基于多元統計分析的“紫脈龍韻”苦茶主要滋味品質評價

吳玲玲，黃靜，巫虹穎，梁賢智，翁小婷，駱妍妃，農玉琴，王明釋，陳遠權

（廣西南亞熱帶農業科學研究所，廣西崇左 532415）

苦茶（Camelliasinensisvar.kucha）是我國特有的一類茶樹資源，含有特殊的嘌呤生物堿—苦茶堿，其具有獨特的品質風味和保健功效[1]，近年來，逐漸成為茶葉領域的重點研究對象。關于苦茶資源的鑒定[2]、代謝組學[3?4]、轉錄組學[5?6]、保健功效評價[1]、遺傳多樣性分析[7]、苦茶堿合成途徑[8]等相關研究日益增多。目前，研究較多的是廣東、云南、湖南、四川、福建等地區的苦茶[9]，廣西苦茶資源相對稀缺，相關研究鮮有報道。“紫脈龍韻”是課題組前期篩選出的苦茶品種，該品種產量較高、持嫩性較強、新梢花青甙略顯紫色，抗性與生長勢綜合表現優良，其滋味品質成分有待研究。

苦茶芽葉滋味極苦，經過一定的加工處理后，制成的茶葉仍具有一定的苦味。研究表明，茶湯的苦味主要是茶多酚、生物堿、兒茶素、花青素等多種物質共同作用的結果[10]。茶樹鮮葉是制備茶葉的原料，嫩度不同的鮮葉，其物質基礎不同[11]，加工而成的茶葉品質也不同。茶葉品質的好壞及其適制性與鮮葉滋味物質密切相關[12?13]。對不同嫩度鮮葉進行綜合評價與分類，以便制定相應的標準化工藝加工出不同等級的茶葉。常規茶樹品種嘌呤生物堿以咖啡堿為主，然而，隨著健康生活理念的普及，人們對低咖啡堿功能性茶葉產品的需求逐漸增加。苦茶中存在與傳統茶葉不同的嘌呤生物堿模式，苦茶堿含量相對較高。盡管苦茶堿與咖啡堿在結構上相似，但其不具有咖啡堿的刺激性，具有鎮靜催眠、抗抑郁、消炎及鎮痛等生理活性[14]。因此，開發富含苦茶堿的適制茶類及功能成分產品不僅能滿足一些特殊人群對茶葉的需求，還能提高苦茶資源的利用價值和經濟效益。地區及茶樹組織部位的不同，嘌呤生物堿的含量及分布亦不同。福建云霄苦茶和安溪苦茶春梢隨葉位增加，其苦茶堿含量隨之增加，而大田苦茶不同葉位苦茶堿含量的變化趨勢表現為先增大后減小[11]。禿房茶中苦茶堿含量隨芽葉成熟度的增加而升高[15]，廣東苦茶中苦茶堿隨葉片成熟度的增加而緩慢降低[16]。

基于此，本研究以“紫脈龍韻”苦茶為研究對象，對不同嫩度鮮葉及不同部位進行主要滋味品質成分的測定，并運用單因素方差、聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、相關性分析及主成分分析（principal component analysis，PCA）等多元統計分析方法明確“紫脈龍韻”苦茶鮮葉嫩度差異的關鍵化合物、不同嫩度鮮葉的分類及不同部位嘌呤生物堿分布規律，以期為紫脈龍韻苦茶鮮葉的分級采摘、分級加工及功能成分提取原料的選擇提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦茶：廣西南亞熱帶農業科學研究所茶樹資源圃選育的品種“紫脈龍韻”，采摘其鮮葉（2022年3月30日）、花與果實（2022年10月20日）。

兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）：北京北納創聯生物技術研究院；咖啡堿（caffeine，CAF）、可可堿（theobromine，TB）、茶堿（the?ophylline，TP）、1，3，7?三甲基尿酸（1，3，7?trimethyluric acid，TMUA）：成都植標化純生物技術有限公司；苦茶堿（theacrine，TCR）：上海麥克林生化科技有限公司；總黃酮試劑盒、可溶性糖試劑盒、花青素試劑盒、蛋白質試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、冰醋酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

6CTH 型烘干機：浙江上洋機械有限公司；XM?P30H 超聲波清洗機：小美超聲儀器（昆山）有限公司；DW?86L388J 超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；ME203E 萬分之一電子精密天平：梅特勒?托利多國際貿易（上海）有限公司；UltiMate 3000 高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；BlueStar B 紫外可見分光光度計：萊伯泰科有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

將不同嫩度鮮葉與不同部位（芽葉、莖、花、果皮）分別置于120 ℃烘箱烘20 min 后，再在70 ℃烘箱烘至足干，干樣放入粉碎機粉碎，過60 目篩，置于-20 ℃冰箱儲存，用于主要滋味品質成分的測定。

1.3.2 常規生化成分的測定

茶多酚及游離氨基酸含量的測定分別按照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》的方法進行測定；蛋白質、可溶性糖、總黃酮、花青素含量測定的具體操作步驟根據相應試劑盒說明書進行。

1.3.3 兒茶素類、嘌呤生物堿組分及含量的測定

1.3.3.1 樣品提取方法

參考劉慶帥等[17]的方法，分別稱取1.3.1 制備的樣品0.1 g（精確到0.000 1 g）于15 mL 離心管中，加入10 mL 70% 甲醇溶液，40 ℃下超聲30 min，期間每隔5 min 上下搖勻5 次，將提取液在4 ℃冰箱靜置2 h 后取上清液過0.22μm 有機膜，加入液相瓶中待測。

1.3.3.2 色譜分析條件

參考吳世玲[18]的方法，色譜條件：UltiMate 3000 高效液相色譜儀；AcciaimTM120 C18 Column（4.6 mm×250 mm，5μm）柱；流速0.5 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm；流動相[A 相：水∶乙腈∶乙酸= 96.5∶3∶0.5（體積比）；B 相：水∶乙腈∶乙酸= 69.5∶30∶0.5（體積比）]。

1.4 數據處理

數據以平均值±標準差表示，采用Statistics SPSS 26 軟件進行單因素方差與主成分分析（principal com?ponent analysis，PCA），采用Origin 2021 軟件進行相關性分析，利用聯川生物平臺（https：//www.omicstudio.cn/home）進行聚類分析以及數據歸一化處理后繪制高級熱力圖。

2 結果與分析

2.1 不同嫩度鮮葉主要滋味品質成分單因素方差分析

可溶性糖、茶多酚、氨基酸、生物堿、兒茶素等滋味物質含量隨茶樹品種、鮮葉嫩度及部位的不同而不同[19]。不同嫩度“紫脈龍韻”苦茶鮮葉（圖1）主要滋味品質成分單因素方差分析結果如表1所示。

表1 不同嫩度鮮葉主要滋味品質成分分析Table 1 Main taste quality ingredients in fresh leaves with different tenderness

圖1 不同嫩度苦茶鮮葉Fig.1 Fresh leaves of kucha with different tenderness

可溶性糖是茶湯甜味的主要成分，能緩解茶湯滋味的苦澀味，增加茶湯的厚味和協調性[20]。由表1 可知，可溶性糖含量隨著鮮葉嫩度的降低先升高后降低，一芽三葉中可溶性糖含量最高（211.92 mg/g）。蛋白質對茶湯保持清亮起重要作用，在茶湯中呈膠體狀態。蛋白質含量隨著鮮葉嫩度的降低先升高后降低，一芽二葉中蛋白質含量最高（11.45 mg/g），一芽三葉至五葉中蛋白質含量差異不顯著（P＞0.05）。游離氨基酸是以鮮味為主的物質[21]，其含量隨著鮮葉嫩度的降低而降低，與Zhang 等[22]研究結果一致。一芽一葉中游離氨基酸含量最高（48.05 mg/g），與一芽二葉含量差異不顯著（P＞0.05），一芽三葉與一芽四葉含量差異同樣不顯著（P＞0.05）。茶多酚是茶湯滋味濃度和呈澀味的主體成分[19]，其含量隨著鮮葉嫩度的降低先升高后降低，一芽一葉與一芽二葉中茶多酚含量差異不顯著（P＞0.05）。花青素與黃酮類物質是茶葉苦澀味的主要影響物質[2，23]，兩者含量呈波動性變化，在一芽四葉含量均較高。

兒茶素類成分是主要的多酚類物質，約占茶多酚含量的75%～80%，根據分子結構分為酯型兒茶素和非酯型兒茶素，影響茶葉的苦味、澀味[24]。非酯型兒茶素苦澀味較弱，先苦后甘，收斂性較弱，爽口。酯型兒茶素苦澀味較強，收斂性強，尤其是EGCG，對茶葉的苦澀起決定性的作用[2]。一般兒茶素組分構成以酯型兒茶素為主，EGCG 和ECG 是主要的兒茶素類成分。不同嫩度“紫脈龍韻”苦茶鮮葉兒茶素類物質以酯型兒茶素為主，隨著鮮葉嫩度的降低，酯型兒茶素、EGC 與EGCG 含量逐漸降低。不同嫩度鮮葉間，EGC 含量差異顯著，其他兒茶素成分含量呈波動性變化。一芽二葉中非酯型兒茶素與兒茶素含量最高，且從一芽二葉至一芽五葉，兩者含量均降低，一芽四葉與一芽五葉之間含量差異不顯著。一芽一葉與一芽二葉中兒茶素總含量較高，且含量差異不顯著（P＞0.05），一芽三葉與一芽四葉中兒茶素總含量差異不顯著（P＞0.05），一芽五葉中含量最低。嘌呤生物堿是茶樹體內主要次級代謝產物，主要包括CAF、TB、TP、TCR 及TMUA[25]，是茶葉中主要的苦味物質，其組分構成及含量影響茶葉品質的優劣及適制性[26]。在鮮葉中未檢測到TP，不同嫩度鮮葉間，TB、CAF 隨著鮮葉嫩度的降低而降低，不同鮮葉間含量差異顯著。TCR 含量相對穩定，一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉差異不顯著，其中，一芽三葉中含量最高（12.04 mg/g）。嘌呤生物堿總含量隨著鮮葉嫩度的降低而降低，一芽三葉與一芽四葉中含量差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同嫩度鮮葉主要滋味品質成分聚類分析

為了直觀地展示22 種主要滋味物質在不同嫩度鮮葉中含量變化趨勢，采用聚類分析（hierarchical clus?ter analysis ，HCA）[27]對成分指標進行高級熱圖分析，結果見圖2。

圖2 不同嫩度苦茶鮮葉主要滋味品質成分分布熱圖Fig.2 Heat map of distribution of taste quality ingredients in fresh leaves of Kucha with different tenderness

由圖2 可知，一芽一葉中游離氨基酸與TB 含量較高，TMUA、EC、CG 含量較低。一芽二葉中非酯型兒茶素、蛋白質、GC 與C 含量較高。一芽三葉中TCR 與可溶性糖含量較高，花青素含量最低，一芽四葉中花青素含量最高，一芽五葉中總黃酮含量最高，其他成分指標含量較低。因此，可以將5 個嫩度鮮葉分為二大類，一芽一葉與一芽二葉屬于第一類，一芽三葉、一芽四葉、一芽五葉屬于第二類，分類結果較合理。Huang等[28]研究表明嫩葉中生化成分含量較高，成熟葉中含量較少，與本研究結果相似。研究結果可用于指導“紫脈龍韻”苦茶鮮葉的分級采摘。

2.3 不同嫩度鮮葉主要滋味品質成分相關性分析

茶葉滋味品質指標之間并非獨立，而是具有一定相關性，相關性分析是衡量變量因素的相關密切程度。對不同嫩度鮮葉主要滋味品質成分進行相關性分析，可明確各指標間的關系，為“紫脈龍韻”苦茶滋味品質特征的形成提供理論依據。不同嫩度鮮葉主要滋味物質的Pearson 相關性分析結果如圖3所示。

圖3 不同嫩度鮮葉主要滋味品質成分間的相關性Fig.3 Correlations of main taste quality ingredients in fresh leaves with different tenderness

由圖3 可知，不同嫩度鮮葉之間，酯型兒茶素、兒茶素、嘌呤生物堿含量均與游離氨基酸、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG 呈極顯著正相關（P＜0.01），且在這些成分中，游離氨基酸與茶多酚、CAF、EGCG、ECG 含量呈極顯著正相關（P＜0.01），CAF 與EGC、茶多酚與ECG、兒茶素與嘌呤生物堿含量均互呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.99、0.96 和0.98。GC 與C 含量呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數為0.99。蛋白質與GCG 呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數為0.97。TB 與EGC 含量呈極顯著正相關（P＜0.01），而與TMUA 含量呈極顯著負相關（P＜0.01），相關系數分別為0.96 和?0.99。由此說明，各成分指標之間存在不同程度的相關性，品質指標之間的信息存在重疊。

2.4 不同嫩度鮮葉主要滋味物質主成分分析（PCA）

不同品質指標存在不同程度差異，各品質指標間也存在不同程度相關性，使得滋味品質評價結果會因信息重疊而不明確，通過單一指標大小來評價不同鮮葉滋味品質差異并不客觀。主成分分析（PCA）能有效減少變量的數量，發掘出有代表性的主成分因子，故采取該分析方法對滋味物質作進一步探究，結果如表2所示。

表2 主成分載荷矩陣、貢獻率和累積貢獻率Table 2 Factor loading，contribution，and cumulative propor?tion obtained by PCA

由表2 可知，前3 個成分累積貢獻率達96.546%，基本綜合原始數據的信息，說明這3 個成分能反映22 個指標的絕大部分信息，故選取前3 個特征值進行主成分分析。主成分1（PC1）的特征值為14.605，方差貢獻率為66.387%，貢獻較大的為蛋白質、游離氨基酸、茶多酚、TB、TMUA、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、酯型兒茶素、兒茶素及嘌呤生物堿，其中以EGC、EGCG 與酯型兒茶素的貢獻最大，載荷值均為0.997。主成分2（PC2）的特征值為4.875，方差貢獻率為22.157%，貢獻較大的為GC、C，載荷值分別為0.841、0.891。主成分3（PC3）的特征值為1.760，方差貢獻率為8.002%，貢獻最大為花青素，載荷值為0.643。PC1和PC2 累積貢獻率達88.544%，反映了“紫脈龍韻”鮮葉品質的主要信息，因此，PC1 和PC2 的代表性成分指標對鮮葉呈味品質的影響起主要作用，結合這些代表性成分在不同嫩度鮮葉中的差異程度（表1），推測蛋白質、游離氨基酸、茶多酚、TB、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、GC 及C 是不同嫩度鮮葉間的關鍵差異成分。

以3 個主成分對應的方差相對貢獻率為權重，將不同嫩度鮮葉主成分得分和相應權重進行線性加權求和，計算不同嫩度鮮葉的綜合評價得分，得分越高，表示該嫩度鮮葉相對滋味品質越好。各主成分下的得分、綜合得分及綜合排名結果見表3。

由表3 可知，按綜合排序從高到低依次為一芽二葉＞一芽一葉＞一芽三葉＞一芽四葉＞一芽五葉。由此可見，一芽一葉與一芽二葉滋味品質較佳，更適合用于高檔“紫脈龍韻”苦茶茶葉的制備。研究結果可為不同檔次“紫脈龍韻”苦茶茶葉加工原料的選擇提供參考。

2.5 不同部位嘌呤生物堿含量差異分析

不同部位“紫脈龍韻”苦茶嘌呤生物堿含量差異見圖4。

圖4 不同部位嘌呤生物堿組分與含量Fig.4 Composition and content of purine alkaloids in different parts of tea plants

如圖4所示，TB 含量中單芽最高（6.17 mg/g），隨著葉位增加，TB 含量逐漸降低，第三葉、第四葉、第五葉與莖中TB 含量差異不顯著，花與果皮中未檢測到。不同部位中TMUA 含量均較低，且含量變化不大。從單芽到第四葉，TCR 含量逐漸升高，最高達17.12 mg/g，且不同部位芽葉中TCR 含量差異顯著（P＜0.05）。單芽、莖、花及果皮4 個部位中TCR 含量差異不顯著，含量在5.16～6.22 mg/g。第一葉中CAF 含量最高（34.15 mg/g），從第一葉開始，隨著葉位增加，咖啡堿含量呈現逐漸降低的趨勢，且不同葉位間咖啡堿含量差異顯著（P＜0.05），與陳林等[29]研究結果基本一致。花與果皮部位中咖啡堿含量極低，特別是果皮部位，幾乎檢測不到咖啡堿。不同葉位間嘌呤生物堿總含量變化情況與咖啡堿相同。總體來說，苦茶堿與咖啡堿是“紫脈龍韻”苦茶主要嘌呤生物堿，且不同部位兩者含量差異較大，莖、花與果皮中嘌呤生物堿組分含量相對較低。

3 討論與結論

茶多酚、生物堿、兒茶素、花青素等成分含量、組成比例的不同是茶湯滋味強度差異形成的重要因素。本研究通過單因素方差分析研究“紫脈龍韻”苦茶不同嫩度鮮葉中主要滋味品質成分含量，發現隨著鮮葉嫩度的降低，可溶性糖、蛋白質與茶多酚含量先升高后降低，游離氨基酸、EGC、EGCG、酯型兒茶素與嘌呤生物堿總含量降低，總黃酮及花青素含量呈波動性變化。相關性分析結果表明，各滋味品質成分之間存在一定的相關性。聚類分析把不同嫩度鮮葉分為一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉、一芽四葉、一芽五葉兩類，分類結果可用于指導“紫脈龍韻”苦茶鮮葉的分級采摘及加工。主成分分析得到3 個主成分，累積貢獻率達96.546%，結合單因素分析，推測蛋白質、游離氨基酸、茶多酚、TB、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、GC 及C 是不同嫩度鮮葉的關鍵差異成分。由不同嫩度鮮葉的綜合評價得分可知一芽一葉與一芽二葉滋味品質較佳，研究結果可為不同檔次“紫脈龍韻”苦茶茶葉加工原料的選擇提供參考。

茶葉具有獨特的營養價值和保健功能，但其利用率極低，除采其嫩芽制作成商品茶外，茶樹其他部位（老葉、花及果皮）往往被廢棄，造成了資源極大浪費。特別是特異茶樹品種，其老葉、花及果皮往往仍具有含量較高的功能成分。如果能將這些部位用于開發日用品、功能型飲品等深加工茶葉產品，可達到變廢為寶及提升茶產業經濟價值的作用。苦茶中苦茶堿含量相對較高，具有潛在的藥用價值。本研究通過檢測不同部位嘌呤生物堿含量，發現低葉位（嫩葉）中可可堿與咖啡堿含量較高，高葉位（成熟葉）具有高苦茶堿含量與低咖啡堿含量的特征，且果皮不含或僅含有極少量咖啡堿。由此可見，不同部位“紫脈龍韻”苦茶嘌呤生物堿組分分布及含量差異較大，可以根據需要選擇相應的部位作為原料，進行不同功能性產品的深加工，使“紫脈龍韻”苦茶除了嫩葉以外的其他部位得到充分利用，大幅度提升該品種的經濟價值。