南極磷蝦磷脂的組成及其抗氧化活性

劉小芳，郭向融，2，李爽，辛云，2，蔣永毅，冷凱良，姜維

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所農業農村部極地漁業可持續利用重點實驗室，山東青島 266071；2.浙江海洋大學國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；3.青島菲優特檢測有限公司，山東青島 266112）

受全球漁業資源衰退的影響，南極磷蝦作為可持續的漁業替代資源，近年來得到廣泛關注[1]。南極磷蝦生物量可達6.5～10億t，南極海洋生物資源養護委員會制定的謹慎性捕撈限額為561 萬t，而目前實際年捕撈量為20～40 萬t，因此，南極磷蝦資源的開發潛力巨大[2?3]。目前，國際南極磷蝦漁業已進入第二次快速發展期[2]，我國南極磷蝦漁業經過10 余年發展也已初具規模，集生態高效捕撈與船載工業化加工于一體、由陸基高附加值產品拉動的產業鏈基本形成[2?3]。南極磷蝦富含優質的蛋白質、脂質、幾丁質等成分[4?7]，是良好的營養健康食品和生物醫藥制品的生產原料，但目前精深加工產品僅有南極磷蝦油和南極磷蝦蛋白肽[1?2]，資源整體的高值化利用程度仍然不高，一定程度上限制了產業鏈的深度延伸和產業價值的有效提升。挖掘并明確南極磷蝦營養成分的活性作用，對于指導南極磷蝦高值產品開發和拓展產品應用領域十分必要。

磷脂是分子結構中結合有磷酸基團的極性脂質成分，其不僅是構成生物細胞膜的基礎物質，同時參與多種營養成分的消化、吸收和運輸過程，在調節機體的生理機能和代謝穩態中發揮至關重要的作用[8]。因磷脂抗氧化能力良好，其作為添加劑和營養補充劑已應用于食品、化妝品和功能制品等領域[9]。目前商品化生產的磷脂主要提取自大豆、卵黃等陸基食品原料，為滿足市場發展的需求，水產食品原料來源磷脂的開發在近年來備受關注[10?11]，從大黃魚魚卵[12]、鯖魚[13]、三文魚魚骨[14]、草魚頭[15]、近江牡蠣[16]中提取的磷脂陸續被證明抗氧化能力顯著。南極磷蝦的總脂含量豐富，磷脂占比達到總脂含量的40%左右[5，17?18]，是提取、生產磷脂的優質原料，但目前關于南極磷蝦磷脂的抗氧化活性鮮見報道。綜上，本研究以南極磷蝦油為原料進行南極磷蝦磷脂的分離純化，以大豆磷脂和卵黃磷脂為對照，對南極磷蝦磷脂的組成特征和抗氧化活性進行分析評價，旨在為南極磷蝦磷脂在抗氧化制品領域的應用提供數據支持，為南極磷蝦脂質類高值產品的定向開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦油：青島南極維康生物科技有限公司；大豆磷脂、卵黃磷脂（純度均≥90%）：北京索萊寶科技有限公司；玻璃層析柱（80 mm×500 mm）、薄層層析硅膠板（GF254）、柱層析硅膠（200～300 目）：青島勝海精細硅膠化工有限公司；37 種脂肪酸甲酯混標、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphati?dylethanolamine，PE）等標準品（純度均≥98%）、正己烷（色譜純）、異丙醇（色譜純）：默克生命科學有限公司；1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?diphenyl?2?picrylhy?drazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；2，2′?聯氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海麥克林生化科技股份有限公司；抗壞血酸：西隴化工股份有限公司；氯仿、丙酮、乙醚、硫酸：青島潤嵩化學科技有限公司；甲醇、乙醇、正己烷、乙酸、三氯乙酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲酸銨：國藥集團化學試劑有限公司。除特殊標記外，其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BAS 224S?CW 型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Neofuge 15R 高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；RE52AA 型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；MD 200 型氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司；LC?16 型液相色譜儀（配置Essentia ELSD?16 型蒸發光散射檢測器）：日本島津公司；HP 6890 型氣相色譜儀[配置氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID）]：美國安捷倫公司；ST 3100 型pH 計：奧斯豪儀器（常州）有限公司；HH?4 型數顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；UV 1102Ⅱ型紫外可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦磷脂分離純化

參考文獻[19]的方法進行分離純化，800 g 柱層析硅膠于110 ℃活化12 h，冷卻至室溫后，采用濕法裝柱，待硅膠沉降完全后，用氯仿進行壓柱，使層析柱中的硅膠裝填密實。用少量氯仿溶解30 g 南極磷蝦油，緩慢倒入層析柱中，使樣品與硅膠充分吸附，然后依次用20 倍柱體積的氯仿和丙酮進行洗脫，經薄層層析色譜[展開劑為正己烷∶乙醚∶乙酸=85∶15∶1（體積比），碘蒸氣顯色]確認中性脂和糖脂去除完全后，更換洗脫液為20 倍柱體積的甲醇，繼續洗脫，合并甲醇洗脫液，減壓濃縮得到南極磷蝦磷脂樣品12.65 g。

1.3.2 大豆磷脂及卵黃磷脂純化

參考文獻[19]的方法進行純化，大豆磷脂及卵黃磷脂采用20倍體積（體積質量比）經4 ℃預冷的丙酮反復洗滌3 次，收集丙酮不溶物，減壓濃縮去除殘留的有機溶劑，即得大豆磷脂和卵黃磷脂樣品。

1.3.3 磷脂含量測定

按照GB/T 5537—2008《糧油檢驗磷脂含量的測定》中的鉬藍比色法進行測定。

1.3.4 磷脂組成測定

參照文獻[17]的方法進行磷脂組成測定，適量分離純化得到的磷脂樣品，采用氯仿?甲醇溶液（2∶1，體積比）溶解，通過液相色譜法分析磷脂組成，不同磷脂組分經外標法定量后，分別計算各自在總磷脂中的比例。色譜條件：ZORBAX Rx?SIL 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；漂移管溫度60 ℃；霧化器壓力0.17 MPa；流動相A為正己烷∶異丙醇∶5 mmol/L 甲酸銨（82∶17∶1，體積比）；流動相B為異丙醇∶水∶5 mmol/L 甲酸銨（85∶14∶1，體積比）；梯度洗脫程序：0 min A 與B 體積比為100∶0，5 min A 與B體積比為80∶20，7 min A與B體積比為60∶40，17 min A與B 體積比為30∶70，23 min A 與B 體積比為0∶100，25 min A 與B 體積比為0∶100，26 min A 與B 體積比為100∶0，30 min 洗脫程序結束。在20～500 mg/L 濃度范圍內，以標準品質量濃度的對數值（X）為橫坐標，以相應峰面積的對數值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，其中，PC 定量方程為Y=1.118 8X+3.430 9，R2=0.998 7；PE 定量方程為Y=1.339 3X+2.786 2，R2=0.997 6。

1.3.5 脂肪酸組成測定

參照文獻[17]的方法進行脂肪酸組成測定，適量分離純化得到的磷脂樣品經甲酯化處理后，采用氣相色譜法測定脂肪酸組成，采用峰面積歸一化法進行定量分析。色譜條件：INNOWAX毛細管柱（0.32 mm×30 m，0.25μm），檢測器采用FID，載氣為氮氣；進樣口參數：進樣口溫度240 ℃，分流比15∶1，進樣量1μL；升溫程序：起始溫度170 ℃，以3 ℃/min升溫至210 ℃，保持30 min；FID 參數：檢測器溫度250 ℃，氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min，尾吹氮氣流速40 mL/min。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力測定

參照文獻[20]的方法進行測定，將5 mL 7 mmol/L ABTS 溶液與88 mL 25 mmol/L 過硫酸鉀溶液混合，室溫避光儲存12～16 h，采用乙醇稀釋至734 nm 處吸光值為0.70±0.02，配制成ABTS 試劑。0.15 mL 不同濃度的磷脂乙醇溶液與3.0 mL ABTS 試劑混合，室溫避光反應20 min，在734 nm波長下測定吸光值（A樣品），用等量乙醇代替ABTS試劑測定相應吸光值（A空白），等量乙醇代替磷脂溶液測定相應吸光值（A對照），ABTS+自由基清除率（S，%）計算公式如下。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻[12]的方法進行測定，不同濃度的磷脂乙醇溶液與等體積0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合，室溫避光反應20 min，在517 nm波長下測定吸光值（B樣品），用等量乙醇代替DPPH乙醇溶液測定相應吸光值（B空白），等量乙醇代替磷脂溶液測定相應吸光值（B對照），DPPH自由基清除率（R，%）計算公式如下。

1.3.8 還原能力測定

參照文獻[15]的方法進行測定，1 mL 不同濃度的磷脂乙醇溶液，加入1 mL 超純水和1 mL 0.1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴避光反應20 min，快速冷卻至室溫后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應，5 000 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液加入1 mL 超純水和500 μL 0.1%氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，于700 nm 波長下測定吸光值（C樣品），用0.05 mg/mL 抗壞血酸溶液代替磷脂樣品測定相應吸光值（C對照），以磷脂樣品可達到抗壞血酸還原效果的程度表征其還原能力，還原能力（Q，%）計算公式如下。

1.4 數據處理

結果以平均值±標準偏差的形式表示，采用Excel 2016、IBM SPSS 27.0、Origin 2018 軟件進行數據處理和圖形繪制。采用單因素方差分析進行組間多重比較，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦磷脂的組成特征

硅膠柱層析法是分離純化制備高純度磷脂的經典方法，氯仿?丙酮?甲醇依次洗脫是最常用的一種洗脫體系[10，21]。南極磷蝦磷脂的組成、薄層層析色譜、脂肪酸組成分別如表1、圖1、表2所示。

圖1 南極磷蝦磷脂的薄層層析色譜Fig.1 Thin layer chromatography of phospholipids from Antarctic krill

表1 南極磷蝦磷脂的組成Table 1 Composition of phospholipids from Antarctic krill

表2 南極磷蝦磷脂的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of phospholipids from Antarctic krill

由表1和圖1可知，經硅膠柱層析純化后得到的南極磷蝦磷脂純度較高，其磷脂含量達到（93.78±3.18）g/100 g。南極磷蝦磷脂主要為PC，含有少量的PE，分別占總磷脂的（90.60±1.03）%和（5.08±1.10）%，這與卵黃磷脂的磷脂組成較為相似，而與大豆磷脂的磷脂組成差異顯著（P＜0.05）。由表2 可知，南極磷蝦磷脂中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6）的含量豐富，分別占總脂肪酸含量的（31.75±0.24）%和（19.35±0.10）%，這與大豆磷脂富含亞油酸（C18∶2）和棕櫚酸（C16∶0）、卵黃磷脂富含棕櫚酸（C16∶0）和油酸（C18∶1）的脂肪酸組成特征明顯不同，以上研究結果與已有文獻報道一致[5，17，19，22]。綜合磷脂組成和磷脂脂肪酸組成結果可知，南極磷蝦磷脂是典型的海洋EPA/DHA 磷脂。已有研究指出，與大豆磷脂和卵黃磷脂等陸基食品原料來源磷脂相比，海洋EPA/DHA 磷脂的功能活性更優[23]。目前，大豆磷脂和卵黃磷脂已作為抗氧化劑被廣泛使用[9]，南極磷蝦磷脂在抗氧化方面的作用效果值得研究。

2.2 南極磷蝦磷脂的ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除能力是評估抗氧化劑活性強弱的常用方法之一。ABTS在氧化劑作用下被氧化生成綠色的ABTS+自由基，抗氧化劑可抑制ABTS+自由基的產生[24]。南極磷蝦磷脂的ABTS+自由基清除能力見圖2。

圖2 南極磷蝦磷脂的ABTS+自由基清除能力Fig.2 ABTS+free radical scavenging ability of phospholipids from Antarctic krill

由圖2可知，南極磷蝦磷脂在10～50 mg/mL濃度范圍內，ABTS+自由基清除率為（32.30±2.27）%～（98.70±0.58）%；隨著磷脂濃度的升高，ABTS+自由基清除活性明顯增強，并呈現濃度依賴效應。與已有報道的鯖魚肌肉磷脂（濃度100 mg/mL時ABTS+自由基清除率約為90%）[13]、三文魚魚骨磷脂（濃度100 mg/mL 時ABTS+自由基清除率為55.60%）[14]相比，南極磷蝦磷脂具有更強的ABTS+自由基清除能力。經計算，南極磷蝦磷脂清除ABTS+自由基的IC50值為15.78 mg/mL，低于南極磷蝦油（IC50值17.84 mg/mL）、大豆磷脂（IC50值30.42 mg/mL）和卵黃磷脂（IC50值31.36 mg/mL）。南極磷蝦磷脂清除ABTS+自由基的效果顯著優于大豆磷脂和卵黃磷脂（P＜0.05）。綜上可知，南極磷蝦磷脂具有良好的ABTS+自由基清除能力。

2.3 南極磷蝦磷脂的DPPH自由基清除能力

DPPH 自由基是一種以氮為中心較穩定的自由基，其溶于乙醇后呈藍紫色，與抗氧化劑相互作用后顏色變淡，通過顏色變化程度可判斷抗氧化劑活性的強弱[24]。南極磷蝦磷脂的DPPH自由基清除能力見圖3。

圖3 南極磷蝦磷脂的DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of phospholipids from Antarctic krill

由圖3可知，南極磷蝦磷脂在10～50 mg/mL濃度范圍內，DPPH 自由基清除率為（36.14±1.32）%～（91.33±0.67）%；隨著磷脂濃度的升高，DPPH自由基清除活性明顯增強，并呈現濃度依賴效應。南極磷蝦磷脂清除DPPH自由基的能力強于鯖魚肌肉磷脂（濃度100 mg/mL時DPPH自由基清除率約為50%）[13]和三文魚魚骨磷脂（濃度100 mg/mL時DPPH自由基清除率為75.48%）[14]，但弱于大黃魚魚卵磷脂（濃度20 μg/mL 時DPPH 自由基清除率為47.80%）[12]。經計算，南極磷蝦磷脂清除DPPH 自由基的IC50值為14.87 mg/mL，低于卵黃磷脂（IC50值15.07 mg/mL）、南極磷蝦油（IC50值20.27 mg/mL）和大豆磷脂（IC50值24.21 mg/mL）。南極磷蝦磷脂清除DPPH 自由基的作用效果與卵黃磷脂相近，明顯優于大豆磷脂。綜上可知，南極磷蝦磷脂具有良好的DPPH自由基清除能力。

2.4 南極磷蝦磷脂的還原能力

鐵氰化鉀與抗氧化劑混合后被還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀進一步與鐵離子發生反應生成普魯士藍，其在700 nm 波長處有較大的吸收，吸光值越大則抗氧化劑的還原能力越強[15，25]。南極磷蝦磷脂的還原能力見圖4。

圖4 南極磷蝦磷脂的還原能力Fig.4 Reducing capacity of phospholipids from Antarctic krill

由圖4可知，南極磷蝦磷脂在10～50 mg/mL濃度范圍內，其還原能力相當于抗壞血酸對照溶液還原能力的（25.88±0.59）%～（56.54±0.61）%；隨著磷脂濃度的升高，還原能力明顯增強，并呈現濃度依賴效應。南極磷蝦磷脂的還原能力弱于南極磷蝦油，推測這可能與南極磷蝦油中含有蝦青素[5]，而柱層析洗脫時極性較低的蝦青素已與極性較高的磷脂實現分離有關。南極磷蝦磷脂的還原能力明顯優于大豆磷脂和卵黃磷脂，這與岳大鵬等[15]發現從草魚頭提取的海洋磷脂還原能力顯著優于大豆磷脂的結果一致。綜上可知，南極磷蝦磷脂具有良好的還原能力。

3 結論

本研究采用柱層析法分離制備南極磷蝦磷脂，并對其組成特征和抗氧化活性進行分析評價。組成分析結果表明：南極磷蝦磷脂以PC 為主，含有少量PE；富含多不飽和脂肪酸，且主要為EPA 和DHA；南極磷蝦磷脂是典型的海洋EPA/DHA 磷脂。抗氧化活性評價結果表明：南極磷蝦磷脂具有良好的ABTS+自由基和DPPH 自由基清除能力以及還原能力，且其作用效果明顯優于大豆磷脂和卵黃磷脂。不同來源磷脂的抗氧化活性差異明顯，推測這與各磷脂中不同磷脂組分的比例、結合的多不飽和脂肪酸總量等存在差異有關。南極磷蝦磷脂在抗氧化制品領域具有良好的應用前景，未來研究可關注其在生物體內發揮抗氧化的作用效果及內在機制。本研究對于指導南極磷蝦高值產品開發以及支撐加工產業鏈深度延伸具有積極意義。