利用CRISPR/Cas9技術編輯GmBADH1基因改變大豆耐鹽性

石宇欣 劉欣玥 孫建強 李曉菲 郭瀟陽 周 雅 邱麗娟,*

1東北農業大學農學院, 黑龍江哈爾濱 150030; 2農作物基因資源與遺傳改良國家重大科學工程 / 農業農村部種質資源利用重點實驗室 / 中國農業科學院作物科學研究所, 北京 100081

目前, 世界上約20%的可用耕地面積受土壤鹽漬化影響[1], 大豆耐鹽性的提升可有效利用鹽漬化土壤, 從而拓寬大豆種植面積, 增加大豆產能。非生物脅迫(如干旱、滲透壓、低溫、重金屬、臭氧、紫外線照射等)會導致植物代謝的改變, 包括光合作用受抑制、活性氧(ROS)生成、膜組織混亂以及營養缺乏等[2]。作為對滲透脅迫的響應, 甘氨酸甜菜堿通過穩定蛋白質結構和調節細胞質中的滲透勢來調節細胞水位, 從而導致細胞耐受。甜菜堿是季銨化合物。具有很高的溶解度, 在生理pH范圍內甜菜堿不帶靜電核, 是一個電中性分子[3]。甜菜堿脫氫酶是甘氨酸的衍生物, 是許多植物體內對抗非生物脅迫重要的滲透調節劑, 具有穩定生物大分子結構和功能的作用[4]。BADH(betaine aldehyde dehydrogenase)編碼甜菜堿脫氫酶, 在植物中, 甘氨酸甜菜堿是通過兩步氧化合成的, 先由膽堿加氧酶(CMO)將膽堿催化生成甜菜堿醛, 而后甜菜堿醛在甜菜堿脫氫酶(BADH)的催化作用下形成甜菜堿[5]。非生物脅迫下, 植物細胞質中甜菜堿通過甜菜堿醛積累, 經過甜菜堿在滲透途徑的作用, 液泡與細胞質、細胞與環境的滲透勢差被平衡, 從而保護細胞免受傷害, 降低非生物脅迫帶來的有害影響[6]。因此甜菜堿作為滲透途徑中的應激保護劑,是植物抵抗有害氧化分子的策略之一[7]。1990年Weretilnyk等[8]首次在菠菜中將BADH基因克隆出來, 后續實驗也證明其在抗旱耐鹽等逆境脅迫中發揮重要作用。目前在菠菜、大麥[9]、香蕉[10]、茶樹[11]等植物中均克隆出BADH基因。利用轉基因技術將BADH基因轉入番茄[12]、玉米[13-14]、羽衣甘藍[15]中, 在不同程度上均提高了其對非生物脅迫的抵抗能力。2013年李秀英和王丕武[16]將BADH基因利用轉基因技術導入到大豆中, 用于提高萌發期大豆抗旱、抗鹽堿的能力, 最終獲得了與未轉化受體相比耐鹽性顯著提高的轉基因株系。眾多的研究表明,BADH在增強植物對于非生物脅迫的抵抗能力具有重要作用, 但是BADH基因對于大豆在鹽脅迫中的適應性作用以及對于大豆不同時期的耐鹽調控機制尚未可知。

簇狀規則間隔短回文重復序列-核酸蛋白酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR-Cas9)為靶向基因組編輯和基因功能的研究提供了一種有效的方法, 已經成為最先進的系統之一[17], 并為反向遺傳學研究提供了新思路。相較于傳統的基因編輯技術基因敲除不完整、外源基因隨機插入的缺點, CRISPR/Cas9系統相對穩健, 可實現目標性狀的精準改良, 從而獲得具有特定優異性狀的育種資源[18]。目前CRISPR/Cas9系統已經廣泛用于多種作物, 如水稻、小麥、玉米等主要作物。Zhang等[19]利用基因編輯靶向突變OsALS基因的密碼子, 產生了對ALS抑制除草劑具有廣譜耐受性的水稻植株。Li等[20]利用CRISPR/ Cas9技術編輯TaNP1三個同源等位基因, 獲得小麥雄性不育突變體。Luo等[21]利用CRISPR系統敲除YIGE1, 玉米雌蕊花序分生組織大小、穗長均減小。Jacobs等[22]在2015年首次報道了利用CRISPR/ Cas9技術對大豆進行定點誘變, 這為大豆基因組編輯奠定了良好基礎。此后CRISPR系統被廣泛用于大豆的基因功能驗證和優異品種改良。

本研究中利用CRISPR/Cas9系統構建敲除載體,發根農桿菌進行載體驗證, 通過農桿菌介導的遺傳轉化技術將CRISPR/Cas9表達載體引入JACK品種中, 定點敲除GmBADH1基因, 通過分子檢測篩選純合等位突變, 并分析突變體對大豆出苗期和苗期耐鹽性狀的影響, 為探究GmBADH1基因在不同時期對于耐鹽性狀的調控提供理論基礎, 對于進一步解析GmBADH1基因功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與器材

大豆品種JACK為轉化受體, 2021年7月獲得CRISPR/Cas9編輯的T0轉基因植株, T1、T2在溫室種植, T3在順義試驗站種植, 用于繁種以及表型鑒定。

1.2 RNA提取和qRT-PCR分析

選取飽滿的野生型種子分成2組進行萌發, 萌發長根后, 以150 mmol L–1鹽溶液和水溶液進行處理。處理后分別在2 h、8 h、24 h取根、莖、葉3個組織的RNA樣品。利用天根生化科技(北京)有限公司RNA試劑盒提取植物組織RNA。北京全式金生物技術有限公司EasyScript一步法gRNA去除及cDNA合成試劑盒進行反轉錄獲得cDNA, 反轉錄產物稀釋20倍后作為模板用于熒光定量。利用Primer5設計熒光定量引物,Actin-18g290800(Glyma18g52780)為內參基因[23-24]。北京全式金生物技術有限公司PerfectStart Green qPCR SuperMix (+Dye II)試劑盒進行熒光定量。qRT-PCR的反應體系為模板2 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 7.2 μL, PerfectStart Green qPCR SuperMix (+Dye II) 10 μL。程序參照說明書, 每個處理3個重復, 并使用2–ΔΔCT方法計算基因相對表達量。Excel表格進行數據分析以及作圖。相關引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 CRISPR/Cas9表達載體構建

利用NCBI查找水稻BADH1基因CDS序列, 參考序列為大豆參考基因組GlycinemaxWm82.a2.v1。通過BLAST功能找到大豆BADH1基因的CDS序列,利用CRISPRv2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)設計基因GmBADH1的sgRNA,位于基因的第一外顯子上,GmBADH1靶點序列為sgRNA-BADH1: AAGTCCCCGTCCTCAAGAATCGG,PAM序列為CGG, 通過NCBI進行BLAST檢測靶點特異性, 在線網站(https://cctop.cos.uni-heidelberg/預測脫靶效應, 將所構建的CRISPR/Cas9載體, 利用橋式PCR將擬南芥U6啟動子序列、sgRNA和zCas9依次連接后, 克隆到載體pBSE401質粒,In-fusion構建敲除載體pGmBADH1-g1, 利用熱激轉化將編輯載體轉入大腸桿菌中, 發根農桿菌K599進行載體驗證。

1.4 農桿菌介導大豆子葉節遺傳轉化

采用電擊轉化將表達載體轉入農桿菌EHA105中, 選擇大豆品種JACK為遺傳轉化材料。轉化由天津吉諾沃生物科技有限公司完成。挑選外表飽滿、光滑的大豆種子于培養皿中, 75%的酒精清洗后擦干, 放入玻璃培養皿。通風櫥內滅菌后, 在超凈臺中放置30 min, 加無菌水浸泡9～16 h使種子萌發。農桿菌充分活化至OD650為0.6～0.7, 用手術刀切去種子1/2下胚軸, 將胚軸縱向切開, 去掉頂芽及側芽,在生長點輕輕劃4～6道傷口, 將子葉節外植體放在重懸的農桿菌菌液中, 放入25℃培養箱中侵染2 h。侵染完成后用無菌濾紙吸干多余的菌液, 將浸染后的外植體有傷口一側朝下平鋪于濾紙上, 26℃黑暗條件下共培養2～5 d, 光照條件下共培養1 d, 將長出的下胚軸切除, 放入組培室中26℃、16 h光照、培養5 d。當伸長芽至3～4 cm時, 從基部將伸長芽與叢生芽分開, 接種至生根培養基中進行根誘導。待生根2周后, 煉苗3～5 d, 利用Bar試紙條篩選陽性植株。

1.5 轉基因陽性植株篩選及突變類型分析

利用CTAB法[25]提取T0、T1、T2轉基因植株全基因組DNA作為模板, 結合靶點周圍設計的特異性檢測引物進行擴增, PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并送至中國農業科學院重大工程樓測序平臺進行測序。通過峰圖判斷突變類型, 野生型與純合突變為單峰, 雜合突變在靶點之后顯示亂峰, 將野生型與純合突變進行比對, 可進一步確定靶標的變異。利用CAS9引物可進一步篩選無轉基因成分的靶向突變體(檢測引物D-GmBADH1-F/R與CAS9引物zCAS9-F/R見表1) 。

1.6 耐鹽表型鑒定

分別對純合突變材料以及野生型材料進行出苗期和苗期的耐鹽鑒定, 每種編輯類型選擇至少來自3個株系的種子, 種于裝有蛭石的8 cm × 8 cm × 6 cm的小花盆中, 每個株系種3個小花盆, 每個小花盆種10粒, 以野生型JACK為陰性對照, 以劉謝香等[26]鑒定出的耐鹽材料中黃39與鹽敏感材料NY27-38為陽性對照。出苗期參照劉謝香等[26]以150 mmol L–1NaCl處理, 并以RO水為對照處理組, 從第4天開始記錄成苗數, 直至第15天評級; 苗期參照Guan等[27], 于真葉完全展開后(10 d), 每隔3～4 d進行一次鹽處理, 共處理3次, 鹽濃度為200 mmol L–1, 第3次處理后(約20 d)進行評級, 評定標準如表2。

表2 鹽脅迫后大豆出苗期和苗期的鹽害癥狀Table 2 Symptoms of soybean at emergence and seeding stages under salt stress

2 結果與分析

2.1 GmBADH1基因表達模式分析

2.1.1GmBADH1基因在不同組織中的表達模式分析 為了探究不同組織中GmBADH1基因的表達情況, 分別以JACK多個組織的cDNA為模板, 通過qRT-PCR確定基因表達量。結果顯示GmBADH1基因在各個組織中均有表達, 根中的表達量更高(圖1-A)。

圖1 GmBADH1基因表達模式分析Fig. 1 Relative expression pattern of GmBADH1 genes

圖2 GmBADH1的gRNA靶點和pBSE401-GmBADH1-g6表達載體重組示意圖Fig. 2 Target sites of the gRNA in the GmBADH1 gene and recombining diagram of the pBSE401-GmBADH1-g6 vector

2.1.2GmBADH1基因在不同鹽處理時間下的表達模式分析 為了了解GmBADH1基因在鹽脅迫處理下的基因表達量差異, 以鹽脅迫后各組織的cDNA為模板, 進行qRT-PCR以確定其表達模式,結果發現根、葉組織在鹽處理后該基因表達量顯著高于水處理組, 說明該基因響應鹽脅迫(圖1-B)。

2.2 CRISPR/Cas9載體構建

為了研究大豆GmBADH1的基因功能, 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對GmBADH1基因進行敲除, 基于大豆參考基因組(Glyma.Wm82.a2.v1)序列, 在該基因第一外顯子處設計sgRNA, 并將其連接到CRISPR/Cas9的載體, 通過發根農桿菌K599檢測編輯載體活性。結合Bar試紙條檢測, 共獲得3個陽性株系。

2.3 GmBADH1功能缺失突變體的篩選與鑒定

利用CTAB法分別提取T1和T2幼嫩葉片DNA,PCR擴增靶標位點, 測序分析突變類型。結果表明,T1共檢測127株轉基因植株中, 有8株發生了突變,突變率為6.3%; T2代共檢測108株轉基因植株, 有10株純合植株, 陽性率為9.3%。在3個不同株系, 共檢測到3種主要類型的突變。將獲得的不同類型的純合突變體分別命名為BADH1-L1、BADH1-L3、BADH1-L4。經測序分析表明, 突變植株BADH1-L1在靶點處插入了1個堿基, 導致翻譯的氨基酸提前終止, 僅編碼32個氨基酸; 突變植株BADH1-L3在靶點附近插入9個堿基, 替換了2個堿基, 有7個氨基酸發生變化; 突變植株BADH1-L4在靶點附近缺失19個堿基, 導致氨基酸翻譯提前終止, 僅編碼29個氨基酸(圖3-A和表3)。利用PFAM網站預測, 該基因只有一個功能結構域Aldedh, 位于第18到485位氨基酸之間。突變體BADH1-L1、BADH1-L4短蛋白的產生導致了功能結構域的缺失, 突變植株BADH1-L3的移碼突變導致結構域被破壞。綜合3代檢測結果發現CRISPR/Cas9介導的GmBADH1的基因突變可以從T1穩定的遺傳到T3, 并保持相同類型(圖3)。

圖3 T1和T2純合突變體篩選Fig. 3 Screening for homozygous mutation in T1 and T2 generation

表3 純合突變體編輯基因型Table 3 Editing genotypes of homozygous mutants

表4 CRISPR介導BADH1基因T1～T2靶向突變植株數Table 4 The number of CRISPR-mediated T1–T2 targeted mutant plants of BADH1 gene

2.4 潛在脫靶位點分析

為了確定CRISPR/Cas9表達載體是否存在潛在非靶點處變異對表型影響的可能性, 利用CCTOP[28](https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/)對潛在的脫靶位點進行預測, 以sgRNA-BADH1為目標預測, 共預測到19個與目標靶點相似的潛在靶點, 其中4個位于基因編碼區(表5)。根據這4個位點設計特異性引物, 以T3純合突變體基因組DNA為模板進行擴增, 經PCR測序分析發現, 并未檢測到潛在脫靶位點的變異, 說明sgRNA僅對靶標進行了特異性編輯。

表5 BADH1-Target的潛在的脫靶位點預測Table 5 Potential miss site prediction of BADH1-Target

2.5 無轉基因植株篩選

為了獲得具有純合突變并不含T-DNA元件的轉基因植株, 排除Bar和Cas9的潛在干擾, 首先利用PAT/Bar試紙條鑒定選擇性標記基因Bar, 獲得14個陽性植株(圖4-A), 并使用PCR擴增技術檢測T-DNA上的CAS9。結果如圖4-B所示, 14個陽性植株共獲得11個無Cas9序列的突變體(表6)。

圖4 陽性鑒定與轉基因成分鑒定Fig. 4 Positive identification and identification of transgenic components

表6 無轉基因檢測Table 6 Transgene-clenn homozygous mutants

2.6 突變體耐鹽表型分析

為探究GmBADH1基因正向調控鹽脅迫, 對突變體以及野生型植株進行了出苗期和苗期的耐鹽鑒定。出苗期耐鹽鑒定顯示, 突變植株BADH1-L1、BADH1-L3、BADH1-L4較野生型相比耐鹽性均下降;苗期耐鹽鑒定結果顯示, 3種突變體耐鹽性與野生型相比無差異, 說明GmBADH1的變異僅對出苗期耐鹽性進行調控, 而與苗期耐鹽性無關(表7和圖5)。

圖5 出苗期突變體耐鹽表型鑒定Fig. 5 Identification of salt tolerance phenotype of mutant at seedling stage

表7 GmBADH1純合植株耐鹽鑒定Table 7 Salt tolerance of GmBADH1 homozygous plants

3 討論

近年來隨著基因編輯技術的不斷發展, CRISPR/Cas9系統已被廣泛用于包括大豆在內的各種作物基因功能研究。傳統的轉基因技術外源基因在植物染色體中的隨機整合可能會導致植物內源基因的破壞、基因沉默或其他不良現象, 因此傳統的轉基因技術常常受限。Jacobs等[22]首次報道了利用CRISPR/Cas9技術對大豆進行定點誘變, 為大豆基因組編輯奠定了良好基礎; Han等[29]利用CRISPR/Cas9敲除開花基因E1, 獲得早花純合突變體, 為培育適合高緯度地區的早熟轉基因受體提供了物質支持; Cheng等[30]利用CRISPR/Cas9介導GmLHY基因定點突變降低了大豆株高、并縮短了節間長度, 為解析大豆株高調控網絡的潛在機制提供了基礎;GmIPK1基因[31]編輯獲得純合突變體, 降低了大豆種子中植酸含量;GIGANTEA同源基因編輯產生功能缺失等位變異能夠同時提高大豆對鹽的耐性和促進大豆早花早熟[32]。目前并沒有研究報道將CRISPR/Cas9技術用于GmBADH1基因以探究其與大豆耐鹽性之間的聯系, 本研究利用CRISPR/Cas9系統進行定點編輯,并獲得3種穩定遺傳的純合突變體材料。

甜菜堿脫氫酶在抵御非生物脅迫上的重要作用,已在多種作物中有所報道。將BADH基因轉化到鹽敏感的番茄材料中提高番茄對鹽的耐受性[33]。OsBADH1轉化到煙草中提高了煙草耐鹽性[34]。RNAi[35]沉默OsBADH1基因獲得的突變體與野生型相比耐鹽性下降。由此可見,BADH1基因可能正向調控植物對鹽脅迫的耐受性。本研究對獲得的純合突變體進行耐鹽鑒定, 得到了相似的結論。He等[36]、Fitzgerald等[37]的研究表明OsBADH1基因只調控水稻發芽和幼苗階段耐鹽性, 說明不同發育時期存在著不同的耐鹽調控機制。本研究中對3個純合突變體分別在出苗期和苗期做耐鹽鑒定, 結果表明在出苗期均降低了耐鹽性, 而在苗期無影響,這表明GmBADH1主要對大豆出苗期耐鹽性起正向調控作用。

鹽害脅迫會造成細胞滲透勢減小, 因此土壤中的水分很難被植物根部吸收, 導致植物根部缺水,出現生理性脅迫, 產生植株萎蔫葉片枯黃的現象, 說明植株受到脅迫可能與根組織的發育情況有關[38]。在本研究中基因表達分析表明,GmBADH1基因在根、莖、葉中均有表達, 鹽脅迫下,GmBADH1基因在根中表達量顯著高于水處理組, 說明GmBADH1基因主要響應在植株地下部。當植株受到土壤給予的鹽害脅迫時, 土壤中大量Na+和Cl–會從根部向地上部運輸, 導致植株受到損傷, 甜菜堿大量合成, 甜菜堿可以阻斷Na+和Cl-向上運輸的速度和數量, 促進K+的運輸, 從而減弱鹽害帶給植株的不利影響[39]。

由于基因編輯存在脫靶效應, 這種效應會導致染色體重排, 在不完全匹配的基因組處造成損傷,還可能導致功能活性的喪失, 從而導致各種生理信號異常[40]。因此為了減輕這種脫靶效應帶來的危害,本研究還利用CCTOP網站對靶點進行預測, 在靶點處預測到4個發生在編碼區的潛在脫靶位點, 并對純合敲除株系的全基因組DNA進行PCR擴增測序發現, 未檢測到潛在的脫靶位點, 說明sgRNA僅對靶標進行了特異性編輯, 這大大減小了脫靶效應帶來負面影響。得到的純合突變體后續也可以通過育種過程表型篩選來消除脫靶突變或自發突變[40]。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9技術編輯GmBADH1基因, 利用農桿菌介導的大豆遺傳轉化技術將載體轉入受體JACK中, 經轉基因檢測共獲得3種可穩定遺傳并不含T-DNA插入的功能缺失突變體, 耐鹽鑒定結果表明大豆缺失GmBADH1基因后在出苗期耐鹽性顯著下降, 而在苗期無影響, 說明該基因主要對大豆出苗期耐鹽性起正向調控作用, 這為我們深入挖掘大豆不同時期的耐鹽調控基因, 提供了依據。