控制玉米株高基因PHR1的基因克隆

楊晨曦 周文期,,* 周香艷,* 劉忠祥 周玉乾 劉芥杉 楊彥忠 何海軍 王曉娟 連曉榮 李永生

1甘肅農業大學生命科學技術學院, 甘肅蘭州, 730070; 2甘肅省農業科學院作物研究所, 甘肅蘭州 730070

玉米(ZeamaysL.)是禾本科的一年生草本植物,和小麥、水稻并稱為世界三大谷物。玉米與傳統的糧食作物相比, 具有更強的環境適應性, 其營養價值也比較高, 近年來玉米的實際播種面積在逐步提高, 因此, 不斷提高玉米產量是農業工作者面臨的重要任務和挑戰[1]。玉米株高(plant height, PH)主要為雄穗軸線頂端向下到地平面的距離; 穗位高(ear height, EH)主要為從玉米底部(露出地面)到果穗第一著生節的距離。玉米株高和穗位高會影響玉米光合、產量和抗倒伏等生長發育指標。20世紀60年代, 全球“第一次綠色革命”是在小麥和水稻之中推廣運用了矮化品種, 有效的解決了一些植株因倒伏而減產的問題。美國玉米研究與生產的成功經驗表明, 增加種植密度是提高產量最現實可行的舉措[2]。但一定的環境資源在種植密度增加的情況下, 會導致植株易倒伏, 影響植株的品質, 反而造成產量損失[3], 降低株高對提高玉米產量和品質具有重要意義。然而, 控制株高和穗位高的遺傳機理及調控系統網絡十分復雜, 現在仍然有許多問題尚待解決。尤其像小麥、水稻這樣既能有效降低株高和穗位高又沒有明顯減產效應的半矮稈基因在玉米遺傳機理中仍未得到定位。

株高和穗位高與赤霉素、生長素、油菜素內酯等一些植物激素息息相關[4]。目前為止已知的玉米株高基因與植物激素相關的有BR2、D8、D9、D11、Dt、NA1、NA2等60多個[5-6]。其中D8、D9和Na2對赤霉素不敏感,D8和D9基因編碼DELLA蛋白,為顯性突變;Na2雄穗雌性化, 功能缺失為隱性突變[2]。D11、Dt和Na1對赤霉素較為敏感,D11簇生,花器官發育異常, 有顯性遺傳因子;Dt莖節數量沒有減少, 是節間長度縮短導致變矮, 為顯性基因;Na1植株極度矮小, 花期延遲, 功能缺失為隱性突變[2,6]。目前被報道的玉米矮稈基因中最有育種利用價值的基因包括BRACHYTIC2, 簡稱為BR2[7]。BR2基因編碼ATP結合轉運蛋白, 通過生長素極性運輸參與玉米株高和穗位高調控,BR2基因變異可以降低穗部以下的節間長度, 所以被應用于玉米株高矮化育種[8]。本研究發現一個新玉米矮稈突變材料,將其命名為phr-1, 通過遺傳分析和基因定位, 發現該突變材料是一個玉米BR2基因的等位突變體,該突變體的發掘為矮稈玉米育種提供理論基礎和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用材料玉米自交系KWS39 (來源于德國KWS種業公司, 簡寫KWS39, 由甘肅省農業科學院作物研究所提供)作為父本, 成熟種子經過快中子4.19 Gy的劑量輻照, 方法參考劉忠祥等[9]快中子輻照玉米自交系方法。種植M1代, 嚴格套袋單株自交, 單穗收獲后, M2代大田種植篩選, 分離突變體, 后代篩選得到株高和穗位降低突變體, 命名為plant heightreducingmutant-1(phr-1)。其中phr-1突變體表現為株高降低, 穗位高下降, 后期結實正常, 矮稈表型后代中能穩定遺傳。自交系B73,Brachytic2(Br2-1)終止突變體來源: 購自Maize EMS induced Mutant Database (MEMD)突變體庫, 網站http://www.elabcaas.cn/memd[10]。本試驗所用到的定位群體為突變體phr-1與B73雜交后的F2群體。

1.2 突變體篩選及遺傳分析

將KWS39和phr-1種植在甘肅省農業科學院張掖試驗場基地。田間隨機選取KWS39和phr-1各15株, 考察株高、穗位高、節間數、各節間長度等重要性狀。使用Microsoft Excel 2019進行數據處理。種植phr-1和B73, 雜交得到F1。種植F1, 自交獲得F2種子。種植F2群體。成熟期統計F2分離群體中正常和矮化植株的分離比并進行卡方檢驗。

1.3 初步定位目的基因

phr-1與B73雜交得到F1群體, F1自交構建F2遺傳群體。在分離群體搭建過程中, 子代會根據表型進行選擇, 篩選出突變型子代池和野生型子代池,F2群體中分別選取矮稈突變體和正常植株各60株,等大小打孔取樣, 構建混合基因池, 測序深度為20X, 利用BSA (bulk segregant analysis)測序方法篩選可能與目標基因連鎖的分子標記。BSA-seq是可以快速定位并且能較為簡單的尋找到目標性狀的一種方法[11]。初步確定目標基因所在染色體位置, 將候選基因進行初步定位。

1.4 精細定位并克隆候選基因

依據玉米數據庫網站(https://www.maizegdb.org/)中初定位區段的結果, 利用DNASTAR軟件設計特異性引物, 開發新標記, 對目的基因進行精細定位。候選基因的測序依據MaizeGDB數據庫候選基因的基因組序列, 利用Premier 5軟件設計引物,分別PCR擴增KWS39和phr-1的基因組DNA和開放閱讀框(ORF)。PCR反應體系為50 μL體積, PCR反應體系: 94℃預變性2 min; 98℃變性10 s, 57℃退火20 s, 72℃延伸2 min 30 s, 循環數為35次; 72℃延伸7 min, 最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶,電泳切膠回收; 再將回收正確的產物T-A連接構建到T載體中, 隨后將連接產物用DH-5α感受態轉化大腸桿菌, 用對應引物進行菌液PCR檢測, 陽性菌液送生工生物工程(上海)公司進行測序。利用DNAMANVersion 8.0軟件分析測序結果, 確定變異位點。

1.5 等位雜交驗證

為檢測突變體phr-1是否為BR2基因的等位變異, 從玉米EMS誘變突變體庫中訂購了BR2突變體與phr-1雜交, 2個材料分別做正反交, 鑒定F1代表型與突變體phr-1表型一致。

1.6 實時熒光定量PCR

采用Eco (Illumina公司)熒光定量PCR儀, 熒光定量試劑盒(Sigma)進行實時熒光定量實驗。PCR反應體系為20 μL體積, PCR反應體系: 95℃變性10 s;60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循環數為40次; 每份樣品重復3次, 用GAPDH作為內參基因(表1), 由2–ΔΔCt方法計算得出[12]。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 突變體phr-1植株表型分析

快中子誘變后代自交獲得M2和M3代植株, 田間種植篩選, M2代表型鑒定中分離到矮稈突變體phr-1,對phr-1的各類農藝性狀進行統計, 結果表明該突變體株高及穗位高比對照KWS39極顯著降低(P<0.01),株高降低50.0%, 穗位高降低62.2% (圖1-A～C)。進一步對整株的節點數統計及每節間長度測量, 發現KWS39和phr-1總節間數相同, 共有11節, 穗上穗下節數相同, 但是節間長度極顯著減小, 莖節長度不能正常延伸, 導致株高和穗位高比對照降低(圖1-D, E)。

圖1 野生型KWS39和突變體phr-1植株表型Fig. 1 Phenotype of KWS39 (CK) and phr-1 mutant plants

(圖1)

對KWS39和phr-1苗期萌芽5 d的幼苗進行比較, 二者株高和根系發育正常, 無顯著變化(圖2-A);田間觀察一直生長到小喇叭口期(七八葉期),phr-1與對照植株均無顯著差異; 大喇叭口期間逐漸表現出差異的矮化表型; 拔節期直至成熟期, 株高和穗位高差異極顯著。測量成熟期植株phr-1劍葉葉長和葉寬也無明顯差異, 但倒2葉和倒3葉相比CK明顯變窄、變長(圖2-B), 倒3葉葉長差異顯著,P＜0.05 (表3)。由于phr-1莖稈矮化粗壯, 觀察其根系發育, 次生根比對照更發達(圖2-C), 調查phr-1和KWS39開放授粉的果穗和籽粒性狀, 兩者果穗長、果穗寬、穗行數、行粒數、籽粒大小與百粒重無差異顯著性(圖2-D, E和表2)。說明PHR1基因主效控制玉米株高及穗位高, 對單株產量及百粒重等產量性狀無顯著負效應, 對產量沒有顯著影響。

圖2 野生型KWS39和突變體phr-1植株表型Fig. 2 Phenotype of KWS39 (CK) and phr-1 mutant plants

表2 突變體phr-1和野生型KWS39農藝性狀分析Tablel 2 Analysis of agronomic traits between KWS39 and phr-1 (mean±SD)

表3 F2分離群體的卡方測驗Table 3 Chi-square test of F2 population

2.2 phr-1的突變性狀是由核單基因隱性遺傳變異控制

將phr-1和自交系B73雜交, 收獲F1代植株, F1株高和穗位高與對照相當(圖3), 觀察F1自交, 構建F2群體, F2后代分離出矮稈突變體, 并對后代野生型植株和突變型植株進行統計, 統計1000株F2后代植株, 野生型與phr-1植株數量分別為762株和238株, 卡方檢驗結果表明野生型與突變體分離比例符合孟德爾單基因隱性遺傳3∶1比例分離, 表明phr-1株高和穗位高降低性狀是由核單基因隱性遺傳變異控制。

圖3 KWS39、phr-1、雜交F1和F2矮稈植株表型Fig. 3 Phenotype of KWS39, phr-1, F1 hybrid plant, and dwarf mutant in F2 plant

2.3 phr-1基因初步定位

為了克隆phr-1突變基因, 利用phr-1與B73雜交構建的F2分離群體進行初步定位。根據公共標記數據庫, 進行集團分離分析法(bulked segregation analysis, BSA)測序。根據BSA極端性狀混池測序原理, 提取親本KWS39、phr-1和B73親本各3株, 選擇phr-1×B73 F2子代池株高和穗位最高的植株60株,株高和穗位最低的植株60株, 混池提取其DNA, 建庫進行BSA測序。根據遺傳連鎖交換定律, 子代池的基因型會和表型產生共分離, 反應在物理圖譜層面, 與表型連鎖的染色體區段會和不連鎖的染色體區間產生穩定的SNP-index差異。根據差異初步確定候選基因區間位置。差異大小范圍為0～1。若該參數為0, 代表子代所有測到的Reads都來自野生親本; 若該參數為1, 代表子代所有Reads都來自突變親本; 該參數為0.5, 則代表此子代混池中SNP來自2個親本基因組的頻率一致。先將野生型和突變型分離群體2個DNA池篩選多態引物, 再進行全基因組的分析, 初步定位到候選基因區間, 位于1號染色體Bin1.06位置的約4 Mb區間內(圖4)。

圖4 phr-1候選基因的連鎖定位圖Fig. 4 Linkage map of phr-1 candidate genes

2.4 PHR1基因精細定位

根據Maize GBD (http://www.maizegdb.org/)網站的基因信息對定位區間內的序列進行分析, 設計多態性引物, 利用F2分離群體, 提取約500個單株進行候選基因的精細定位, 選擇1號染色體的初步定位區間附近約40對標記, 將候選基因縮小到umc1122和umc1583a兩個標記之間(表4)。候選基因更靠近umc1122, 目標區間約 600 kb, 查找該區間內已知基因功能, 發現存在一個已報道控制玉米株高的關鍵基因BR2, 表型與該突變體表型非常相似。推測目標基因可能是GRMZM2G315375。GRMZM2G315375基因全長6653 bp, CDS序列長4140 bp, 編碼氨基酸序列1380個。為了驗證該結果,在野生型KWS39和突變體phr-1中提取RNA, 反轉錄cDNA測序。參考基因組B73序列設計特異性引物, 對GRMZM2G315375基因完整編碼區擴增, 分析候選基因GRMZM2G315375與對照的序列堿基差異, 測序檢測發現phr-1突變體CDS序列第1636位置堿基發生突變, 插入了一段165 bp的堿基序列,導致氨基酸編碼錯亂, 在第546位氨基酸由P (脯氨酸)變成Q (谷氨酰胺), 第547位氨基酸變為終止子,蛋白翻譯提前終止(圖5)。查閱已報道的BR2基因變異位點, 沒有插入突變導致蛋白翻譯的提前終止。說明phr-1突變體的候選基因可能就是BR2基因,phr-1是BR2基因的一個新的等位突變體。

圖5 BR2轉錄本在KWS39和phr-1突變體中的序列分析Fig. 5 Sequence analysis of BR2 transcript between KWS39 and phr-1

表4 初步定位標記與表型的交換頻率Table 4 Crossing-over value of preliminary localization markers and phenotypes

2.5 等位突變體雜交后代表型鑒定

為了進一步驗證BR2基因就是控制phr-1株高和穗位高候選基因。在以B73自交系為誘變背景的EMS突變體庫中訂購了基因號為GRMZM2G315375,BR2基因的1個功能缺失突變體, 命名為br2-1(圖6),測序驗證br2-1突變體CDS序列第2382位置堿基發生突變, 由G變成A, 導致氨基酸編碼過程, 第794位氨基酸由W (色氨酸)變成終止子, 蛋白翻譯提前終止。br2-1株高和穗位高比對照B73極顯著降低,拔節期生長受阻, 不能正常長高, 但抽雄、散粉及吐絲都正常, 能正常結實, 單株產量及百粒重等產量性狀無顯著變化, 植株表型與phr-1非常相似, 將phr-1與br2-1進行正反交, 觀察了br2-1×phr-1F1植株表型, 株高和穗位高與2個突變體phr-1和br2-1的表型一致(圖6), 測序結果表明,phr-1的基因變化和突變方式與br2-1單個堿基發生變異位點完全不同,phr-1是第4個外顯子處, 插入了165 bp的堿基序列, 導致氨基酸編碼的提前終止。因此, 根據對候選基因全基因測序結果和兩個等位突變體的雜交等位驗證實驗, 確定phr-1突變體就是br2-1的一個新等位突變體,phr-1突變基因就是BR2基因。

圖6 等位鑒定突變體F1代表型一致Fig. 6 Generic identification of mutant F1 representative type is consistent

2.6 BR2基因表達分析

因發現phr-1突變體是br2-1的等位突變, 在B73、KWS39和突變體phr-1幼苗期和抽雄期采樣進行實時熒光定量PCR (Real-time Quantitative polymerase chain reaction, qPCR)。結果發現BR2在phr-1中的相對表達量均明顯低于對照(圖7), 由于基因突變造成轉錄水平的降低, 導致目標基因蛋白功能減弱或缺失, 蛋白翻譯提前終止, 不能發揮正常功能, 致使玉米株高和穗位高極顯著降低。

圖7 BR2基因在4個玉米自交系中的相對表達Fig. 7 Relative expression pattern of BR2 genes in four maize inbred line leaves

2.7 不同物種中BR2蛋白功能保守性及進化分析

在Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/annotation_pseudo_apk.shtml)數據庫中查找了GRMZM2G315375在其他物種的同源基因(表5), 在NCBI基因組數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行Blast比對, 搜索到相應基因的氨基酸序列, 使用 DNAMAN軟件構建了該基因的系統進化樹(圖8)。

(圖8)

表5 BR2在不同物種中的基因編號及功能注釋Table 5 Genetic code and function annotation of BR2 in different species

結果發現, 在水稻、擬南芥、玉米和高粱4個物種中的同源性為55.61%, 氨基酸序列重復較低,但是將玉米和高粱中序列進行比對, 同源性高達93.91%, 具有非常高的相似性(圖8-A), 同源樹和系統發育進化樹分析表明AtBR2和OsBR2在進化上相對保守(圖8-B, C)。而玉米和高粱中BR2蛋白同源關系更近。以上結果說明玉米中ZmBR2與高粱中SbBR2具有更保守的氨基酸序列和進化關系, 發揮相似的功能。

3 討論

BSA-Seq和BSR-Seq都是快速定位突變體候選基因的重要方法[13]。BSA-Seq是將2組DNA個體分別混合形成2個DNA池, 將這2個DNA池進行2組群體在多態位點的等位基因頻率比較, 考察是否有較為明顯的差異, 通過高密度分子標記再進行SNP的計算, 篩選出性狀相關聯的基因。BSR-Seq是轉錄組測序及集群分離分析法[11]。這2種方法定位基因簡單且快速, 并且節約成本, 得到了廣泛的應用[14-15]。Han等通過BSA方法快速將一個玉米多性狀突變體muw定位到2號染色體靠近著絲粒的位置,發現該位置存在一個大概5 Mb的片段缺失[16]。Cai等發現了一個控制玉米籽粒發育的突變體emp10,通過BSA方法定位到1號染色體末端位置且成功克隆目標基因[17]。本研究采用野生型和突變體各60株, 運用BSA快速將phr-1定位到BR2基因1號染色體末端的4 Mb區間內。

圖位克隆(map-based cloning)又稱定位克隆, 通過選用合適的分子標記對功能基因組中相對穩定的基因篩選DNA文庫, 根據遺傳連鎖原理通過染色體逐漸縮小目標基因所在區間, 進而克隆候選基因,最后再進行功能驗證[18]。圖位克隆作為基因克隆的方法之一, 在基因分離和克隆研究中得到了許多具有實際價值的基因在植物性狀研究中。牛靜等[19]利用圖位克隆方法克隆了水稻株型基因RAD1和RAD2,驗證該基因功能與生長素響應基因OsFH5等位。周文期等[20-21]利用圖位克隆方法, 克隆到控制水稻葉表皮形態建成相關基因LPL2和LPL3, 單基因功能缺陷導致水稻對干旱和鹽脅迫響應更敏感。呂洪坤等[22]通過圖位克隆的方法得到玉米d2003矮稈基因,通過序列分析和等位性檢驗表明是Vp8的等位基因。張素梅等[23]通過圖位克隆發現了一個玉米矮稈基因Dt, 并通過 RNA 干擾、過表達載體載體轉化驗證了Dt基因具有矮化功能。

玉米株高和穗位高決定著玉米的抗倒伏性和種植密度, 是影響玉米品質和產量的重要性狀之一[24]。因此, 研究控制玉米株高和穗位高的分子遺傳機制具有十分重要的理論和應用價值。前人在植物株高和穗位高研究中發現并克隆多個主效位點, 同時也證明了株高和穗位高之間互相關聯[2]。本研究通過對野生型KWS39和突變體phr-1的株高、穗位高、節間長度等多個農藝性狀的考察, 發現突變體phr-1成熟期相比于KWS39的株高穗位高極顯著降低。與前人研究進行比較, 在1號染色體Bin1.06區間內存在一個控制玉米株高和穗位高的BR2基因, 通過與突變體br2-1的等位鑒定, 確定phr-1是一個br2-1新等位變異突變體。BR2基因很早就被認為是最具有價值的玉米矮化基因。

玉米的株型會直接影響光照與有效輻射, 從而影響光合效率和產量。如果植株高而纖細則會因為對光競爭產生倒伏問題[25]。調查發現株高與植株體內物質積累呈現正相關, 并且矮株具有更高效的將物質轉化為籽粒的效率, 但是如果植株極端變矮,常常也會伴隨一些不良性狀, 進而影響產量[12]。雖然種植密度的增加是提高玉米產量的重要方向, 而高密度種植對玉米株型有著更高的要求條件, 株高和穗位過高容易發生倒伏, 也不能極度矮化, 降低了產量[2]。通過phr-1與KWS39的田間農藝性狀比較,phr-1株高及穗位高相比對照, 極顯著降低, 但不影響產量。phr-1的綜合性狀表明, 矮稈相較于高稈有利于通風和光照, 更適宜高密度種植[26]。前人研究也表明, 優良的綜合性狀使BR2基因在矮稈育種過程中發揮了重要作用, 其等位基因在生產上也被廣泛應用[27]。因此, 在玉米育種中對矮稈基因的發掘及功能解析越來越受重視, 利用理化誘變等不同方法, 創造或篩選新矮稈種質資源, 克隆株高和穗位高基因對玉米種質創新及生產應用都具有非常重要的意義[28-30]。

br2-1植株矮小, 節間數不變、但節間長度縮小,葉片直立, 綠色保持時間長。前人經過對不同突變體的鑒定、QTL定位以及圖位克隆等方法, 多個BR2等位突變體被鑒定和應用[28]。從玉米B73得到等位突變體br2-23, 該突變體在BR2基因的第5外顯子上發生了8 bp的堿基缺失, 編碼氨基酸因為移碼造成了200個氨基酸的缺失, 進一步影響了生長素的運輸而導致的植株矮化性狀[31]。同樣從B73中分離到矮稈材料NC238和br2進行等位雜交, 發現雜交的F1代沒有野生型的高稈表型, 推測NC238是BR2的一個等位突變體, 通過測序發現該突變體在BR2第4內含子上插入了一個572 bp的微型反向重復轉座元件(MITE), 造成了ZMABCB1的蛋白質結構發生了變化[32]。對玉米subr2進行等位基因分析及定位時發現, 在矮稈親本52220中BR2基因的最后一個外顯子上缺失了241 bp, 導致其編碼蛋白中NTP激酶結構域失去功能, 該突變體不僅降低了玉米穗位高和株高, 還可以少量增加莖稈直徑, 具備理想株型的增產潛能[33]。將突變體中BR2基因變異位點導入到正常植株, 可以通過縮短節間的長度來降低株高, 節間和葉片數目不會受其影響, 且導入系材料葉片保持綠色時間更久。另外, 研究表明BR2作為生長素的代謝途徑的關鍵基因, 不僅可以促進玉米的生長, 還會影響葉片的夾角[31]。符合高密度種植的理想株型的一個重要方面是葉片直立, 夾角減小, 所以這些都表明在玉米改良的進程中BR2基因都具有相當大的應用價值[31-32]。在本研究中, 突變體phr-1株高和穗位高極顯著降低, 其他部位發育正常, 正常結實, 百粒重無顯著差異, 推測該基因在玉米株型育種中可能有著重要的應用價值。

4 結論

本研究旨在定位玉米矮稈基因PHR1, 并初步闡明其生物學功能。通過等位雜交實驗證明了phr-1突變體就是br2-1的一個新等位突變體, 候選基因就是BR2基因。該研究豐富了BR2的遺傳材料并為株高性狀的遺傳改良提供重要的理論依據和基因資源。