N-乙酰半胱氨酸聯合缺血后處理減輕糖尿病小鼠心肌缺血再灌注后肺損傷的作用研究

李愛梅, 吳建江, 姜巧巧, 戴曉雯

(新疆醫科大學第一附屬醫院麻醉科, 烏魯木齊 830054)

心臟手術不僅可引起心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷,還可促進遠端器官的損傷,包括肺、腦、腎等[1-2]。糖尿病患者在發生心臟疾病時易引發嚴重的呼吸系統疾病,糖尿病患者心肌I/R引起的急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)要重于非糖尿病患者[3-4]。

缺氧誘導因子-1α (Hypoxia-inducible factors-1α,HIF-1α)是一種氧依賴性轉化激活劑,已被證實在ALI中發揮重要作用,可作為ALI潛在的治療靶點。HIF-1α-血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)通路已被證實可通過調節血管重構以及血管舒縮反應參與血管生成、紅細胞生成、能量代謝、細胞增殖和存活,并且能夠使缺氧組織和細胞維持氧穩態以耐受缺血缺氧[5-6]。

缺血后處理(Ischemic postconditioning,IPostC)已被證實對心臟、大腦、肝臟、腎臟和脊髓的I/R損傷有保護作用,其機制與內源性保護機制中多個相互作用的成分有關,但在糖尿病狀態下,其保護作用缺失[7]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一種臨床常用的巰基遞質,是一種強抗氧化劑,可通過其硫醇基團直接清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS),增加細胞內谷胱甘肽水平[8]。Guo等[9]研究表明,NAC可顯著減輕器官缺血再灌注損傷,并且可對遠端器官發揮至關重要的保護效應。本研究旨在探討NAC聯合IPostC對糖尿病小鼠心肌缺血再灌注后肺損傷的作用及機制,以期為臨床上制定科學的圍術期肺保護策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組選取30只15周齡雄性dbdb糖尿病小鼠,體重50～60 g,測得每只小鼠隨機血糖均≥16.7 mmol /L,并伴有糖尿病癥狀(多飲、多食、多尿)。實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0010,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物均在新疆醫科大學SPF級動物實驗室飼養,室溫20～25℃,濕度55%,給予糖尿病鼠高糖高脂飲食。本實驗經新疆醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準(IACUC-20220620-02)。將30只糖尿病鼠隨機分為3組, 假手術組(D-SO組,n=10)、心肌缺血/再灌注組(D-I/R組,n=10)和NAC聯合缺血后處理組(D-NAC+IPostC組,n=10)。

1.2 心肌缺血再灌注模型的制備所有dbdb糖尿病小鼠在實驗前均禁食, 麻醉采用氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射,麻醉后進行氣管插管人工呼吸,呼吸量為1.5 mL/100 g,呼吸頻率為60次/min。糖尿病小鼠取仰臥位,胸部剃毛,在胸骨左側約2 mm處,行左側開胸術,切開第四和第五肋骨。肝素鈉(500 IU/kg)通過尾靜脈注射給藥。采用冠狀動脈前降支閉塞60 min后再灌注15 min的方法建立心肌缺血再灌注(I/R)損傷模型。D-SO組僅在麻醉下開胸,采用相同的手術方法,不結扎冠狀動脈前降支。D-I/R組模型建立以缺血區變色、心電圖肢體導聯II-ST段升高證實造模成功。IPostC誘導方法為再灌注15 min前,進行3個周期再灌注(10 s)和再閉塞(10 s)。NAC給藥方法為夾閉冠狀動脈左前降支前30 min,按照150 mg/kg劑量腹腔注射。D-NAC+IPostC組I/R前給予NAC(sigma,1009005),后進行心肌缺血60 min,于再灌注前進行3個循環IPostC,后再灌注15 min。在再灌注結束時,進行血液和組織樣本的采集,并進一步分析。

1.3 肺部組織病理學觀察取右肺中葉最上段的肺樣本,浸泡在4%甲醛中,石蠟包埋,切片,蘇木精伊紅染色。采用盲法對肺組織切片進行檢查和評分。

根據光學鏡下觀察到的肺損傷的異常情況,即肺泡充血、出血、炎癥細胞浸潤、細胞壞死及水腫情況,對肺損傷程度進行評分。在肺組織學切片,損傷嚴重程度采用5分制分級:顯微鏡下異常視野若小于1/4、1/4～1/2、1/2～3/4或≥3/4部分,則評分分別為0、1、2、3和4。每張切片均檢查5個或5個以上的區域,以盡量減少區域間差異[4]。

1.4 肺濕干重比(W/D)用干濕肺重(W/D)比作為肺水腫指標。切除左下肺并立即稱量(濕重),然后將肺組織在60℃的烤箱中干燥48 h,并稱重(干重),計算兩者的比值。

1.5 血清炎性因子的測定再灌注2 h后,采集頸動脈血液樣本,然后離心分離血清,檢測C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1的水平。

1.6 肺通透性指數的測定取支氣管肺泡灌洗液,離心,取上清置于冰箱。血清和肺泡灌洗液中蛋白濃度是采用二辛可寧酸法(Bicinchoninic acid,BCA)法進行檢測,肺通透性指數為兩者的比值。

1.7 血清中氧化應激相關因子的測定再灌注2 h后,采集頸動脈血液樣本,然后離心分離血清,采用ELISA試劑盒(南京建成)檢測丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的水平。

1.8 肺組織HIF-1α、VEGF蛋白表達的測定取肺組織,用電動勻漿機在裂解緩沖液中勻漿,然后在4℃下,12 000 r/min,離心15min。用BCA蛋白測定試劑盒測定后,上清作為蛋白樣品。取等量的樣品,使用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離,然后將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,漂洗。分別加入一抗HIF-1α(Abcam,ab179483)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)(Abcam,ab214424),將PDVF膜與之在4℃下孵育過夜,漂洗后加入山羊抗兔IgG H&L(Abcam,ab205718),顯色后采用軟件分析蛋白吸光度值。

2 結果

2.1 小鼠肺組織光學鏡下病理改變情況本研究結果顯示,心肌I/R可引起糖尿病小鼠肺臟的病理學形態學改變。D-SO組為正常肺組織結構,未見損傷性改變。D-I/R組鏡下可見肺水腫、出血及彌漫性白細胞浸潤,肺損傷評分升高。D-NAC+IPostC組鏡下肺組織損傷明顯減輕,可見散在的白細胞及少量紅細胞浸潤。與D-I/R組比較,D-NAC+IPostC組小鼠肺損傷評分降低(圖1、表1)。

D-SO組

D-NAC+IPostC組

2.2 3組小鼠肺組織濕干重(W/D)比值比較D-NAC+IPostC組和D-I/R組小鼠的W/D明顯高于D-SO組(P<0.05),而D-NAC+IPostC組小鼠的濕/干重比明顯低于D-I/R組(P<0.05)(表1)。

2.3 3組小鼠肺通透性指數比較心肌I/R后糖尿病小鼠肺通透性發生了顯著變化。與D-SO組比較,D-NAC+IPostC組和D-I/R組小鼠肺通透指數明顯升高(P<0.05),而D-NAC+IPostC組小鼠的肺通透指數明顯低于D-I/R組(P<0.05)(表1)。

表1 3組小鼠肺損傷評分、肺濕干重比及肺通透性指數比較

2.4 3組小鼠血清炎癥因子水平比較與D-SO組比較,D-I/R組小鼠的CRP和TNF-α水平降低(P<0.05),MCP-1水平升高(P<0.05)。與D-I/R組比較,D-NAC+IPostC組小鼠的CRP水平明顯升高(P<0.05),TNF-α及MCP-1水平明顯降低(P<0.05)(表2)。

表2 3組小鼠炎癥因子表達水平的比較

2.5 3組小鼠氧化應激指標的比較心肌I/R后,糖尿病小鼠肺組織氧化應激增加。與D-SO組比較,D-I/R組及D-NAC+IPostC組MDA含量增加,SOD和GSH含量降低,與D-I/R組相比,D-NAC+IPostC組MDA含量降低,SOD和GSH含量升高(P<0.05)(表3)。

表3 3組小鼠氧化損傷程度的比較

2.6 3組小鼠肺組織HIF-1α和VEGF水平的比較與D-SO組比較,D-I/R組及D-NAC+IPostC組小鼠HIF-1α和VEGF表達水平升高(P<0.05),與D-I/R組相比,D-NAC+IPostC組小鼠HIF-1α和VEGF表達水平增加 (表4、 圖2)。

表4 3組小鼠缺氧誘導因子1α和VEGF表達水平的比較

圖2 3組HIF-1α和VEGF表達水平的比較圖

3 討論

多項研究表明,心肌缺血再灌注后遠端器官中,肺是易受損傷的器官之一,并且糖尿病患者肺損傷更加嚴重[10-11]。糖尿病可加重肺功能障礙,其機制可能涉及氧化應激、炎癥反應、NF-κB通路以及線粒體功能障礙等。本研究結果顯示,糖尿病小鼠心肌I/R可引起急性肺損傷,表現為肺組織病理損傷加重,肺組織氧化應激增加,肺水腫加重,肺通透性指數增加。這與Kong等[2]的研究結果一致。

NAC是一種自由基清除劑和谷胱甘肽前體,可作為粘液增溶劑用于治療各種呼吸道疾病[12]。最新的研究表明[13-14],N-乙酰半胱氨酸還有其他藥理作用,例如清除自由基,減少炎性細胞因子、趨化因子和粘附分子的產生,以及對心肌缺血/再灌注損傷有保護作用。缺血后處理也是減少心肌缺血/再灌注損傷的有效方法,但其在糖尿病狀態下心肌保護作用缺失。Guo等[9]研究結果證實,NAC可降低大鼠腸系膜I/R后的炎癥和肺損傷。Li等[15]研究結果證實,IPostC可通過抑制內質網應激誘導的肺泡上皮細胞凋亡,有效改善心肌缺血再灌注誘導的肺損傷。本研究結果表明,NAC聯合IPostC可有效降低心肌I/R后肺損傷,表現為肺組織病理學損傷減輕,循環中炎癥因子下降,肺組織氧化應激程度降低。

HIF-1α是調節氧穩態的關鍵因子,其激活可通過改變能量代謝、細胞增殖、血管生成和血管重構,在缺氧環境中增強細胞的存活力[15]。HIF-1α的穩定表達使細胞或組織適應心肌I/R損傷期間的缺氧反應,保護心肌細胞免受缺血缺氧的影響,改善患者預后[16-17]。Semenza等[18]研究證實,HIF-1α對預防心肌I/R損傷至關重要,VEGF作用于HIF-1α的下游,在心肌I/R損傷中可發揮有效的心肌保護效應。本研究結果表明,糖尿病小鼠心肌I/R可引起肺組織HIF-1α/VEGF通路蛋白變化,表現為肺組織HIF-1α及VEGF蛋白表達增加,而NAC聯合IPostC可通過激活HIF-1α/VEGF通路發揮肺保護作用。

綜上所述,本研究結果證實糖尿病小鼠心肌I/R可引起肺損傷,其機制可能與HIF-1α/VEGF通路有關,NAC聯合IPostC可通過抑制炎癥反應、降低肺組織氧化應激、激活HIF-1α/VEGF通路減輕糖尿病小鼠心肌I/R后肺損傷。提示HIF-1α是一個潛在的分子靶點,可為臨床治療糖尿病并發肺損傷提供新思路。