超高效液相色譜-串聯質譜法測定水質中多肽類抗生素

吳慶陽

（必維申美商品檢測有限公司，上海 201108）

引言

多肽類抗生素指具有多肽結構，即三個及以上氨基酸分子脫水縮合結構，一小部分肽類抗生素呈線狀的，其余大多是環狀化合物。在多肽類抗生素中，不同的抗生素所具有的抗菌作用不同，可分別對抗真菌、病毒、細菌等的感染，可治療一些炎癥和感染。通常使用小劑量來抑菌，使用大劑量來殺菌。使用多肽類抗生素，細菌不易產生耐藥性，但是其毒性較大，主要會引起神經毒性和腎毒性，且不易被來自動植物體內的酶所水解。多肽類抗生素主要以原藥、代謝產物等形式排出體外，然后通過生活污水、農業糞肥、養殖和制藥企業廢水等方式進入環境水體。近年來，在國內外的不同環境水體中均檢出抗生素，這些殘留的抗生素嚴重危害了生態系統，并可能在環境和生物體中累積或者通過食物鏈富集，使細菌產生抗生素抗性基因，嚴重威脅人類健康。進入環境水體的多肽類抗生素多以痕量濃度存在，且種類多、性質差別大，所以檢測這些抗生素的難度也比較大，目前幾乎沒有水質中多肽類抗生素的檢測方法。本研究擬采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）同時測定水質中11種多肽類抗生素，并利用固相萃取柱對樣品進行萃取凈化，從而實現對水質中多肽類抗生素的靈敏、快速、準確的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜串聯質譜儀，UPLC-Xevo TQ-S串聯質譜，沃特世公司；渦輪混合器，QT-1，琪特公司；氮吹儀，TM112，聯合公司；自動固相萃取儀，Fotector plus 60，含大體積進樣裝置，睿科公司；電子天平，XS105DU，梅特勒-托利多公司。

去甲萬古霉素、萬古霉素、粘桿菌素B、粘桿菌素A、桿菌肽B、桿菌肽A、恩拉霉素B、恩拉霉素A、太古霉素、維吉尼亞霉素M1、維吉尼亞霉素S1，Dr.E公司；乙腈、甲醇、甲酸和丙酮（色譜純），飛世爾公司；鹽酸（優級純），黙克公司；固相萃取柱，Oasis HLB柱（6 mL/500 mg），沃特世公司；Na2EDTA（分析純），國藥公司；0.45 μm、0.22 μm濾膜，沃特世公司。

1.2 標準溶液的制備

1.2.1 標準儲備溶液

1 000 mg/L的單標儲備液：分別稱取11種多肽類抗生素各標準品適量（標準物質的濃度折算后各抗生素的質量為10.0 mg），移入10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解抗生素和定容，配制成單個抗生素的標準儲備液。

10 mg/L混合標準溶液：用1 mL移液槍分別準確移取11種多肽類抗生素單標儲備液1 mL于同一個100 mL的容量瓶中，用0.1%的甲酸甲醇溶液定容至刻度。

1.2.2 標準曲線的配制

根據實驗需要，標準曲線濃度點分別為0、2、5、10、20、50、100、200 μg/L，移取適量的10 mg/L混合標準溶液于容量瓶中，初始流動相定容。

1.3 樣品前處理

準確移取經過0.45 μm微孔濾膜過濾后的水樣1 000 mL，加入0.5 g的Na2EDTA，用超聲振蕩使其溶解，再用1 mol/L的鹽酸調節pH值為3.0，備用；上樣前，依次用10 mL甲醇、5 mL超純水和5 mL的0.1%甲酸水溶液活化HLB柱；然后以8 mL/min流速抽取水樣，經HLB柱收集目標物；用12 mL超純水淋洗小柱，氣推后依次用5 mL的0.1%甲酸甲醇和5 mL的甲醇以1 mL/min速率洗脫。收集的洗脫液在45 ℃下用氮氣吹干，加初始比例流動相1 mL復溶，混勻，然后使用0.22 μm的濾膜過濾，并使用UPLC-MS/MS測試濾液。

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1.4 試驗方法

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18，規格2.1×100 mm，1.7 μm，流速300 μL/min，柱溫：35 ℃，進樣量：1 μL，0.1%甲酸水溶液作為水相流動相，0.1%甲酸乙腈作為有機相流動相；梯度洗脫條件如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4.2 質譜分析條件

離子源參數：ESI+離子源，電離源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為500 ℃，脫溶劑氣流流速為1 000 L/h，錐孔氣流速為150 L/h，毛細管電離電壓為2.5 kV，用質譜多反應監測掃描，離子對等質譜參數如表2所示。

表2 定量定性離子質譜參數

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

2.1.1 水樣pH值的選擇

由于多肽類抗生素會與多種金屬離子螯合，形成沉淀，所以在水樣中加入Na2EDTA后，因為EDTA與金屬離子的配位能力更強，可以通過螯合作用釋放出多肽類抗生素，消除部分離子的抑制作用，有效降低了雜質的影響[1]，提高了測定的回收率，但pH值影響了金屬離子與EDTA的配位。另外，大多數多肽類抗生素都含有氨基、羥基和羧基，顯弱堿性，在弱酸性條件下比較穩定，需調節水樣的pH值。因此，需要通過實驗來考察pH值對多肽類抗生素測試的影響。

移取1 000 mL空白水樣5份，加入適量多肽類抗生素混合標準溶液，配置抗生素濃度均為100 ng/L的加標試樣，用0.1 mol/L鹽酸溶液調節5份樣品的pH值分別為2、3、4、5、6，其他條件不變，進行UPLC-MS/MS測定。測試結果表明各種多肽類抗生素的提取效率有顯著差異。當pH值為6及以上時，多肽類抗生素回收率明顯降低。當pH=3時，多肽類抗生素綜合回收率為最佳。因此，選擇pH=3時的水樣進行HLB柱萃取凈化。

2.1.2 HLB柱的選擇

多肽類抗生素幾乎都為極性物質，目前大多數文獻中，多肽類抗生素測定都推薦使用HLB固相萃取柱。HLB固相萃取柱采用反相保留機理，吸附劑由親水性物質和親脂性物質兩種單體按比例聚合而成，通過聚合物上的亞氨基加強對極性物質的保留，同時具有很好的水浸潤性，故此類化合物在HLB具有較好的疏水相互作用，可基于反相作用原理得以保留，而且HLB柱的凈化效果較之C18、混合型萃取柱有更好的回收和更強的除雜能力[2]。對于大體積樣品，采用體積容量較大的6 mL/500 mg型Oasis HLB柱，可避免堵死HLB小柱現象，且能夠節約時間。實驗結果表明，采用HLB柱萃取凈化，多肽類抗生素的回收率較高，且重復性好。

2.1.3 洗脫液的選擇

選擇甲醇、乙腈和丙酮三種試劑進行洗脫效果比較，結果表明，丙酮及乙腈僅對部分抗生素的洗脫效果好，對其余部分抗生素的洗脫效果不好；而甲醇對多肽類抗生素的洗脫能力較為平均，對多肽類抗生素的綜合回收率較高，且基質效應少，故選擇甲醇為洗脫溶劑。同時也對甲醇的洗脫體積進行了考察，實驗結果表明，當洗脫體積大于10 mL后，多肽類抗生素的回收率無明顯提高，同時通過實驗發現，使用5 mL、0.1%的甲酸甲醇代替5 mL的甲醇洗脫，多肽類抗生素的回收率更佳，洗脫液選擇5 mL、0.1%的甲酸甲醇和5 mL的甲醇。

2.1.4 氮吹溫度的選擇

HLB柱萃取凈化后，通常需對目標化合物的洗脫液進行濃縮，以提高試樣的富集倍數和測量的靈敏度。氮吹是常用的方法，該方法所需儀器操作簡單，可批量處理樣品，在測試中得到廣泛運用。然而，氮吹過程中通常需要對溶液進行加熱，以縮短濃縮時間，提高分析通量。但若加熱溫度過高，則可能引起熱穩定性差的組分分解。因此，需要通過實驗來考察氮吹溫度對多肽類抗生素測試的影響。

移取1 000 mL的空白水樣4份，加入適量多肽類抗生素混合標準溶液，得到4份多肽類抗生素含量均為100 ng/L的加標試樣。經前處理及HLB柱萃取凈化后，洗脫液分別于25 ℃、35℃、45 ℃、55 ℃進行氮吹至干，用初始流動相溶解并定容至1 mL，進樣1 μL，進行UPLC-MS/MS上機測定。實驗結果表明，在4種不同氮吹溫度下，多肽類抗生素回收率溫度的升高，呈現出先基本穩定后下降的趨勢。氮吹溫度為45 ℃時，得到的多肽類抗生素的回收率與25 ℃和35 ℃氮吹相近，但是考慮到25 ℃和35 ℃氮吹條件下，氮吹時間過長，影響實驗效率；而當溫度升高至55℃時，樣品中的有些抗生素回收率明顯下降，提示可能發生降解。因此，選擇45 ℃作為最佳氮吹溫度。

2.2 色譜-質譜分析方法的優化

2.2.1 色譜條件的優化

由于各種多肽類抗生素在水、甲醇和乙腈中的溶解度不同，相對而言，甲醇總體上的溶解度特性優于乙腈，能完全溶解更多類型的樣品，但甲醇比乙腈更粘稠，會產生更高的柱壓，且乙腈比甲醇有更高的洗脫能力，乙腈流動相的峰形更窄，分離度更高。在流動相中添加0.1%的甲酸，以增大多肽類抗生素在質譜中母離子的信號，同時甲酸可以使色譜柱內的硅膠硅醇基質子化，從而減弱了硅醇基與待測物的相互作用，減少了色譜峰拖尾，使得色譜峰的峰形更佳[3]。實驗結果表明，相比甲醇，采用乙腈作為有機相時，11種多肽類抗生素的響應均較高。因此，流動相為0.1%的甲酸乙腈和0.1%的甲酸水溶液。

2.2.2 質譜條件的優化

多肽類抗生素是由氨基酸縮合而成的肽類物質，與高等動植物中具有激素功能的多肽和蛋白質不同，分子量比一般蛋白質小得多，幾乎都在300～3 000間，平均在1 000左右，在進入一級質譜后易結合H+，從而產生帶正電的單電荷離子或多電荷離子，所以適合于使用ESI正模式離子源。在實驗過程中，應向儀器中注入100 μg/L的待測物混標在正離子條件下進行全掃描，選擇響應值較高的離子作為母離子，并優化錐孔電壓，使母離子能夠達到最高的響應強度，同理進行二級掃描，以優化碰撞電壓。在確定子離子對，其他一些儀器參數采用的是儀器推薦值。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線、線性范圍和檢出限

按1.2.2所述，配制多肽類抗生素曲線，使用UPLC-MSMS進行分析。橫坐標為多肽類抗生素各濃度點，縱坐標為色譜峰面積，建立各個抗生素標準工作曲線。多肽類抗生素線性方程和線性相關系數r2見表3。在2～200 μg/L的濃度范圍內，11種多肽類抗生素標準曲線線性良好，其線性相關系數r2均大于0.998。移取1 000 mL的空白水樣7份，加入多肽類抗生素混合標準溶液適量，得到7份多肽類抗生素含量均為1ng/L的加標試樣。按照1.3樣品前處理和1.4儀器工作條件進行分析，計算7份加標樣品結果的標準偏差，其標準偏差的3.14倍值即為檢出限。實驗結果表明：11種多肽類抗生素檢出限介于0.38～0.89 ng／L之間，均小于1 ng/L，故在標準曲線濃度范圍內，多肽類抗生素線性關系良好，檢出限都能滿足現行測試的需求。

表3 平均加標回收率和RSD、標準曲線回歸方程、相關系數r2

2.3.2 方法準確度和精密度

通過對水樣中多肽類抗生素低、中、高濃度水平下的加標測試，計算平均回收率，對多肽類抗生素測試方法的準確度進行考察，并計算同濃度水平加標回收率間的相對標準偏差（RSD），對多肽類抗生素測試方法的精密度進行考察。移取1 000 mL空白水樣為一份樣品，共19份，一份作為基質樣品，在其余樣品中分別加入不同體積的多肽類抗生素高濃度標準液，配制成加標水平分別為高、中、低濃度的加標樣品，6個平行樣品一個濃度水平進行實驗，按照實驗部分的前處理方法對樣品進行前處理操作，使用優化好儀器條件的UPLC-MSMS測試樣品。11中多肽類抗生素同濃度水平間平均回收率和RSD結果見表3。由表3可見，在加標濃度為2、50、200 ng/L下，平均加標回收率在77.7%～98.1%之間，RSD在1.5%～14.2%之間，表明測試方法的精密度和準確度很好，都能夠滿足水質中測試11種多肽類抗生素含量的測試要求。

2.4 實際樣品測定

為了考察該測試方法的適用性，采集了紡織企業廢水、制藥企業廢水、養殖企業廢水、地下水、地表水和生活飲用水共48個樣品。按照測試方法的分析步驟測定11種多肽類抗生素含量，同時進行樣品加標實驗。結果顯示，除了一家養殖企業廢水中多粘菌素B有檢出（為3.12 ng/L）外，其他紡織企業廢水、制藥企業廢水、地表水、地下水和生活飲用水樣品中均未檢出多肽類抗生素，且48個樣品的加標回收率均滿足70%～120%之間，符合實際樣品測試多肽類抗生素的要求。

3 結論

本方法選擇UPLC-MS/MS進行水質中多肽類抗生素的測定，該儀器比常用的HPLC-MS/MS擁有更高的靈敏度和分辨率，以及更短的出峰時間和更高效的采集效率。通過實驗優選水樣的pH值和固相萃取柱。在流動相的選擇中，選用了使多肽類抗生素在質譜中更易于質子化的0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相。對二級質譜的定量離子和定性離子進行了優選，在此基礎上，對UPLC-MS/MS的方法學進行驗證，結果表明，11種多肽類抗生素標準曲線的線性關系良好，相關系數r2均大于0.998。檢出限均小于1 ng/L，加標回收率在77.7%～98.1%之間，RSD在1.5%～14.2%之間。將已建立的方法應用于不同類型的48個水樣測試，其中一個樣品檢出3.12 ng/L加標多粘菌素B，48個樣品的加標回收率均在70%～120%間。因此，所建立的水質中多肽類抗生素的固相萃取UPLC-MS/MS測定方法，具有適用基質廣泛，前處理方法相對簡單，方法靈敏度高，檢出限低，準確度高，重復性好等優點，適用于大規模樣品的測試。