疏花薔薇花總多酚提取工藝優化及其抗氧化活性

郭瑛，趙文惠，李安林，馮倩倩，田莉，3*

（1.新疆醫科大學中醫學院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學中心實驗室，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆名醫名方與特色方劑學重點實驗室，新疆烏魯木齊 830017）

疏花薔薇（RosalaxaRetz.）屬于薔薇科灌木植物，在新疆阿爾泰山區、額敏河谷平原、準噶爾山區以及沿天山一帶廣泛分布，其多生于海拔500～1 200 m 的平原荒漠、礫質河灘地、灌叢、戈壁荒地、鹽堿地、干溝邊或河谷旁[1]。疏花薔薇耐干旱、耐瘠薄、耐寒、抗病蟲、抗逆性強，其株型優美，凈化空氣能力強，同時花開繁密、色白清雅，現為新疆一種主要的園林景觀灌木[2]。疏花薔薇的花蕾或初開的花可以作為茶飲，具有清熱解毒、活血、止痛等功效，可用于治療感冒、發燒、延緩衰老和癲癇發作[3]。目前，疏花薔薇花作為新疆特色植物資源尚未被有效開發利用。

多酚類化合物廣泛分布于自然界植物中，包括酚酸類、黃酮類、花色苷類等芳環上連有多個酚羥基的化合物，其所含酚羥基易與自由基發生反應具有抗氧化作用[4]。鞣花酸是廣泛存在于植物中的一種天然多酚成分，具有良好的抗氧化特性，被廣泛應用于食品、醫藥領域[4?6]。本課題組前期研究發現，疏花薔薇花含有鞣花酸、沒食子酸、兒茶素等多酚成分，其中鞣花酸含量最高，目前，對疏花薔薇花的化學成分及藥效研究尚無文獻報道。本研究采用單因素試驗結合響應面法優化疏花薔薇花總多酚的提取工藝，以疏花薔薇花總多酚、鞣花酸和浸膏得率的綜合評分為考察指標，并評價其抗氧化活性，以期為該資源的開發研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

疏花薔薇花：2022年6月采自于烏魯木齊市雅瑪里克山，經新疆醫科大學徐海燕教授鑒定為薔薇科（Rosaceae）植物疏花薔薇（RosalaxaRetz.）的花，置于陰涼通風處陰干。

鞣花酸、沒食子酸（純度＞98%）：成都曼思特公司；維生素C：成都市科龍化工試劑廠；1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?diphenyl?2?picrylhydrazyl radical，DPPH）、2，2′?聯氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid），ABTS]：上海麥克林生化科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵：天津市盛奧化學試劑有限公司；磷酸緩沖液：武漢賽維爾生物科技有限公司；無水乙醇：天津市致遠化學試劑有限公司；無水甲醇、甲酸（均為色譜純）：中國湖北弗頓科學技術有限公司。除特殊說明外，均為分析純。

1.2 儀器與設備

SL?200 高速多功能粉碎機：浙江省永康市松青五金廠；1200 高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；722S可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；XS105電子天平：瑞士梅特勒?托利多儀器有限公司；KQ?5200DE數控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總多酚含量測定

疏花薔薇花經高速多功能粉碎機粉碎，過80 目篩，制得疏花薔薇花粉末。參照文獻[7?8]的方法測定疏花薔薇花粉末中總多酚的含量。

1.3.2 鞣花酸含量測定

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取鞣花酸對照品10.00 mg，加入甲醇溶解，稀釋至濃度為1.00 mg/mL 的鞣花酸對照品儲備液。

1.3.2.2 鞣花酸的色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）?0.1% 甲酸水（B），等度洗脫：0～10 min，50%A；檢測波長：254 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為10μL。

1.3.2.3 線性考察

精密吸取1.3.2.1 項下鞣花酸對照品儲備液適量，用甲醇稀釋制成質量濃度分別為5、10、25、50、75、100 μg/mL 的系列濃度溶液，按照1.3.2.2 項下條件測定，記錄峰面積。以鞣花酸的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2.4 精密度、重復性和穩定性考察

取1.3.2.3 項下溶液，按照1.3.2.2 項下條件重復測定6 次，記錄峰面積，并計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值，考察儀器的精密度。

稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行6 份，按照1.3.2.2 項下條件測定，記錄峰面積，并計算RSD 值，考察樣品的重復性。

取疏花薔薇花供試品溶液，按照1.3.2.2 項下條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 測定，記錄峰面積，并計算RSD 值，考察鞣花酸的穩定性。

1.3.2.5 加樣回收率

精密稱取疏花薔薇花約2.000 0 g，平行6 份，加入一定量的鞣花酸，按照1.3.2.2 項下條件測定，計算加樣回收率。

1.3.3 供試樣品提取方法考察

精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行9 份，分為3 組，3 份/組，考察浸漬、超聲和回流3 種提取方法的提取效率。以50% 乙醇為提取溶劑，料液比1∶20（g/mL），分別按照浸漬提取12 h、超聲輔助提取60 min、回流提取60 min，提取液均過濾，續濾液蒸干，稱重；再分別稱取適量浸膏，用50%乙醇溶液復溶，分別按1.3.1 和1.3.2.2 項下方法測定總多酚和鞣花酸的含量，按下列公式計算浸膏得率和綜合評分。

p=m/M×100

C=（x/X）×0.4×100+（y/Y）×0.4×100+（p/P）×0.2×100

式中：p為浸膏得率，%；m為浸膏質量，g；M為藥材質量，g；C為綜合評分；x為總多酚含量，mg/g；X為最大總多酚含量，mg/g；y為鞣花酸含量，mg/g；Y為最大鞣花酸含量，mg/g；P為最大浸膏得率，%。

1.3.4 樣品回流次數的選擇

精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行12份，分為4 組，3 份/組，以50% 乙醇為回流提取溶劑，料液比1∶20（g/mL），回流提取60 min，分別回流提取1、2、3、4 次，所得提取液以總多酚含量、鞣花酸含量及浸膏得率的綜合評分為考察指標，考察不同回流次數的提取效果。

1.3.5 疏花薔薇花總多酚提取工藝單因素試驗

以總多酚含量、鞣花酸含量及浸膏得率的綜合評分為指標，分別考察回流時間（30、60、90、120、150 min）、乙醇體積分數（20%、35%、50%、65%、80%）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]對綜合評分的影響[9?11]。

1.3.6 響應面優化疏花薔薇花總多酚提取工藝試驗

根據單因素試驗結果，確定響應面的自變量范圍。精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，采用Box?Benhnken 試驗設計，以響應面試驗優化疏花薔薇花總多酚提取工藝參數[12?13]，因素水平見表1。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of experiment

1.3.7 工藝驗證

精密稱取疏花薔薇花粉末約2.000 0 g，平行3 份，按1.3.6 項下提取優化工藝參數進行工藝驗證，按照1.3.3項下公式計算綜合評分，并與模型擬合值進行比較。

1.3.8 疏花薔薇花總多酚提取物的抗氧化活性研究

精密稱取疏花薔薇花總多酚提取物和維生素C 適量，以55%乙醇溶解，分別制得0.002 0、0.006 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 mg/mL 系列濃度供試品溶液。

1.3.8.1 DPPH 自由基清除能力

分別精密量取0.1 mg/mL DPPH 溶液1.0 mL 和系列濃度供試品溶液1.0 mL，混勻，作為樣品溶液；取55% 乙醇1.0 mL 與系列濃度供試品溶液1.0 mL，混勻，作為自身對照溶液；取無水乙醇1.0 mL 與DPPH溶液1.0 mL，混勻，作為空白對照溶液。樣品溶液、自身對照溶液、空白對照溶液均常溫避光反應30 min，在517 nm 波長處測定，吸光度依次為A1、A2、A0，均重復測定3 次，取平均值，并以相同濃度的VC作為陽性對照，計算DPPH 自由基清除率（X，%）[14]和IC50值，公式如下。

X=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.3.8.2 ABTS+自由基清除能力

精密量取7 mmol/L 的ABTS 溶液10 mL 和2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液10 mL，混勻，室溫避光條件放置12 h，制得ABTS 母液；再用無水乙醇稀釋ABTS 母液直至其在734 nm 波長處的吸光度為0.70±0.02，制得ABTS 工作液。分別精密量取ABTS 工作液2 mL 與系列濃度供試品溶液0.15 mL，混勻，作為樣品溶液；取55% 乙醇2 mL 與和系列濃度供試品溶液0.15 mL，混勻，作為自身對照溶液；取ABTS 工作液2 mL 與無水乙醇0.15 mL，混勻，作為空白對照溶液。樣品溶液、自身對照溶液、空白對照溶液均常溫避光反應15 min，在734 nm 波長處測定，吸光度依次為A1、A2、A0，均重復測定3 次，取平均值，并以相同濃度的VC作為陽性對照，計算ABTS+自由基清除率（Y，%）[15]和IC50值，公式如下。

Y=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.3.8.3 還原能力

分別量取系列濃度供試品溶液1.0 mL，依次加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）2.5 mL，1% 鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，5 000 r/min 離心5 min，取2.5 mL 上清液，依次加入3% 三氯化鐵溶液0.5 mL 和純水2.5 mL。在700 nm 波長處測定吸光度，重復測定3 次，取平均值，以相同濃度的VC溶液作為陽性對照，用吸光度表示還原力的大小[16]。

1.4 數據處理

采用Design Expert 13.0.1 分析數據，并對試驗結果進行多元回歸擬合。

2 結果與分析

2.1 總多酚含量的方法學考察

2.1.1 線性關系考察

以沒食子酸對照品溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為y=110x+0.000 2（r=0.999 6），表明在1.5～7.5μg/mL 濃度范圍內線性關系良好。

2.1.2 精密度、穩定性、重復性試驗和加樣回收率試驗

精密度測定的RSD 為0.20%，表明儀器精密度良好；穩定性RSD 為1.34%，表明供試品溶液在1 h 內穩定性良好；重復性RSD 為0.35%，表明方法的重復性良好；加樣回收率RSD 為2.07%，表明本檢測方法準確。

2.2 鞣花酸含量的方法學考察

2.2.1 專屬性考察

在建立的色譜條件下，鞣花酸與相鄰色譜峰分離度大于1.5，對稱因子在0.95～1.05，理論塔板數不低于5 000，色譜圖見圖1。

2.2.2 線性關系考察

以鞣花酸對照品溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為y=14.92x-15.62（r=0.999 9），在5～100 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度、穩定性、重復性試驗

精密度RSD 為1.41%，結果表明儀器精密度良好；穩定性RSD 為1.61%，表明供試品溶液在24 h 內穩定；重復性RSD 為3.48%，表明本法重復性符合要求。

2.2.4 加樣回收率試驗

鞣花酸加樣回收率的RSD 為2.32%，表明該檢測方法準確，加樣回收率見表2。

表2 加樣回收率結果Table 2 Results of sample adding recovery

2.3 提取方法選擇

不同提取方法對提取綜合評分的影響見表3。

表3 提取方法測定Table 3 Extraction method determination

由表3 可知，回流提取法的綜合評分最高，因此采用回流提取法提取樣品。

2.4 回流次數選擇

不同回流次數對綜合評分的影響見表4。

表4 回流次數考察Table 4 Number of withdrawals examined

由表4 可知，為了綜合考慮能耗、試劑損耗以及工作時間，確定回流次數為2 次。

2.5 單因素試驗結果

各因素提取疏花薔薇花總多酚的綜合評分見圖2。

圖2 各因素提取疏花薔薇花總多酚的綜合評分Fig.2 Comprehensive score of total polyphenol extraction effi?ciency of Rosa laxa Retz.flowers

由圖2 可知，當回流時間為30～90 min 時，綜合評分隨時間延長而持續增加，繼續延長回流時間，綜合評分隨時間延長明顯下降，回流提取90 min 時綜合評分最高[17]。當乙醇體積分數從20%升至50%，綜合評分明顯上升，之后再增大乙醇體積分數，綜合評分下降，乙醇體積分數為50% 時綜合評分最高[18]。當料液比從1∶15（g/mL）增大到1∶20（g/mL）時，綜合評分隨之增加，之后再增大料液比，其綜合評分緩慢降低[19]，確定料液比為1∶20（g/mL）時綜合評分最高。

2.6 響應面試驗結果及分析

2.6.1 響應面試驗結果

疏花薔薇花提取工藝的響應面試驗設計結果見表5。

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Experimental design and results of response surface method

2.6.2 模型擬合及方差分析

采用Box?Benhnken 13.0.1 軟件擬合各因素，根據已確立的模型，繪制各影響因素對綜合評分影響的3D響應面及等高線，如圖3所示。響應面回歸模型方差分析見表6。

圖3 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖Fig.3 Response surface diagram of the influence of each element interaction on comprehensive score

表6 響應面回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of response surface regression model

所得二項式回歸模型為綜合評分=96.09-1.79×A+8.11B+2.64C-3.34AB-2.76AC+3.11BC-9.98A2-13.26B2-0.987 0C2，由方差分析結果和擬合后的二次多項回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型一次項B極顯著（P＜0.01），C顯著（P＜0.05），A不顯著；二次項A2、B2極顯著（P＜0.01），C2不顯著；交互項AB、BC顯著（P＜0.05），AC不顯著。從F值可知單因素的影響順序B＞C＞A，即乙醇體積分數＞回流時間＞料液比。

2.6.3 響應面優化預測

利用Design Expert 13.0.1 軟件，優選疏花薔薇花總多酚提取各影響因素的最佳取值為乙醇體積分數55.189%、料液比1∶23.849（g/mL）、回流提取88.881 min。為便于實際操作，調整提取工藝參數為乙醇體積分數55%，料液比1∶25（g/mL），回流提取2 次，90 min/次。

2.6.4 3批樣品工藝驗證

疏花薔薇花總多酚提取結果顯示，浸膏得率為（51.36±0.78）%，總多酚含量為（141.36±2.07）mg/g，鞣花酸含量為（13.46±0.14）mg/g，綜合得分為98.56，RSD值為1.05%，與預測值99.76 的平均偏差為1.20%，表明驗證結果與預測值吻合良好。

2.7 抗氧化結果及分析

疏花薔薇花總多酚提取物對DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力及還原能力如圖4所示。

圖4 疏花薔薇花總多酚提取物的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity of total polyphenol extracts from Rosa laxa Retz.flowers

由圖4A 可知，疏花薔薇花總多酚提取物濃度在0.002～0.05 mg/mL 時，隨著濃度增加，其對DPPH 自由基清除率明顯增加，呈較強的劑量依賴性[20?22]；當濃度超過0.05 mg/mL 時，清除率增長趨勢變緩。疏花薔薇花總多酚提取物的DPPH 自由基清除能力略低于VC，兩者的IC50值分別為0.02 mg/mL 和0.01 mg/mL。

由圖4B 可知，疏花薔薇花總多酚提取物濃度在0.002～0.100 mg/mL 時，隨著濃度增加，其對ABTS+自由基的清除率明顯增加，呈較強的劑量依賴性，當濃度超過0.100 mg/mL 時，清除率增長趨勢變緩[16]。疏花薔薇花總多酚提取物的ABTS+自由基清除能力略低于VC，兩者的IC50值分別為0.03 mg/mL 和0.02 mg/mL。

由圖4C 可知，隨著濃度增加，疏花薔薇花總多酚提取物的還原能力不斷增強，并呈明顯的劑量依賴性[23]。相同濃度下（0.04～0.16 mg/mL），VC的還原能力明顯高于疏花薔薇花總多酚提取物。

綜上所述，疏花薔薇花總多酚提取物的抗氧化能力存在明顯的劑量關系，與VC相比，具有較強的抗氧化活性。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化疏花薔薇花總多酚和鞣花酸的提取工藝條件，最終確定疏花薔薇花總多酚的最佳提取工藝參數為回流提取2 次、每次90 min、乙醇體積分數為55%、料液比為1∶25（g/mL），同時在最優工藝的下進行了3 次工藝驗證，浸膏得率為（51.36±0.78）%、總多酚含量為（141.36±2.07）mg/g、鞣花酸含量為（13.46±0.14）mg/g，綜合評分為為98.56。疏花薔薇花對DPPH 自由基和ABTS+自由基清除率最高值分別為92.06% 和98.65%，還原能力較強。結果表明，疏花薔薇花具有較好的體外抗氧化活性，具有重要的食用價值。