000稀釋,4℃,8 h) ,洗滌后加入二抗(1∶5 000稀釋,室溫,1 h)。ECL可視化處理,以Vinculin為內(nèi)參,分析BCL-6和Blimp-1相對蛋白表達量。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞因子IL-10、TGF-β1及IL-21的表達水平 血清標本在室溫下緩慢解凍,離心,每孔加入50 μL待測標準品或樣品,再加入100 μL過氧化物酶工作液(HRP),封板,37℃孵育1 h,棄去液體并甩干,洗板5次,每孔加入100 μL的底物溶液,37℃孵育15 min,50 μL終止溶液終止反應,檢測每孔450 nm吸光度,根據(jù)測得的標準品濃度以及對應的OD值繪制 IL-10、TGF-β1及IL-21的標準曲線。

2 結果

2.1 AML組與對照組一般資料比較AML組與對照組在性別、年齡方面均衡可比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組相比,AML組的白細胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組一般資料的比較

2.2 AML組與對照組Tfh細胞和Tfr細胞水平比較流式結果顯示,與對照組相比,AML組中的Tfr細胞比例明顯升高(P<0.05),Tfh細胞比例略升高(P>0.05),Tfh/Tfr比值明顯降低(P<0.05),見圖1、表2。與預后中等組和預后良好組相比,預后不良組Tfr比例明顯增高(P<0.05),Tfh/Tfr比值明顯降低(P<0.05);與預后良好組相比,預后中等組Tfr細胞比例水平增高(P<0.05),而Tfh/Tfr比值明顯降低(P<0.05),見表3。

圖1 AML組與對照組中Tfh、Tfr細胞的流式圖

表2 兩組外周血中Tfh、Tfr和Tfh/Tfr細胞比例水平比較

表3 不同預后分層AML患者外周血中Tfr、Tfh/Tfr細胞比例水平比較

2.3 AML患者與對照組血清IL-10、TGF-β1及IL-21的水平比較ELISA結果顯示,與對照組相比,AML組血清中IL-10、TGF-β1水平明顯增高(P<0.05),而血清IL-21水平略增高,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。與預后中等組和預后良好組相比,預后不良組血清IL-10、TGF-β1水平明顯增高(P均<0.05);與預后良好組相比,預后中等組血清TGF-β1、IL-10水平升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表5。

表4 兩組血清中IL-10、TGF-β1和IL-21表達水平比較

表5 不同預后分層AML患者血清中IL-10、TGF-β1表達水平比較

2.4 AML患者與對照組外周血BCL-6和Blimp-1蛋白相對表達水平的比較與對照組相比, AML患者外周血Blimp-1蛋白相對表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而BCL-6蛋白相對表達水平略升高,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2、表6。

圖2 AML組和對照組BCL-6和Blimp-1蛋白的相對表達水平

表6 兩組BCL-6和Blimp-1蛋白表達水平的比較

2.5 AML患者外周血中Tfr和Tfh/Tfr比值與其細胞因子IL-10、TGF-β1之間的相關性Pearson相關性分析結果顯示,Tfr細胞與AML患者血清IL-10、TGF-β1水平呈正相關(r=0.706、0.619,P<0.000 1),Tfh/Tfr比值與AML患者血清IL-10、TGF-β1水平呈負相關(r=-0.454,-0.446,P<0.001),見圖3。

圖3 AML患者外周血Tfr細胞和Tfh/Tfr比值與細胞因子IL-10、TGF-β1的相關性分析

3 討論

急性髓系白血病(AML)是造血組織惡性侵襲的腫瘤,是成人急性白血病最常見的一種類型。AML的發(fā)病機制比較復雜,免疫調(diào)節(jié)因子表達異常和免疫細胞的存活與凋亡參與了AML的發(fā)生發(fā)展,尤其是T細胞免疫功能[10-11]。在不同抗原刺激及細胞因子環(huán)境下,初始的CD4+T細胞可以分化為輔助性T細胞(Th),如Th1、Th2、Th17、Tfh和Tfr等細胞,這些免疫細胞及其細胞因子在AML疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

Tfh及Tfr細胞均是由CD4+T淋巴細胞分化而來。Tfh細胞是2000年由Schaerli與Breitfeld等[12-13]人首次提出,其表達核心轉錄因子BCL-6及分泌細胞因子IL-21,促進Tfh細胞分化,在生發(fā)中心(GC)中輔助B細胞增殖分化,增強機體體液免疫效應[14]。相比于健康人,Tfh細胞數(shù)量在多種腫瘤疾病中增多,如腸癌、肝癌、乳腺癌及血液系統(tǒng)腫瘤等疾病[15-17],而在AML患者中少見報道。Tfr細胞于2011年在源自外周淋巴器官中胸腺Treg前體的細胞亞群中被首次發(fā)現(xiàn),可同時表達Tfh和Treg細胞的標志物,其在功能上具有Tfh細胞和Treg細胞的雙重特征,即Tfr細胞負性調(diào)控B細胞增殖化及GC形成,對維持正常的免疫功能至關重要[18]。已有研究表明,卵巢癌局部浸潤的Tfr細胞可以通過抑制 CD8+T細胞活性,促進腫瘤生長[19];而在乳腺癌中,Tfr細胞則主要參與抑制Tfh細胞介導的體液免疫形成[20]。

Guo等[8]研究學者報道,與健康對照組相比,初診AML患者外周血的Tfr細胞比例增高,Tfh/Tfr細胞比例降低,本研究結果與其一致,都表明AML患者中存在Tfh/Tfr的免疫紊亂,可能導致了疾病的發(fā)生。Guo等的研究還發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過1個周期的誘導化療后,與未達到CR的患者相比,達到CR的AML患者中Tfr細胞明顯降低,而Tfh/Tfr比例明顯增高,提示化療后患者的Tfh/Tfr細胞失衡狀態(tài)得到扭轉,恢復AML患者體內(nèi)正常免疫應答。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)隨著患者預后越差,Tfr細胞比例越高,而Tfh/Tfr比值明顯降低。這些均提示Tfr細胞可能與AML疾病的發(fā)生有重要關聯(lián),并且Tfh/Tfr比值也可能是AML患者疾病進展中的一個重要指標。故推測患者體內(nèi)出現(xiàn)Tfr細胞數(shù)量增加,Tfh/Tfr比例失調(diào),打破了正常的免疫穩(wěn)態(tài),隨著腫瘤負荷增加,致使惡性克隆細胞產(chǎn)生了免疫逃逸。

本研究通過分析相關轉錄因子蛋白水平與AML疾病發(fā)病的關系,發(fā)現(xiàn)在AML患者體內(nèi)存在轉錄因子BCL-6/Blimp-1的失衡,并且該平衡偏向于Blimp-1蛋白水平減低,可能低水平的Blimp-1參與了AML的發(fā)病。

Tfr細胞可以通過IL-10作用于B細胞,調(diào)節(jié)GC B細胞的成熟,又可以通過高表達TGF-β調(diào)控Tfh細胞分化,抑制其輔助B細胞成熟[21-22]。本研究結果顯示,AML患者中,Tfr細胞分泌的細胞因子IL-10、TGF-β1水平明顯高于對照組,且預后不良組患者血清中IL-10、TGF-β1細胞水平又顯著高于預后中等組和預后良好組,表明隨著疾病的進展,Tfr細胞通過表達更高水平的免疫抑制因子,表現(xiàn)出更強的免疫抑制作用。

本研究采用Pearson進行相關性分析,結果顯示,AML患者血清中IL-10、TGF-β1水平與Tfr細胞比例呈正相關,說明AML患者體內(nèi)高水平的IL-10、TGF-β1細胞因子可能上調(diào)了Tfr細胞的免疫抑制功能,發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象,可能是導致疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。Tfh和Tfr細胞分化、發(fā)育及調(diào)控機制受很多因素影響,其中BCL-6/Blimp-1是一對相互拮抗的轉錄調(diào)節(jié)因子,在Tfh、Tfr細胞分化過程中起到關鍵調(diào)節(jié)作用。轉錄因子Blimp-1是BCL-6的拮抗因子,可抑制BCL-6的表達,阻止CD4+T細胞向Tfh細胞分化,抑制Tfr細胞分化[23]。在Blimp-1特異性缺失的小鼠中,發(fā)現(xiàn)Tfr細胞數(shù)量顯著增加[24]。另一項研究表明,T淋巴細胞核因子2(NFAT2)上調(diào)Treg細胞表面上CXCR5的表達,進而轉化Tfr細胞,Blimp-1可直接通過抑制NFAT2的表達,從而進一步抑制Tfr細胞的分化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)AML患者體內(nèi)出現(xiàn)Tfr細胞水平升高,轉錄因子Blimp-1水平減低,推測可能Blimp-1負性調(diào)控Tfr細胞分化,AML患者中Blimp-1的低表達,導致Tfr細胞過度分化,高表達的Tfr細胞可能通過分泌IL-10和TGF-β1促進CD4+T細胞向Tfr分化,導致Tfh/Tfr平衡紊亂,進而參與了AML疾病的進一步發(fā)生。本實驗為單中心研究,樣本量相對較少,今后可擴大樣本量以減少其他混雜因素對結果的影響。

綜上所述,AML患者Tfr細胞及其細胞因子高表達,存在Tfh/Tfr比值失衡,并與AML不良預后相關,為AML的免疫致病機制研究提供理論基礎,未來可能成為AML的治療和預后預測指標。