淫羊藿素聯合嗎啡對骨癌痛小鼠的鎮痛效應研究*

楊雪偉 袁賢達 田 越 孫琳琳 蔡 捷 孟 坤△ 邢國剛△

（1 北京大學神經科學研究所，北京大學基礎醫學院神經生物學系，教育部/衛健委神經科學重點實驗室，北京100191；2 北京盛諾基醫藥科技股份有限公司，北京 102206；3 北京大學第一醫院內分泌科，北京 100034）

骨癌痛(bone cancer pain, BCP)是一種嚴重的慢性疼痛，通常由原發性骨癌或骨轉移所引起[1]。當原發腫瘤發展到中晚期時，癌細胞侵襲骨組織并破壞骨結構，會引發劇烈的骨癌痛[2]。許多腫瘤晚期會出現骨轉移，特別是乳腺癌和前列腺癌[3]，骨轉移導致的骨骼弱化，進而引發嚴重的骨癌痛[4]。約80%的癌癥病人在疾病晚期會經歷癌痛[5]，骨癌痛是晚期癌癥病人最常見的慢性疼痛類型之一[6]，嚴重影響病人的日常功能和生活質量[7]。正確的癌痛治療可以顯著提高病人對治療的耐受性，改善生活質量[8]。目前研究表明，骨癌痛的機制包括傷害性和神經性成分，涉及外周、中樞和神經膠質調節以及破骨細胞的過度活化[9]。然而，癌痛的機制和疼痛信息的處理仍然不完全清楚，因此這是一個尚未滿足的醫療需求[10]。此外，超過一半的轉移性癌痛病人報告目前可用的藥物治療不足以充分緩解疼痛[11]。另外，骨癌痛通常使用阿片類藥物治療，雖然在急性疼痛的緩解上有效，但長期使用卻伴隨著一系列的不良反應，如便秘、呼吸抑制、耐受性和成癮[12]。因此，開發新的治療藥物，既可以治療癌癥又可以控制癌痛，具有巨大的社會意義，是當前亟待解決的重大問題。

淫羊藿素(icaritin, ICT)是一種異戊烯基黃酮類化合物，是中藥小檗科植物淫羊藿的主要活性單體成分，具有多種藥理和生物學活性[13]。近年來，淫羊藿素因其抗腫瘤作用而備受關注，包括抑制膠質母細胞瘤、肝癌、腎癌、肺癌、卵巢癌和骨肉瘤等[14,15]。其具體作用機制包括激活TRAIL 或Fas-caspase-3/8凋亡途徑進而促進細胞凋亡[16]，以及抑制晚期肝癌細胞中的IL-6/JAK/STAT3 通路，增強效應T 細胞功能，從而發揮抗腫瘤作用[17]。最近，淫羊藿素已被中國國家藥品監督管理局批準用于晚期肝癌的治療[18]。此外，研究表明淫羊藿素可以通過多種途徑和靶點調節炎癥細胞因子的產生，干擾免疫細胞功能，發揮強大的抗炎和免疫調節功能[19]。淫羊藿素還具有較強的神經保護作用、骨保護作用和抗炎作用[20]。然而，關于淫羊藿素是否對骨癌痛具有鎮痛作用尚未見報道。本研究旨在通過構建BCP 小鼠模型，探究淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應，以及淫羊藿素與嗎啡聯合用藥的鎮痛效應。通過測定BCP小鼠的機械痛閾、冷痛潛伏期以及自發痛閾，明確淫羊藿素以及淫羊藿素與嗎啡聯合用藥對BCP 小鼠的鎮痛效應，為淫羊藿素用于臨床治療癌痛的應用提供重要指導。

方 法

1.實驗動物

本實驗使用8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠。實驗動物由北京大學醫學部實驗動物科學部提供（動物許可證號：SYXK（京）2021-0064）。在SPF 條件下飼養，飼養環境保持在25 ℃室溫，50%～60%的濕度，12 小時的光照/黑暗循環下，讓小鼠自由進食和飲水。所有動物實驗均按照國際疼痛學會的指導方針進行[21]，并經北京大學醫學部倫理委員會批準（動物倫理審批號：BCJB0019）。在整個實驗過程中，盡量減少動物的不適和使用量。

2.主要試劑與儀器

淫羊藿素（由北京珅諾基醫藥科技股份有限公司提供）、嗎啡、胎牛血清、抗生素混合液、DMEM 培養基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、超凈臺、恒溫細胞孵育箱、細胞計數儀、vonFrey 機械測痛儀、冷痛測痛儀、自發痛測痛儀。

3.細胞培養與細胞懸液制備

小鼠路易斯肺癌 (lewis lung carcinoma, LLC) 細胞系由國家生物醫學實驗細胞資源庫北京協和細胞資源中心提供。本實驗首先從液氮中取出LLC 細胞，在37℃水浴鍋中快速融化后，在37℃，5% CO2，含有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培養基中培養。將培養成熟的LLC 細胞用PBS 洗滌3 次后，用0.25%胰蛋白酶消化3 min，隨后使用含有胎牛血清的DMEM 終止消化，并使用1000 轉離心3 分鐘后用PBS 重懸。將重懸的細胞懸液用細胞計數儀進行計數，并制備成濃度為4×106個/ml 的LLC 細胞懸液。

4.建立BCP 小鼠模型

采用Wang 等[22]報道的方法。首先，使用3 %異氟醚麻醉小鼠，暴露膝關節。用微量注射器將10 μl LLC 細胞懸液（4×106個/ml）緩慢注入小鼠左側股骨遠端骨髓腔內，對照組僅注射等量PBS，注射后停針2 min。任何在腫瘤細胞接種后14 天表現出運動缺陷或缺乏痛覺過敏反應的小鼠以及在實驗中死亡的小鼠均被排除在研究之外。

5.實驗分組與流程

（1）將48 只小鼠按隨機數字表法分為Na?ve組 (n= 16)、PBS 組 (n= 16)和BCP 組 (n= 16)。每組小鼠在接種LLC 細胞前（第0 天），以及在接種LLC 細胞后第3、7、10、14 和21 天，分別測定自發抬足次數和抬足保護時間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機械痛閾。

（2）將80 只小鼠制作成BCP 模型，按隨機數字表法分為7 組，在BCP 造模后第7 至14 天進行淫羊藿素給藥，每日2 次（間隔12 h）共14 次，根據給藥劑量不同，7 組分別為Vehicle 組 (n= 11)、淫羊藿素 25 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 50 mg/kg組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg 組 (n= 11)、淫羊藿素 200 mg/kg 組 (n= 11)、淫羊藿素 400 mg/kg 組(n= 11)、淫羊藿素 800 mg/kg 組 (n= 12)。每組小鼠在接種LLC 細胞前（第0 天），在接種LLC 細胞后第3、7、10、14、15、16、18 和21 天，以及在停藥后（給藥第7 天，即BCP 造模后第14 天）第0 h、3 h、6 h、12 h、24 h 分別測定自發抬足次數和抬足保護時間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機械痛閾。

（3）將72 只小鼠制作成BCP 模型，按隨機數字表法分為8 組，在BCP 造模后第7 至14 天進行淫羊藿素和嗎啡聯合用藥，每日2 次（間隔12 h）共14 次，根據給藥劑量不同，8 組分別為Vehicle組 (n= 9)、嗎啡10 mg/kg 組 (n= 9)、嗎啡20 mg/kg組(n= 9)、淫羊藿素 200 mg/kg 組 (n= 9)、淫羊藿素 200 mg/kg +嗎啡1 mg/kg 組(n= 9)、淫羊藿素 200 mg/kg +嗎啡2 mg/kg 組 (n= 9)、淫羊藿素200 mg/kg + 嗎啡4 mg/kg 組 (n= 9)、淫羊藿素200 mg/kg +嗎啡8 mg/kg 組 (n= 9)。每組小鼠在接種LLC 細胞前（第0 天），以及在接種LLC 細胞后第3、7、10、14、15、16、18 和21 天，分別測定自發抬足次數和抬足保護時間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機械痛閾。

（4）將84 只小鼠制作成BCP 模型，按隨機數字表法分為7 組，在BCP 造模后第7 至14 天進行淫羊藿素和嗎啡聯合給藥，每日2 次（間隔12 h）共14 次，根據給藥劑量不同，7 組分別為Vehicle組(n= 12)、嗎啡10 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡1 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡2 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡4 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡8 mg/kg 組 (n= 12)。每組小鼠在接種 LLC 細胞前（第0 天），以及在接種LLC 細胞后第3、7、10、14、15、16、18 和21 天，分別測定自發抬足次數和抬足保護時間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機械痛閾。

6.藥物配置與給藥

淫羊藿素的配置與給藥：分別對每只小鼠稱量體重，并根據體重計算每次給藥劑量，稱量相應劑量淫羊藿素粉末，加入對應體積的玉米油作為溶劑，使用震蕩混勻儀震蕩20 min 后靜置，用玉米油定容至固定體積后再震蕩10 min，隨后按照每次給藥劑量進行分裝后放4℃保存。給藥方式為灌胃給藥，對照小鼠灌胃給予對應體積的玉米油。

嗎啡配置與給藥：分別對每只小鼠稱量體重，并計算每次給藥劑量，稱量相應劑量嗎啡粉末，加入對應體積的PBS 作為溶劑，使用震蕩混勻儀震蕩5 min 后用PBS 定容至固定體積，隨后按照每次給藥劑量進行分裝后放4 ℃保存。給藥方式為皮下注射，對照組小鼠皮下注射對應體積的PBS。

7.痛行為學檢測

在安靜環境下，將小鼠置于底部為玻璃平臺的塑料隔室中，適應 30 min 后開始測量。隨后在不給予任何刺激的情況下，記錄10 min 內小鼠左足自發的抬足、舔足、甩足或者跛行的次數以及持續時間作為自發痛行為的判斷指征。

冷刺激行為學裝置用于測定冷痛潛伏期。在安靜環境下，將小鼠置于底部為玻璃平臺的塑料隔室中，適應 30 min 后開始測量。將裝有干冰儀器置于玻璃平臺下方，垂直接觸小鼠左后爪下方玻璃。干冰接觸的最長時間設置為20 s，以防止不必要的組織損傷。對冷刺激的突然抬足、舔足、甩足被認為是陽性反應，每只小鼠進行3 次測量，每次測量間隔至少10 min，記錄產生陽性反應所需的時間，3次結果的平均值被記錄為冷痛潛伏期。

vonFrey 機械測痛儀用于測定機械痛閾。在安靜環境下，將小鼠置于底部為鐵絲網格的塑料隔室中，適應30 min 后開始測量。vonFrey 纖維絲（0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0 和2.0 g）垂直施壓于小鼠左后爪正中央并保持5 s。對vonFrey 纖維絲刺激的突然縮抬足、舔足、甩足被認為是陽性反應，每個克數的細絲均測量5 次，每次測量間隔至少10 min，產生3 次陽性反應所需的最小克數被記錄為機械痛閾。

在給藥期間，痛行為學檢測統一在當天第1 次給藥后3 h 開始。在停藥期間，痛行為學檢測時間點與給藥期間保持一致。

8.統計學分析

通過GraphPad Prism 9.0 軟件進行數據的統計分析并繪圖，數據分析結果使用均數±標準誤(±SEM)表示。行為學數據采用雙因素重復測量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)。P＜ 0.05 認為差異具有統計學意義。

結 果

1.BCP 小鼠模型的建立及評價

為了評價BCP 小鼠模型的建立是否成功，分別在造模后第0、3、7、10、14、21 天進行疼痛行為學測定。行為學結果顯示，與Na?ve 組及PBS 組相比，BCP 組小鼠在LLC 細胞接種后7～14 天，小鼠左側（荷瘤側）后爪對機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)（見圖1A）以及對冷痛刺激的縮足潛伏期 (paw withdrawal latency,PWL)（見圖1B）均降低；而同側后爪的自發縮足次數和抬足保護時間增加（見圖1C, 1D），提示小鼠左側后爪出現了明顯的痛覺過敏，并且在行為學檢測至造模后第21 天，小鼠痛覺過敏仍持續存在。這些結果表明BCP 小鼠模型建立成功。

圖1 BCP 小鼠模型的建立及評價Fig.1 Establishment and assessment of a BCP mouse model

2.淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應及EC50 測定

為了探究淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應，給予不同劑量的淫羊藿素，檢測其對BCP 小鼠的鎮痛效應，并繪制時間-劑量效應曲線。結果顯示，與Vehicle 組相比，從給藥后第3 天開始（即BCP造模后第10 天），給予淫羊藿素劑量在50 mg/kg以上的BCP 模型組小鼠，其左側（荷瘤側）后爪對MWT 以及對冷痛刺激的PWL 均明顯增加（見圖2A, 2B）。與Vehicle 組相比，從給藥后第7 天開始（即BCP 造模后第14 天），給予淫羊藿素劑量在50 mg/kg 以上的BCP 模型組小鼠，其同側后爪的自發抬足次數以及抬足保護時間均明顯減少（見圖2C, 2D）。這些結果表明，淫羊藿素對BCP 小鼠具有明顯的鎮痛效應。

圖2 淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應Fig.2 The analgesic effect of icaritin on BCP mice

為了探究在停藥后24 h 以內淫羊藿素對BCP小鼠的鎮痛效應，在BCP 模型組小鼠給予淫羊藿素7 天后，分別在停藥后第0 h、3 h、6 h、12 h、24 h進行痛閾檢測。結果顯示，在停藥后24 h 以內的多個時間點，淫羊藿素均能增加BCP 小鼠同側后爪對MWT 和對冷痛刺激的PWL（見圖3A, 3B），并減少自發縮足次數和抬足保護時間（見圖3C, 3D）。結果表明，在停藥24 h 以內淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應穩定，無明顯波動。

圖3 淫羊藿素對BCP 小鼠停藥后鎮痛效應及EC50 確定Fig.3 The analgesic effect of icaritin on BCP mice and the determination of EC50

為了進一步確定淫羊藿素對BCP 小鼠鎮痛效應的EC50(concentration for 50% of maximal effect)，選取在淫羊藿素停藥后第2 天（即BCP 造模后第15 天），測定小鼠同側后爪對MWT 以及冷痛刺激的PWL，分別繪制劑量-效應曲線。結果顯示，淫羊藿素對BCP 小鼠機械痛鎮痛效應的EC50為68.22 mg/kg（見圖3E），對BCP 小鼠冷痛鎮痛效應的EC50為98.95 mg/kg（見圖3F）。綜合以上結果，提示淫羊藿素對BCP 小鼠鎮痛效應的EC50約為70～100 mg/kg。

3.全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)聯合嗎啡用藥的鎮痛效應

為了探究淫羊藿素與嗎啡聯合用藥對BCP 小鼠的鎮痛效應，使用2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯合用藥，并進行痛閾檢測。機械痛行為學結果顯示，在BCP 造模后第10天以及第14 天，與單獨使用淫羊藿素(200 mg/kg)相比，淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯合用藥能夠提高淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應，其鎮痛效應與10 mg/kg 嗎啡和20 mg/kg 嗎啡的鎮痛效應接近。此外，聯合用藥對BCP 小鼠的鎮痛效應可以穩定地持續至停藥后第7 天（見圖4A）。同樣地，冷痛及自發痛行為學結果也顯示，在BCP 造模后第10 天以及第14 天，與單獨使用淫羊藿素(200 mg/kg)相比較，淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯合用藥對BCP 小鼠的鎮痛效應與200 mg/kg 淫羊藿素組以及10 mg/kg嗎啡組和 20 mg/kg 嗎啡組接近，并且在聯合用藥組，對BCP 小鼠的鎮痛效應也可以穩定地持續至停藥后第7 天（見圖4B-D）。以上結果表明，2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯合用藥可以顯著延長停藥后對BCP 小鼠的鎮痛效應（即停藥后鎮痛效應）。

圖4 全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)聯合嗎啡用藥的鎮痛效應Fig.4 Analgesic effects of icaritin at a full-effect dose (200 mg/kg) in combination with morphine

4.半效劑量淫羊藿素(100 mg/kg)聯合嗎啡用藥的鎮痛效應

為了探究淫羊藿素與嗎啡聯合用藥是否能夠減少嗎啡的用藥劑量，使用半效劑量淫羊藿素(100 mg/kg)與嗎啡聯合用藥。在造模后第14 天，分別測定各組小鼠同側后爪的機械痛閾（見圖5A）、冷痛閾（見圖5B）以及自發痛行為（見圖5C, 5D）。結果發現，100 mg/kg 淫羊藿素+ 4 mg/kg 嗎啡組以及100 mg/kg 淫羊藿素+ 8 mg/kg 嗎啡組對BCP 小鼠的鎮痛效應優于100 mg/kg 淫羊藿素+ 1mg/kg 嗎啡組以及100 mg/kg 淫羊藿素+ 2 mg/kg 嗎啡組，并且前兩組的鎮痛效應均能接近10 mg/kg 嗎啡組。以上結果提示，100 mg/kg 淫羊藿素與嗎啡聯合用藥，在達到10 mg/kg 嗎啡的鎮痛效應時，最多可以減少60%的嗎啡用藥劑量。

圖5 半效劑量淫羊藿素（100 mg/kg）聯合嗎啡用藥的鎮痛效應Fig.5 Analgesic effects of icaritin at a half-effect dose (100 mg/kg) in combination with morphine

討 論

骨癌痛是由原發性骨腫瘤或骨轉移引起的癌性疼痛，被認為是慢性疼痛中最嚴重和最難治療的類型之一[23]。研究表明，約四分之三的晚期癌癥病人經歷過中重度疼痛[24]，并且約有一半以上的轉移性癌痛病人通過藥物治療無法緩解[11]。因此，迫切需要開發新的治療藥物用于減輕疼痛并提高生活質量。建立與骨癌痛病人狀況相似的實驗動物模型對開發針對骨癌痛的鎮痛藥物至關重要[25]。本研究采用Wang 等[22]報道的方法，將Lewis 肺癌細胞接種于小鼠股骨骨髓腔內，以建立BCP 小鼠模型。該模型可部分還原骨癌痛病人的疼痛狀態，并可以比較好地用于模擬BCP 的發生機制，目前已經在許多骨癌痛的臨床前研究中采納應用。在我們的實驗中觀察到，BCP 小鼠在造模后第7～21 天其荷瘤側后爪的MWT 和PWL 顯著低于對照組，且疼痛呈逐漸加重的趨勢。在造模后的第10 天至第21 天，BCP 小鼠自發抬足次數以及抬足保護時間顯著增加。綜合這些結果表明BCP 小鼠模型的成功建立。

已有研究表明，淫羊藿素具有強大的抗腫瘤[26]和抗炎[27]等作用，但迄今為止尚未發現淫羊藿素在骨癌痛治療方面的相關研究報道。為了探究淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應，我們選擇在小鼠BCP造模后第7～14 天灌胃給予淫羊藿素，結果發現淫羊藿素在BCP 造模后第10～18 天明顯增加BCP 小鼠的MWT 和PWL，同時減少了自發抬足次數以及抬足保護時間，表明淫羊藿素對小鼠BCP 有明顯的鎮痛效應。為了評估淫羊藿素鎮痛效應的持續性和穩定性，本研究在小鼠BCP 造模后第14 天，即在第7 天給藥停止后的不同時間點(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)進行了疼痛行為學檢測，結果表明，在停藥后24 h 以內，淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應相對穩定，沒有明顯波動。因此，我們選取在淫羊藿素停藥后第2 天（即BCP 造模后第15 天），測定小鼠同側后爪對機械痛刺激的縮足閾值以及對冷痛刺激的縮足潛伏期，分別繪制了劑量-效應曲線。根據實驗結果，我們推斷出淫羊藿素對BCP 小鼠鎮痛效應的EC50約為70～100 mg/kg。值得注意的是，淫羊藿素對機械刺激與冷刺激鎮痛效應敏感性存在差異，這可能與淫羊藿素在不同痛敏行為中的作用靶點不同有關。

為了研究淫羊藿素與嗎啡聯合用藥對BCP 小鼠的鎮痛效應，本研究首先建立了BCP 小鼠模型，在BCP 造模后第7～14 天進行給藥，分別給予嗎啡或淫羊藿素與不同劑量嗎啡聯合用藥。使用2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與不同劑量嗎啡聯合用藥，結果顯示，200 mg/kg 淫羊藿素與不同劑量嗎啡聯合用藥均對BCP 小鼠產生良好的鎮痛效應，且與單獨給予嗎啡的鎮痛效應接近。這可能是因為200 mg/kg 淫羊藿素已經達到嗎啡最大鎮痛效應的相同效果（即天花板效應），因此200 mg/kg淫羊藿素與嗎啡聯合用藥沒有顯著增強鎮痛效應。然而，在停止給藥后（即在BCP造模后第14～21天），與單獨給予嗎啡或者淫羊藿素相比，200 mg/kg 淫羊藿素與嗎啡聯合用藥對BCP 小鼠的鎮痛效應仍然持續存在。這些結果表明，2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯合用藥可顯著延長停藥后的鎮痛效應。需要注意的是，相同劑量的淫羊藿素在多次行為學實驗中對BCP 小鼠的鎮痛效應存在差異，這可能與不同批次實驗中小鼠的個體差異有關。

為了探究淫羊藿素與嗎啡聯合用藥在達到嗎啡最大鎮痛效應時可以減少的嗎啡用藥劑量，本研究采用半效劑量淫羊藿素(100 mg/kg)與不同劑量嗎啡聯合用藥。結果顯示，100 mg/kg 淫羊藿素與4 mg/kg 嗎啡以及8 mg/kg 嗎啡聯合用藥對BCP 小鼠的鎮痛效應與10 mg/kg 嗎啡的鎮痛效應相似。因此，這些結果表明，100 mg/kg 淫羊藿素與嗎啡聯合用藥最多可以減少60%的嗎啡使用量，且達到與10 mg/kg嗎啡相同的鎮痛效應。

本研究探究了淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮痛效應以及淫羊藿素與嗎啡聯合用藥的鎮痛效應。為了明確淫羊藿素對癌痛鎮痛效應的穩定性，計劃使用KPPC小鼠模型[28]等不同癌痛模型進一步進行研究，以加深對淫羊藿素在癌痛治療方面的了解。此外，本文尚未深入探究淫羊藿素對BCP 小鼠鎮痛作用的潛在機制。未來將進一步探究淫羊藿素對BCP 小鼠腫瘤的影響，并深入探討對淫羊藿素鎮痛效應的具體機制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。