兒童腦脊液陽性菌株分布及耐藥分析

賈靜,郭明發(fā),徐璐,楊俊文,周娟娟,楊俊梅

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院 a.檢驗科;b.血液腫瘤科,河南 鄭州 450003)

化膿性腦膜炎是兒童常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,腦脊液培養(yǎng)鑒定及藥敏是其診斷與治療的基石[1]。不同病原菌影響患兒臨床特征與預(yù)后,約1/3的幸存者有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]。近年來,多重耐藥病原菌檢出率在兒科臨床逐漸增多[3]。為加強細(xì)菌耐藥監(jiān)測管理,獲取可靠的耐藥數(shù)據(jù)指導(dǎo)臨床經(jīng)驗性抗菌藥物的使用,本文回顧性分析腦脊液陽性病原菌分布情況及常用抗生素的耐藥性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源

收集鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2017年1月至2021年12月腦脊液培養(yǎng)陽性標(biāo)本,送檢患兒308例,培養(yǎng)陽性菌株共計314株,剔除同一患者分離的重復(fù)菌株,其中有6例患兒同時檢出2種不同菌株。出院臨床診斷顯示原發(fā)性腦膜炎272例;術(shù)后繼發(fā)性感染36例。腦脊液樣本采集后直接注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)送檢。嚴(yán)格按照第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[4]規(guī)定和各儀器相關(guān)操作說明書進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2儀器與試劑

BD血培養(yǎng)儀(兒童需氧、厭氧培養(yǎng)瓶)及鳳凰100全自動細(xì)菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng)(Phoenix 100,美國BD公司)、VIKET-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏儀及其配套藥敏卡(法國生物梅里埃公司),MALDI Biotyper系統(tǒng)(德國Bruker公司)及配套的試劑盒靶板購自德國Bruker公司和美國Sigma公司;哥倫比亞瓊脂、伊紅亞甲藍(lán)瓊脂、麥康凱瓊脂、Mueller-Hinton瓊脂、5%脫纖維羊血MH瓊脂、巧克力瓊脂、流感嗜血桿菌屬藥敏培養(yǎng)基加SR0158營養(yǎng)補充劑等實驗中所用到的培養(yǎng)基和藥敏紙片均為英國OXOID公司產(chǎn)品;青霉素、萬古霉素和美羅培南E-test試紙條為鄭州安圖生物工程有限公司產(chǎn)品;革蘭染色液(快速法)、抗酸染色液(冷染法)、墨汁莢膜染色液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;同時以肺炎鏈球菌ATCC49619、金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、流感嗜血菌ATCC49247、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控對照菌株。

1.2 方法

1.2.1腦脊液涂片檢查

所有收集臨床樣本直接進(jìn)行墨汁染色、革蘭染色、抗酸染色檢查。染色過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書中相關(guān)操作說明進(jìn)行。

1.2.2分離培養(yǎng)

將腦脊液注入兒童需氧、厭氧培養(yǎng)瓶,放入血培養(yǎng)儀中培養(yǎng),待儀器報警后將標(biāo)本轉(zhuǎn)種在血平皿、巧克力平皿,置35 ℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜,18～24 h后觀察結(jié)果,孵育后取純菌進(jìn)行儀器鑒定。

1.2.3細(xì)菌鑒定及藥敏試驗

收集菌株采用Phoenix 100和MALDI Biotyper系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定,鑒定到種。革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌主要應(yīng)用VITEK-2 Compact和Phoenix 100全自動微生物鑒定儀進(jìn)行藥敏試驗。嗜血桿菌采用紙片擴散法,鏈球菌除青霉素、美羅培南及頭孢曲松應(yīng)用E-test試紙條(藥敏結(jié)果按照腦脊液藥敏試驗進(jìn)行判讀),其余藥敏仍可自動化分析(Phoenix 100鑒定系統(tǒng));所有藥敏結(jié)果參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會[5]推薦的藥敏試驗方法及折點標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用WHONET 5.6軟件對2017—2021年數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性耐藥分析,菌種分布、耐藥率以及細(xì)菌敏感率采用百分率表示;應(yīng)用SPSS 21.0軟件對不同分組之間耐藥率進(jìn)行比較,組間比較采用χ2檢驗,多組間兩兩比較采用Bonferroni法校正,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 涂片結(jié)果

革蘭染色檢出陽性球菌8例,直接墨汁莢膜染色2例,抗酸染色陽性0例。

2.2 腦脊液病原菌分布情況

314株病原菌中革蘭陽性菌204株(65.0%),革蘭陰性菌106株(33.8%),真菌4株(1.3%)。具體分布見表1。

表1 腦脊液常見病原菌年份分布[n(%)]

腦脊液檢出菌,以二、三季度檢出為主,占62.4%,見圖1;年齡分布顯示嬰兒組46.8%最多,其次新生兒組24.8%。見表2。

2017年第一季度腦脊液分離菌株“0”。

表2 腦脊液分離菌患兒年齡分布[n(%)]

2.3 革蘭陽性菌藥敏分析

314株病原菌其中葡萄球菌屬未發(fā)現(xiàn)萬古霉素、利奈唑胺耐藥菌株;肺炎鏈球菌對青霉素耐藥檢出16株(占88.9%),未發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥菌株。見表3。

表3 主要革蘭陽性菌常用抗生素耐藥分析[n(%)]

2.4 革蘭陰性菌藥敏分析

314株分離菌革蘭陰性菌以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主,常用抗生素耐藥率見表4。

表4 主要革蘭陰性菌常用抗生素耐藥率分析[n(%)]

本研究分離314株菌株,其中多重耐藥菌149株,各年齡組之間、性別之間、年份之間多重耐藥發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同科室之間多重耐藥的發(fā)生率存在差異,外科監(jiān)護(hù)室的多重耐藥率最高,但與早產(chǎn)兒科、神經(jīng)外科、新生兒內(nèi)科、內(nèi)科監(jiān)護(hù)室的多重耐藥發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,神經(jīng)內(nèi)科多重耐藥發(fā)生率低于外科監(jiān)護(hù)室與神經(jīng)外科(P<0.05)。見表5。

表5 2017—2021年多重耐藥菌株流行病學(xué)分析(n,%)

3 討論

化膿性腦膜炎起病急,治療困難。世界衛(wèi)生組織研究顯示,腦膜炎每年在全世界造成25萬人死亡,其中大多數(shù)涉及兒童[6]。國內(nèi)兒童腦膜炎的發(fā)病率為(6.95～22.30)/10萬,由于抗菌藥物的過度使用,病原菌的耐藥性是一個全球性公共衛(wèi)生問題[7-8],不同國家地區(qū)、不同年代以及不同年齡段腦脊液病原菌分離可能有所差異。

本研究收集腦脊液病原菌314株,主要以凝固酶陰性葡萄球菌為主,其占比為29.3%(92/314),這與北京兒童醫(yī)院報道[9]一致。孫鑫曄等[10]研究顯示腦脊液培養(yǎng)出的凝固酶陰性葡萄球菌80%屬于污染,因此臨床在判斷腦脊液感染時要根據(jù)患兒臨床癥狀及其他結(jié)果綜合判斷。此次收集病例經(jīng)查詢出院臨床診斷均提示化膿性腦膜炎感染,其中診斷原發(fā)性腦膜炎272例,術(shù)后繼發(fā)性腦膜炎36例;腦脊液直接涂片陽性檢出率較低可能與腦脊液采集標(biāo)本量較少有關(guān)。本研究顯示兒童腦膜炎二、三季度更常見,年齡主要集中在嬰兒與新生兒期,患兒主要來自神經(jīng)外科和新生兒內(nèi)科,提示要重視低年齡患兒腦脊液培養(yǎng),外科手術(shù)后應(yīng)注意術(shù)后護(hù)理,避免術(shù)后感染[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)鏈球菌感染引起的兒童化膿性腦膜炎與2012年之前有所增加,檢出肺炎鏈球菌18株、無乳鏈球菌8株。肺炎鏈球菌引起的化膿性腦膜炎屬于侵襲性腦膜炎,常發(fā)生于兒童等免疫力低下的人群中。2017年我國引進(jìn)了針對肺炎鏈球菌的13價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗,但被列為Ⅱ類疫苗,并未強制注射[12],提高此種疫苗的覆蓋率可能對降低肺炎鏈球菌的感染率有幫助。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)引起的化膿性腦膜炎目前國內(nèi)報道較少,它主要引起早產(chǎn)兒、新生兒腦膜炎,一般由母體傳播,重癥預(yù)后差。本研究顯示腦脊液每年都有Lm的檢出,Lm引起的化膿性腦膜炎應(yīng)受重視,對于早產(chǎn)兒、新生兒患兒要了解其母親健康狀況,及早作出診斷,提高重癥患兒治愈率。314株腦脊液病原菌革蘭陰性菌以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主,占10.2%(32/314)、6.7%(21/314),這與趙靜麗等[13]研究一致,而成人化膿性腦膜炎革蘭陰性菌以鮑曼不動桿菌感染最常見[11],提示兒童化膿性腦膜炎革蘭陰性菌感染與成人可能有一定的差異性。

本次研究藥敏結(jié)果顯示,多重耐藥菌占47.5%(149/314),年齡主要分布在1歲以內(nèi)患兒,但耐藥率在不同年齡組、不同性別、不同年份之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,不同科室之間多重耐藥率的差異可能與患兒類型有關(guān)。耐藥菌株中檢出MRCNS,占46.3%(69/149),MRSA檢出3株,MRSA檢出率低于MRCNS,未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺耐藥的葡萄球菌,因此這些藥物仍然是治療葡萄球菌感染的有效手段[11]。其中利奈唑胺是新型惡唑烷酮類抗菌藥物,具有組織穿透性強、腦脊液濃度高等特點,為臨床治療耐藥及難治性葡萄球菌所致的兒童化膿性腦膜炎提供了新的選擇[14]。肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素耐藥率達(dá)100%,可能因兒科常經(jīng)驗應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,致使紅霉素耐藥率較高;青霉素耐藥率達(dá)88.9%,青霉素顯然已經(jīng)不是肺炎鏈球菌腦膜炎的首選藥物[15],藥敏結(jié)果顯示頭孢噻肟敏感性較高。革蘭陰性菌中大腸埃希菌對美羅培南和亞胺培南耐藥率為3.2%,但對三代頭孢類抗生素耐藥率較高,檢出ESBLs菌18株,這可能與臨床經(jīng)驗應(yīng)用三代頭孢類抗生素有關(guān)。藥敏研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌對阿米卡星全敏感,但阿米卡星對于兒童副作用較多,可引起耳毒性、腎毒性,限制其臨床應(yīng)用。肺炎克雷伯菌檢出CRE 17株,陳玥等[16]研究中提到成人碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)腦膜炎可選藥物有限且療程較長;國內(nèi)報道主要采用以替加環(huán)素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥方案,朱錢迎等[17]研究中提到替加環(huán)素在藥物通透性及抗菌活性方面極佳,從而有效清除CRKP,用藥過程中細(xì)菌不易發(fā)生耐藥情況,而替加環(huán)素是兒童禁用藥,所以兒童CRKP的產(chǎn)生增加了臨床治療難度。美國傳染病學(xué)會推薦CRKP腦膜炎的治療,靜脈用藥可以選擇高劑量美羅培南、多黏菌素B或E[18]。因此,兒童CRKP腦膜炎時臨床醫(yī)生可考慮聯(lián)合用藥替代單一用藥。研究顯示編碼碳青霉烯酶的基因絕大部分位于質(zhì)粒或其他可轉(zhuǎn)移的遺傳元件上,使其能在同種或不同菌種間水平傳播,引起院內(nèi)感染的爆發(fā)流行[19],所以對于多重耐藥菌株感染患兒要加強管理,及時隔離治療,避免發(fā)生院內(nèi)感染。

4 結(jié)論

腦脊液感染患兒年齡主要集中在1歲以內(nèi),引起感染的革蘭陰性菌以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主,且ESBLS及CRE菌株較常見,因此要重視腦脊液病原菌的分離培養(yǎng),關(guān)注耐藥菌株的流行趨勢,為臨床經(jīng)驗治療提供依據(jù)。本研究為單中心研究,也存在不足之處,未考慮環(huán)境、地域因素,學(xué)齡前組與學(xué)齡組納入研究對象相對較少,是否能全面反映不同年齡組以及不同科室之間分離菌株特點尚需更大樣本量驗證。