低溫下環(huán)丙酸酰胺調(diào)控棉花內(nèi)源激素促進(jìn)噻苯隆脫葉的機(jī)制

孫尚文 束紅梅 楊長琴 張國偉 王曉婧 孟亞利 王友華劉瑞顯,*

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 江蘇南京 210095; 2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京 210014

脫葉催熟技術(shù)是實(shí)現(xiàn)棉花機(jī)械采收的重要前提,合理噴施脫葉催熟劑, 不僅促進(jìn)棉花集中吐絮, 而且加快收獲前葉片的脫落, 提高機(jī)采棉的采摘率和作業(yè)效率[1]。噻苯隆(thidiazuron, TDZ)是目前棉花生產(chǎn)中使用最廣泛的化學(xué)脫葉劑[2], 但是, TDZ對環(huán)境溫度比較敏感, 其噴施標(biāo)準(zhǔn)要求平均氣溫>16℃和最低溫度>12℃[3]。但在我國主產(chǎn)棉區(qū), 棉花收獲期常遭遇低溫天氣導(dǎo)致噻苯隆脫葉效果下降, 不能滿足機(jī)械化采收的需要[4]。

TDZ誘導(dǎo)棉花葉片脫落是一個(gè)多種內(nèi)源激素相互配合的連續(xù)過程[5], 其中, 生長素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)是脫落的有效抑制劑, 而乙烯(ethylene, ET)是促進(jìn)脫落的主要激素[6]。TDZ通過誘導(dǎo)棉葉離層IAA合成基因YUCCAs、代謝基因ILRs以及運(yùn)輸基因PINs、LAXs表達(dá)量的顯著降低,促進(jìn)離層中IAA的含量降低, 從而導(dǎo)致IAA下游信號被阻斷, IAA信號響應(yīng)因子IAAs、ARFs下調(diào)表達(dá),令離層對ET敏感度增加[6-8]。同時(shí), TDZ還誘導(dǎo)棉花離層中ET關(guān)鍵合成酶基因ACSs和ACOs的上調(diào)表達(dá), 促進(jìn)離層中ET前體1-氨基環(huán)丙烷羧酸(1-aminocyclopropanecarboxylic acid, ACC)含量的增加并有利于ET合成, 進(jìn)而誘導(dǎo)脫落必需的ET下游響應(yīng)因子ERFs在離層中上調(diào)表達(dá), 正向調(diào)控脫落[6-13]。此外, 除IAA和ET, 脫落酸(abscisic acid,ABA)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)也參與脫落[10]。TDZ誘導(dǎo)棉花離層中多個(gè)ABA合成基因和代謝基因上調(diào)表達(dá)[10,14-15]、JA含量短暫增加和調(diào)控因子JAZs上調(diào)表達(dá)[6,16]。我們前期研究表明, TDZ通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)棉葉脫落, 但在低溫下棉葉離層內(nèi)IAA和ET的合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對TDZ的響應(yīng)受到明顯抑制, 這可能是低溫下棉花化學(xué)(TDZ)脫葉受抑制的主要原因[6]。

環(huán)丙酸酰胺(cyclanilide, CYC)是一種丙二酸酯,具有抑制植物體內(nèi)生長素極性運(yùn)輸?shù)哪芰17], CYC單獨(dú)使用沒有脫葉效應(yīng), 但添加CYC可增強(qiáng)脫葉劑的脫葉效果。在16～30℃, CYC 和乙烯利(ETH)聯(lián)合使用可使棉葉脫落率由25%提升到80%左右[18]。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)CYC和TDZ復(fù)配使用可明顯提高低溫下棉花脫葉率[19], 但作用機(jī)制尚不明確。而內(nèi)源激素作為葉片脫落的主要信號因子, 其如何參與低溫下CYC和TDZ復(fù)配促進(jìn)棉花落葉的過程尚不清楚。

因此, 本研究深入分析了不同環(huán)境溫度下CYC對棉花化學(xué)(TDZ)脫葉過程中離層中IAA、ACC、ABA和JA等內(nèi)源激素含量變化及這些激素合成、代謝、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因的表達(dá)的影響,為明確低溫下CYC促進(jìn)TDZ誘導(dǎo)棉葉脫落的生理機(jī)制提供了思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用中棉425品種作為材料。種子經(jīng)過催芽處理后, 播種在裝有基質(zhì)和蛭石(體積比為2∶1)的盆缽中, 置于溫室中, 溫度設(shè)置為白天27℃,夜間23℃, 自然光照培養(yǎng), 待棉花長至五葉期移入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)2個(gè)溫度條件, 常溫25℃ (27℃日/23℃夜) (normal temperature, N)和低溫15℃ (17℃日/13℃夜) (low temperature, L), PPFD設(shè)為80 μmol m-2s-1, 光照周期為12 h。在2個(gè)溫度條件下分別設(shè)置清水處理(對照, 標(biāo)記為CK), 單獨(dú)0.1% TDZ溶液處理(TDZ, 標(biāo)記為T), 0.1% TDZ和0.03% CYC復(fù)配溶液處理(TDZ+CYC, 標(biāo)記為TC)。試驗(yàn)分為6個(gè)組合, 25℃條件下CK處理、TDZ處理、TDZ+CYC復(fù)配處理和15℃條件下CK處理、TDZ處理、TDZ+CYC復(fù)配處理。

1.3 棉葉脫落率

記錄每個(gè)處理的處理前葉片數(shù), 棉花脫葉率調(diào)查從處理后24 h開始, 至處理后240 h結(jié)束, 每24 h調(diào)查一次各處理的剩余葉片數(shù), 總計(jì)10次調(diào)查, 3次重復(fù)。棉葉脫落率的計(jì)算公式為 :

棉葉脫落率= (處理前葉片數(shù)-剩余葉片數(shù))/處理前葉數(shù)×100%

1.4 內(nèi)源激素提取和測定

1.4.1 離層組織取樣與保存 25℃條件下在脫葉劑處理后12 h、24 h和48 h, 15℃條件下在脫葉劑處理后24 h、48 h和144 h, 選擇棉花倒二葉、倒三葉離層組織用手術(shù)刀切下并用液氮速凍后保存在–80℃冰箱中。

1.4.2 IAA、ABA、JA的提取、純化與檢測 準(zhǔn)確稱量100 mg倒二葉、倒三葉離層樣品, 液氮磨碎后, 在5 mL離心管中用1 mL提取液(2-丙醇∶H2O∶HCl = 2∶1∶0.002), 4℃震蕩提取30 min。再加入2 mL二氯甲烷, 4℃震蕩提純30 min, 4℃、10,206.9×g離心5 min, 收集下清液用氮?dú)獯蹈? 甲醇復(fù)溶后用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測IAA、ABA、JA的含量, 重復(fù)3次。

1.4.3 ACC的提取、純化與檢測 準(zhǔn)確稱量100 mg倒二葉、倒三葉離層樣品, 液氮磨碎后, 在5 mL離心管中用1 mL去離子水4℃震蕩提取30 min。取上清并用0.1%乙酸將pH值調(diào)至4以下, 用等體積氯仿混勻, 洗滌一次, 取水相。過MCX固相萃取小柱, 分別用2 mL甲醇和1 mL水洗滌小柱, 最后用1 mL 1 mol L–1的氨水甲醇溶液洗脫, 收集并用氮?dú)獯蹈伞Ａ鲃?dòng)相(甲醇∶0.1%乙酸 = 1∶9)溶解后, 用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測ACC含量, 重復(fù)3次。

1.5 內(nèi)源激素相關(guān)基因的表達(dá)分析

利用擎科生物的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)提取棉葉離層RNA。利用擎科生物的SynScript III cDNA Synthesis Mix試劑盒應(yīng)制備cDNA。按照擎科生物熒光定量試劑盒2× TSINGKE Master qPCR Mix (SYBR Green I)的反應(yīng)體系和對應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR), 設(shè)3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。使用Primer primier 5軟件設(shè)計(jì)引物, 引物序列見表1。

表1 引物及其序列Table 1 Primers and their sequences

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用SPSS 2019對數(shù)據(jù)通過最小顯著差異法和鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn), 將數(shù)據(jù)與分析結(jié)果通過Origin 2017繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理的棉花脫葉率

常溫(25℃)條件下, 脫葉劑使用24 h后, TDZ+CYC復(fù)配處理棉葉開始脫落, 72 h后TDZ+CYC復(fù)配處理棉葉全部脫落; 而TDZ處理48 h后棉葉開始脫落, 在處理96 h后棉葉全部脫落。在低溫(15℃)下, 脫葉劑使用144 h后, TDZ+CYC復(fù)配處理棉葉開始脫落, TDZ處理棉葉處理168 h后開始脫落。在處理后240 h, TDZ+CYC處理棉葉脫葉率為79.6%, TDZ處理脫葉率為53.0% (圖1)。說明,低溫顯著延遲了TDZ處理的脫葉時(shí)間, 降低了TDZ處理的脫葉效果, 與TDZ處理相比, 低溫下TDZ+CYC復(fù)配處理棉葉脫落時(shí)間提前且脫葉率上升。

圖1 不同處理棉花葉片脫落率Fig. 1 Abscission rate of cotton leaves under different treatments

2.2 棉葉離層中內(nèi)源激素含量的變化

2.2.1 棉葉離層中IAA含量 由圖2可知, 常溫條件下, 相較于CK, TDZ+CYC處理離層中IAA含量在處理后12 h顯著降低, 而TDZ處理離層中IAA含量在處理后48 h才顯著下降(圖2-a)。在低溫條件下, TDZ+CYC處理離層中IAA含量在處理后24 h顯著低于CK、TDZ處理, TDZ處理離層中IAA含量在處理后144 h才顯著低于CK, 但仍高于TDZ+CYC處理(圖2-b)。說明常溫條件下TDZ和TDZ+CYC復(fù)配均可誘導(dǎo)棉葉離層中IAA含量降低,低溫延遲了TDZ對棉葉離層中IAA含量的調(diào)控, 而相較于TDZ, 低溫下TDZ+CYC復(fù)配能夠提前且更多地降低棉葉離層中IAA含量。

圖2 不同處理棉葉離層IAA含量變化Fig. 2 Changes of IAA content in the abscission zone of cotton leaves under different treatments

2.2.2 棉葉離層中ACC含量 由圖3可知, 常溫條件下, TDZ處理后48 h離層中ACC含量較CK顯著升高, 而TDZ+CYC處理離層中ACC含量在處理后24 h明顯高于CK (圖3-a)。低溫條件下, TDZ處理和TDZ+CYC處理離層中ACC含量均在處理后144 h明顯升高,且TDZ+CYC處理ACC含量顯著高于TDZ處理(圖3-b)。說明, 常溫條件下TDZ和TDZ+CYC復(fù)配誘導(dǎo)棉花葉片離層中ACC含量升高, 但低溫延遲了TDZ對棉葉離層中ACC含量的調(diào)控, 而相較于TDZ, 低溫下TDZ+CYC復(fù)配可顯著提高棉葉離層中ACC含量。

圖3 不同處理棉葉離層ACC含量變化Fig. 3 Changes of ACC content in the abscission zone of cotton leaves under different treatments

2.2.3 棉葉離層中ABA含量 比較不同處理棉葉離層中ABA含量發(fā)現(xiàn)(圖4), 相較于CK, 常溫條件下, TDZ+CYC處理離層中ABA含量在處理后12 h、24 h顯著降低, TDZ處理離層中ABA含量在處理后48 h才顯著下降(圖4-a)。在低溫條件下, 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)TDZ處理離層中ABA含量均顯著下降, 而TDZ+CYC處理離層中ABA含量僅在處理后48 h、144 h顯著低于對照, 但明顯低于TDZ處理(圖4-b)。結(jié)果表明, 不同溫度條件下TDZ和TDZ+CYC復(fù)配均可誘導(dǎo)棉葉離層中ABA含量下調(diào), 而相較于TDZ, 低溫下TDZ+CYC復(fù)配誘導(dǎo)棉葉離層中ABA含量顯著降低。

圖4 不同處理棉葉離層ABA含量變化Fig. 4 Changes of ABA content in the abscission zone of cotton leaves under different treatments

2.2.4 棉葉離層中JA含量 由圖5可知, 常溫條件下, TDZ處理離層中JA含量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較CK顯著下降, 而TDZ+CYC處理離層中JA含量在處理后12 h和24 h較CK顯著升高, 但在處理后48 h明顯低于CK (圖5-a)。低溫條件下, TDZ處理離層中JA含量與CK沒有顯著差異, 而TDZ+CYC處理的離層中JA含量在處理后24 h和48 h較TDZ處理顯著上升(圖5-b)。這說明, 常溫條件下TDZ誘導(dǎo)棉葉離層中JA含量下降, 低溫抑制了TDZ對棉葉離層中JA含量的調(diào)控。而不同溫度下TDZ+CYC復(fù)配在脫落前期可誘導(dǎo)棉葉離層中JA含量升高。

2.3 棉葉離層中內(nèi)源激素相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.3.1 棉葉離層中IAA相關(guān)基因的表達(dá) 從圖6可知, 常溫條件下, TDZ和TDZ+CYC處理后棉葉離層中IAA運(yùn)輸相關(guān)基因LAX2和PIN1相對表達(dá)量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于CK。TDZ+CYC處理后12 h至48 h棉葉離層中IAA9和ARF3表達(dá)量顯著低于對照, 而TDZ處理的棉葉離層中IAA9和ARF3表達(dá)量分別在處理后24 h、48 h才低于CK (圖6-a)。在低溫條件下, TDZ+CYC處理棉葉離層中LAX2、PIN1、IAA9和ARF3表達(dá)量在所有時(shí)間點(diǎn)均顯著低于CK,而TDZ處理棉葉離層中ARF3和LAX2表達(dá)量在處理后24 h、IAA9表達(dá)量在處理后48 h、PIN1表達(dá)量在處理后144 h才顯著低于CK。且TDZ+CYC處理棉葉離層中LAX2、PIN1、IAA9和ARF3基因表達(dá)量在處理后24 h、48 h均顯著低于TDZ處理。而在144 h, TDZ+CYC處理棉葉離層中僅ARF3基因表達(dá)量低于TDZ處理(圖6-b)。說明常溫下TDZ和TDZ+CYC復(fù)配均可抑制棉葉離層中IAA運(yùn)輸和信號相關(guān)基因表達(dá), 低溫抑制了TDZ對棉葉離層中IAA相關(guān)基因的調(diào)控, 而低溫下TDZ+CYC復(fù)配相較于TDZ不僅較早誘導(dǎo)棉葉離層IAA運(yùn)輸和信號相關(guān)基因下調(diào)表達(dá), 且其下調(diào)幅度更大。

圖6 不同處理棉葉離層中IAA相關(guān)基因表達(dá)量Fig. 6 Expression level of IAA-related genes in cotton leaves abscission zone under different treatments

2.3.2 棉葉離層中ET相關(guān)基因的表達(dá) 從圖7可知, 常溫條件下, 相較于CK, TDZ處理棉葉離層中ET合成基因ACO表達(dá)量在處理后12 h顯著升高、ACS和ERF1B表達(dá)量在處理后48 h顯著高于CK;而TDZ+CYC處理的棉葉離層中ACO和ERF1B表達(dá)量在處理后12 h顯著高于CK、ACS表達(dá)量在處理后24 h顯著高于CK (圖7-a)。低溫條件下,TDZ+CYC處理的棉葉離層中ERF1B表達(dá)量在處理后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于CK, 其ACS和ACO表達(dá)量在處理后144 h顯著高于CK; 而TDZ處理的棉葉離層中ERF1B表達(dá)量在處理后48 h、144 h才顯著高于CK, 且在處理后144 h, 棉葉離層中3個(gè)基因的表達(dá)量均低于TDZ+CYC處理(圖7-b)。說明TDZ誘導(dǎo)棉葉離層中ET合成基因和信號基因上調(diào)表達(dá),低溫延遲了TDZ對ET相關(guān)基因的調(diào)控, 而在低溫下TDZ+CYC復(fù)配處理相較于TDZ顯著增加了棉葉離層中ET合成、信號基因的表達(dá)量。

圖7 不同處理棉葉離層中ET相關(guān)基因表達(dá)量Fig. 7 Relative expression level of ET-related genes in cotton leaves abscission zone under different treatments

2.3.3 棉葉離層中ABA相關(guān)基因的表達(dá) 由圖8可知, 相較于CK, 常溫條件下, TDZ和TDZ+CYC處理的棉葉離層中ABA代謝基因CYP707A4的相對表達(dá)量在所有時(shí)間點(diǎn)均顯著升高, 而2個(gè)處理棉葉離層中ABA信號調(diào)控基因PP2C77相對表達(dá)量在處理后24 h、48 h顯著高于CK (圖8-a)。在低溫條件下, TDZ+CYC處理棉葉離層中CYP707A4表達(dá)量在處理后48 h明顯增加, 而TDZ處理棉葉離層中CYP707A4表達(dá)量在處理后144 h才顯著升高, 且仍低于TDZ+CYC處理。此外, TDZ+CYC處理棉葉離層中PP2C77表達(dá)量在處理后144 h均顯著高于CK(圖8-b)。這說明, 常溫下TDZ處理和TDZ+CYC處理促進(jìn)了棉葉離層中ABA代謝和信號基因的表達(dá),低溫延遲了TDZ對棉葉離層中ABA相關(guān)基因的調(diào)控, 低溫下TDZ+CYC處理不僅可較早地誘導(dǎo)棉葉離層中ABA代謝基因的上調(diào)表達(dá), 并且顯著增加了代謝基因的表達(dá)量。

圖8 不同處理棉葉離層中ABA相關(guān)基因表達(dá)量Fig. 8 Expression level of ABA-related genes in cotton leaves abscission zone under different treatments

2.3.4 棉葉離層中JA相關(guān)基因的表達(dá) 由圖9可知, 常溫條件下, TDZ+CYC處理的棉葉離層中JA合成基因AOC4和信號基因TIFY9表達(dá)量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于CK, 而TDZ處理棉葉離層中AOC4表達(dá)量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于CK,TIFY9表達(dá)量在處理后24 h、48 h才顯著高于CK (圖9-a)。在低溫條件下, TDZ+CYC處理棉葉離層中TIFY9表達(dá)量在所有時(shí)間點(diǎn)均高于CK, TDZ僅在處理后24 h、48 h誘導(dǎo)棉葉離層中TIFY9上調(diào)表達(dá), 且仍低于TDZ+CYC處理。另外, TDZ+CYC處理后24 h、48 h棉葉離層中AOC4表達(dá)量明顯高于CK, 而TDZ處理對該基因沒有顯著影響(圖9-b)。表明, 常溫條件下, TDZ和TDZ+CYC對棉葉離層中JA合成和信號相關(guān)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用, 但兩者對AOC4的調(diào)控呈相反趨勢, 這與兩處理離層中JA含量變化相符, 低溫抑制TDZ對棉葉離層中AOC4的調(diào)控, 相較于TDZ處理, 在低溫下TDZ+CYC復(fù)配顯著增加棉葉離層中JA合成、信號基因表達(dá)量。

3 討論

TDZ誘導(dǎo)的棉葉脫落效果受環(huán)境溫度影響[4]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫(15℃)下TDZ單劑誘導(dǎo)240 h后的棉花脫葉率僅50%左右, 而TDZ+CYC復(fù)配處理的棉葉脫落開始時(shí)間較TDZ單劑處理提前24 h, 并且顯著提高脫葉率至80%左右, 說明TDZ+CYC復(fù)配可有效改善低溫下棉葉的脫葉效果。TDZ作為調(diào)節(jié)劑型的脫葉劑, 主要通過調(diào)控棉葉離層中內(nèi)源激素合成、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程誘導(dǎo)棉葉脫落, 且本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明, TDZ對棉葉離層中內(nèi)源激素合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的調(diào)控受低溫影響[6]。為此, 本研究從棉葉離層中激素含量及相關(guān)基因的表達(dá)水平方面, 分析了低溫下TDZ單劑與TDZ+CYC復(fù)配對棉葉離層的作用差異。結(jié)果表明, 低溫下, 相較于TDZ處理, TDZ+CYC復(fù)配對棉葉離層內(nèi)源激素的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有明顯的調(diào)控作用。

離層中IAA持續(xù)極性運(yùn)輸?shù)闹袛嗍钦T導(dǎo)植物器官脫落的主要因素[20-21]。CYC具有IAA運(yùn)輸抑制劑的功能, 因此本文首先分析了棉葉離層中IAA含量、IAA運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)的變化特征。研究表明, 在正常溫度條件下, TDZ+CYC復(fù)配處理棉葉離層中IAA運(yùn)輸相關(guān)基因(LAXs、PINs)的下調(diào)表達(dá), 離層IAA含量顯著降低[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)在低溫下, 相較于TDZ單劑, TDZ+CYC復(fù)配可快速降低離層中PIN1和LAX2的表達(dá)量, 以及離層IAA含量, 表明TDZ+CYC復(fù)配在低溫下也可有效抑制棉葉離層中的IAA運(yùn)輸。此外本研究發(fā)現(xiàn)低溫下TDZ+CYC復(fù)配較早地誘導(dǎo)生長素信號基因(IAA9、ARF3)下調(diào)表達(dá)。IAA9和ARF3分別屬于AUX/IAAs家族和ARFs家族,AUX/IAAs的表達(dá)量與IAA含量正相關(guān), 多個(gè)AUX/IAAs基因被發(fā)現(xiàn)能夠抑制脫落[26]。轉(zhuǎn)錄因子ARF1,7,19在脫落過程中伴隨IAA含量降低而下調(diào)表達(dá), 其具有延緩脫落的功能[27-28]。說明相較于TDZ單劑, CYC發(fā)揮了IAA運(yùn)輸抑制劑的功能, 阻礙了IAA從葉片向離層細(xì)胞的運(yùn)輸[29], 使得低溫下TDZ+CYC復(fù)配處理離層IAA含量快速降低, 離層中IAA信號基因IAA9和ARF3基因的表達(dá)量下降, 減弱了IAA對脫落的抑制作用,從而有助于棉葉脫落。

ET的合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在棉葉脫落過程中有重要作用, 本研究發(fā)現(xiàn)低溫抑制TDZ對ET合成基因的調(diào)控, 而TDZ+CYC復(fù)配在低溫下可顯著提高棉花離層中ACS和ACO的表達(dá)量、增加離層中ACC含量。ACS將S-腺苷蛋氨酸轉(zhuǎn)化為ACC, ACO將ACC最終轉(zhuǎn)化為ET[30], 離層中ACS、ACO表達(dá)量的升高以及ACC含量的增加說明復(fù)配處理在低溫下可促進(jìn)棉葉離層中ET的大量合成。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[6]發(fā)現(xiàn)低溫抑制了TDZ對ET信號基因表達(dá)的調(diào)控, 而本研究結(jié)果表明, 相較于TDZ處理, 低溫下TDZ+CYC復(fù)配可促進(jìn)離層中ET信號基因ERF1B的上調(diào)表達(dá)。ERFs是ET信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 調(diào)節(jié)ET依賴性基因的表達(dá)[31]。研究發(fā)現(xiàn)在植物葉或花的脫落時(shí)離層中ERF1、ERF52、ERF61、ERF92、ERF113等基因的表達(dá)量升高, 并發(fā)現(xiàn)ERF1、ERF52的沉默導(dǎo)致脫落延遲[12,32-34], 外源ET可誘導(dǎo)ERF1B在蘋果果實(shí)中的上調(diào)表達(dá)[35]。說明低溫下TDZ+CYC通過促進(jìn)離層ET的合成, 誘導(dǎo)ERF1B上調(diào)表達(dá), 進(jìn)而促進(jìn)棉花葉片脫落。

通常認(rèn)為除IAA和ET, ABA也參與脫落。前人的研究認(rèn)為ABA并不能單獨(dú)誘導(dǎo)脫落[36], 而是通過促進(jìn)離層中ET的合成誘導(dǎo)脫落發(fā)生[13,37]。當(dāng)前有關(guān)TDZ誘導(dǎo)棉花葉片脫落時(shí), 離層中ABA含量變化的研究結(jié)果并不一致, 有研究發(fā)現(xiàn)離層ABA含量增加,但也有研究發(fā)現(xiàn)離層ABA含量反而降低了[8,38]。本研究中, 常溫下, 在脫落早期TDZ處理和對照處理離層中的ABA含量沒有明顯差異, TDZ+CYC復(fù)配處理離層ABA含量降低。但低溫下對照處理離層中的ABA含量持續(xù)增加, 而TDZ單劑和TDZ+CYC復(fù)配處理的離層中ABA含量降低, 且TDZ+CYC復(fù)配誘導(dǎo)的ABA含量降低幅度更大, 并促進(jìn)了ABA代謝基因CYP707A4的上調(diào)表達(dá)。非生物脅迫下ET可能參與調(diào)控ABA代謝, Saika等[39]和Tosetti等[40]研究發(fā)現(xiàn), 低溫以及澇漬脅迫下, 外源ET可誘導(dǎo)水稻幼苗以及馬鈴薯根莖中ABA代謝基因CYP707A1和CYP707A5的上調(diào)表達(dá), 通過羥基化ABA的8'甲基令A(yù)BA氧化失活[41], 降低ABA含量。本研究發(fā)現(xiàn), 與TDZ相比, TDZ+CYC復(fù)配處理離層中ACC含量顯著增加, 其ABA代謝基因CYP707A4顯著上調(diào), 因此, 低溫下TDZ+CYC復(fù)配處理離層ABA含量的降低受到ET誘導(dǎo), 而不是復(fù)配促進(jìn)棉葉脫落的主要誘因。

與ABA一樣, JA也被發(fā)現(xiàn)參與植物器官的脫落。本研究發(fā)現(xiàn)低溫完全抑制了TDZ對JA合成的調(diào)控, 而TDZ+CYC復(fù)配在脫落前期誘導(dǎo)離層中JA合成基因AOC4上調(diào)表達(dá), 增加離層JA含量。AOCs基因負(fù)責(zé)生成JA最終前體12-氧代植物二烯酸((9S,13S)-12-oxo-(10,15Z)-phytodienoic acid)[42], 該基因的上調(diào)表達(dá)有利于JA的合成。多種植物葉、果實(shí)脫落的研究發(fā)現(xiàn)JA在離層累積可能通過促進(jìn)ET合成誘導(dǎo)脫落[16,43-44]。這些研究說明JA可以通過ET途徑調(diào)控脫落。此外本研究還發(fā)現(xiàn)低溫抑制了TDZ對TIFY9基因的調(diào)控, 而低溫下TDZ+CYC復(fù)配顯著增加TIFY9基因在離層中的表達(dá)量。TIFY9屬于JAZ家族基因, 負(fù)調(diào)控JA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 是與ET串?dāng)_的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[45]。研究發(fā)現(xiàn), 外源ET通過誘導(dǎo)菠蘿花中的TIFY10c-like上調(diào)表達(dá), 激活ET信號基因EIN3,促進(jìn)ET合成基因ACO1上調(diào)表達(dá)[46-47]。而JAZ10也被發(fā)現(xiàn)在TDZ誘導(dǎo)脫落的棉葉離層中上調(diào)表達(dá)[48]。以上的研究結(jié)果說明JA和ET信號途徑的串?dāng)_與脫落有更密切聯(lián)系。綜上, 本研究推測相較于TDZ處理, 低溫下TDZ+CYC復(fù)配可能通過誘導(dǎo)JAZs的上調(diào)表達(dá)和JA含量升高, 從而誘導(dǎo)離層中ET合成,最終促進(jìn)低溫下棉葉的脫落。

脫落在植物中是一個(gè)保守的生理過程, 因此,本研究可以通過在控制條件下的棉花苗期試驗(yàn), 探究低溫下CYC促進(jìn)TDZ脫葉的激素調(diào)控機(jī)制。然而大田生產(chǎn)中吐絮期棉花葉片與試驗(yàn)所使用的棉苗葉片在衰老程度、代謝水平、可溶性糖積累等方面存在差異, 并且采收期氣溫存在復(fù)雜變化, 這是試驗(yàn)中控制的溫度條件難以模擬的, 因此本研究結(jié)果有待在大田試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

低溫抑制了噻苯隆對棉葉離層激素含量和激素相關(guān)基因表達(dá)水平的調(diào)控, 導(dǎo)致低溫下噻苯隆脫葉效果不佳; 而相較于噻苯隆單劑, 噻苯隆和環(huán)丙酸酰胺復(fù)配在低溫下通過抑制棉葉離層中生長素運(yùn)輸和促進(jìn)乙烯、茉莉酸合成, 降低了離層中生長素含量, 增加了乙烯、茉莉酸含量, 并誘導(dǎo)生長素信號基因下調(diào)表達(dá)和乙烯信號基因上調(diào)表達(dá), 可以較早地形成脫落信號, 從而低溫下棉葉脫落開始時(shí)間提前、脫葉率顯著提高。