轉基因抗蟲耐除草劑玉米自交系LG11的獲得及抗性分析

岳潤清 李文蘭 孟昭東

山東省農業科學院玉米研究所 / 小麥玉米國家工程實驗室 / 農業農村部黃淮海北部玉米生物學與遺傳育種重點實驗室, 山東濟南 250100

玉米是當今世界三大作物之一, 用途廣泛, 包括食用、飼料、種用和工業用途等, 在我國糧食生產中占重要地位。我國玉米種植面積穩定在4200萬公頃, 蟲害是影響其產量及品質的重要問題之一[1-2]。其中, 亞洲玉米螟是我國各玉米產區最主要的害蟲之一, 常年發生面積在2000萬公頃以上[3-5]。轉基因抗蟲玉米新品種具有很好的田間抗螟性, 不僅能減少化學殺蟲劑的使用, 保護生態環境, 還能提高農民收入[1-2]。田間雜草與作物競爭水、肥、光能及生長空間, 也是影響玉米產量與品質的重要生物限制因子之一。有效控制田間雜草是促進糧食增產的重要措施之一[6]。另外, 隨著我國農村人口往城市遷移速度的加快, 傳統的人工除草方式變得不現實, 在玉米生長期噴施除草劑解決田間雜草是可行方法。因此, 培育抗蟲耐除草劑轉基因玉米新品種具有非常廣闊的應用價值和市場潛力。

蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)是一種革蘭氏陽性土壤細菌, 在芽胞形成過程產生的殺蟲蛋白晶體(insecticidal crystal protein, ICP), 對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等多種害蟲具有特異的殺蟲作用[7]。自1981年第一個Bt殺蟲蛋白基因被克隆和測序以來, 已克隆和分類了993個Bt毒素編碼基因(801個Cry基因、40個Cyt基因和152個Vip基因),其中,Cry基因編碼的Cry蛋白因其強大的生物活性而被廣泛應用[8]。目前, 全球應用最廣的抗蟲玉米主要是表達Cry和Vip類殺蟲蛋白的轉基因玉米, 種植面積達550萬公頃[9]。大面積持續種植轉基因玉米,會引發靶標害蟲產生抗性。例如, 草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda對巴西種植的表達Bt Cry1Ab或Bt Cry1F的玉米產生抗性[10-11], 歐洲玉米螟Ostrinianubilalis對加拿大種植的表達Bt Cry1F的玉米產生抗性[12]。為了阻止或延緩靶標害蟲抗性種群的發生, 各國學者提出了抗性治理策略IRM (insect resistance management), 目前應用最為廣泛的主要有“高劑量/庇護所” (high dose/refuge)策略和“多基因” (pyramid)策略[13]。其中, “多基因”策略是指在同一株植物中同時導入2個或多個沒有交互抗性的針對同一靶標害蟲的抗蟲基因, 減小轉基因植物產生抗性的風險[12]。國內現有的抗蟲轉基因玉米基本都是導入的單一抗蟲基因, 或者通過將含不同單一抗蟲基因的材料雜交, 篩選同時含有2個或以上抗蟲基因的材料, 只有瑞豐125是直接轉化的融合基因[14], 除此之外并沒有利用融合基因進行抗蟲轉基因的報道。

bar基因最初來源于吸水鏈霉菌, 編碼膦絲菌素乙酰轉移酶(phosphinothricinacetyhransferase,PAT), 作用底物是膦絲菌素(phosphinothricin, PPT),屬于除草劑草銨膦的活性成分[15]。草銨膦(glufosinate)是一種廣譜高效、低毒有機磷除草劑,能通過植物的葉片或其他綠色部分被快速吸收, 強烈抑制細菌和植物的氨基酸生物合成酶—谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的活性, 導致細胞內氨的含量迅速積累, 從而直接抑制光系統I和光系統II反應, 減少跨膜pH梯度, 使光合磷酸化解偶聯, 隨之葉綠體結構解體, 最后整個植物體死亡。PAT可以催化乙酰輔酶A使除草劑草銨膦的活性成分膦絲菌素PPT的自由氨基發生乙酰化, 從而對PPT解毒, 使之不能抑制GS的活性[15]。目前, 轉bar基因的耐除草劑轉基因玉米已被廣泛種植, 種植面積達560萬公頃[9]。

近年來單一性狀轉基因作物種植面積比例逐年降低, 復合性狀轉基因作物種植面積比例逐年攀升,2015年更是達到了33%的高度, 2018年全球種植聚合抗蟲/耐除草劑玉米達4780萬公頃[9], 這說明復合性狀逐漸成為轉基因作物開發的重要特性。分子聚合方法(構建多基因聚合載體)因其較低的篩選工作量以及單位點的插入將是未來開發復合性狀的主要策略[16]。本課題使用的抗蟲蛋白是利用人工合成方法將Cry1Ab和Vip3Aa蛋白的主要結構域組合形成的融合蛋白M2cryAb-vip3A, 這2種殺蟲蛋白在進化上沒有同源性且殺蟲機理存在差別, 能有效降低靶標害蟲產生抗性的幾率。本研究擬通過轉基因方法將m2cryAb-vip3Aa和bar基因串聯導入受體材料,并以骨干自交系昌7-2為回交親本進行回交轉育,獲得抗蟲耐除草劑且擁有優良農藝性狀的轉基因玉米新材料, 并對抗蟲性和耐除草劑抗性進行分析。研究結果將豐富現有的抗蟲耐除草劑玉米種質資源, 并為玉米田間害蟲防治和雜草治理提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

轉基因所用的受體材料為HiIIB, 回交轉育親本為昌7-2。qRT-PCR分析利用的組織包括苗期的葉片、根、莖, 吐絲期的根、葉, 成熟期的根、葉、籽粒等, 取樣時每3株為1個重復, 共3次重復, 樣品置于–80℃冰箱保存備用。

1.2 轉化體LG11的獲得

m2cryAb-vip3Aa融合蛋白的分子量和等電點使用“pI/Mw”工具進行預測, 結構域使用SMART和PFAM軟件進行預測。將m2cryAb-vip3Aa連接入載體pCAMBIA3300的XbaI和SacI位點, 構建成植物轉化載體pCAMBIA3300+m2cryAb-vip3Aa。通過農桿菌介導的玉米幼胚轉化方法將該表達載體導入受體材料HiIIB中, 經抗性篩選獲得陽性轉基因植株, 再以昌7-2為回交親本進行5代回交轉育, 篩選獲得優異轉化體LG11。

1.3 PCR檢測

選取BC4F2、BC5F2代LG11和對照昌7-2的植株幼嫩葉片進行基因組DNA提取, 通過普通PCR方法檢測目的基因在基因組中的整合情況。m2cryAbvip3Aa基因引物序列為J1-F: 5'-ATCTCGTCCAGCG TCAGGT-3'和J1-A: 5'-TCAACATCGGCATCAAC AA-3',bar基因引物序列為J2-F: 5'-CTGAAGTCC AGCTGCCAGAA-3'和J2-A: 5'-ATGAGCCCAGAA CGACGC-3'。

1.4 Southern雜交

以轉化體LG11和對照昌7-2植株的幼嫩葉片為材料提取基因組DNA, 利用BamH I和Hind III兩種限制性內切酶對BC4F2～BC5F2代LG11和昌7-2的基因組DNA進行酶切并純化; 根據目的基因的特異序列設計引物(m2cryAb-vip3Aa基因引物序列為s1-F:5'-ATCTCGTCCAGCGTCAGGT-3'和s1-A: 5'-TCAA CATCGGCATCAACAA-3',bar基因引物序列為s2-F:5'-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAA-3'和s2-A: 5'-AT GAGCCCAGAACGACGC-3'), 通過PCR方法合成探針; 將酶切后純化的基因組DNA進行電泳并轉膜;將膜放于雜交管中進行預雜交和雜交(加入適量探針), 再經過洗膜和顯影, 利用用蛋白成像掃描儀掃描尼龍膜, 即可觀察Southern雜交結果。

1.5 RNA提取和實時定量PCR分析

利用天根生化科技(北京)有限公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA, 按照反轉錄試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化。樣品處理后采用qRT-PCR方法進行定量檢測, 檢測完成后根據儀器生成的內參基因和目標基因的平均Ct(擴增循環數)值, 根據公式RQ=2–?Ct, 計算對應樣本相對于內參基因表達量的倍數。將數據進行統計學分析, 結果以平均值±標準誤表示, 根據結果分析目的基因在轉錄水平的時空表達模式。以zSSIIb作為內參基因。內參基因zSSIIb引物序列為zSS IIb-F: 5'-C GGTGGATGCTAAGGCTG-3'和zSS IIb-A: 5'-AAAG GGCCAGGTTCATTATCCTC-3',m2cryAb-vip3Aa引物序列為Q1-F: 5'-GTTTCCTTTACCGGGGACGA-3'和Q1-A: 5'-ACCACCCCCTTCAACTTCAG-3',bar引物序列為Q2-F: 5'-CAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3'和Q2-A: 5'-GTCAACTTCCGTACCGAGCC-3'。

1.6 對靶標害蟲的抗蟲性分析

室內試驗用人工飼料連續飼養多代的未接觸任何化學農藥制劑或抗蟲蛋白的亞洲玉米螟和草地貪夜蛾的室內敏感品系作為試蟲, 使用離體玉米葉片和花絲喂食初孵幼蟲, 評價材料對亞洲玉米螟和草地貪夜蛾的抗性。剪取玉米第2新葉或第3新葉2～4 cm長的葉片(或玉米2～4 cm長的花絲), 放入培養皿中, 皿底鋪上用無菌水潤濕的濾紙保持高濕狀態,每皿接入10頭試蟲的初孵幼蟲(孵化2～12 h), 每材料設4個重復。在溫度(25±1)℃、濕度50%、L∶D=14∶10條件下培養, 6 d后檢查試蟲的存活情況。死亡率和校正死亡率按下列公式計算, 并按照表1劃定抗蟲性水平。

表1 室內生物測定抗蟲性評價標準Table 1 Criteria for evaluation of insect resistance in laboratory bioassay

1.7 除草劑草銨膦耐受性分析

在轉基因玉米和對照材料長至三葉一心至五葉一心時噴施保試達(Basta), 其有效成分草銨膦的含量為18%, 換算成草銨膦有效成分為674.66 g hm–2進行噴施。試驗設計參照《轉基因植物及其產品環境安全檢測抗除草劑玉米第1部分: 除草劑耐受性》(農業農村部953號公告-11.1-2007)執行。除草劑噴施劑量分別為噴施清水(0×)及田間推薦劑量中量的1倍(1×, 674.66 g hm–2)、2倍(2×, 1349.33 g hm–2)和4倍(4×, 2698.65 g hm–2)。在用藥1、2和4周后分別調查記錄成苗率、植株高度(選取最高的5株)和藥害癥狀(全區調查)。藥害癥狀分級按GB/T 19780.42執行, 除草劑受害率按公式(3)計算。

式中,X為受害率, 單位為百分率(%);N為同級受害株數;S為級別數;T為總株數;M為最高級別。

2 結果與分析

2.1 轉基因抗蟲耐除草劑玉米LG11的獲得

Cry1Ab來自蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt), 編碼一種具有高度特異殺蟲活性的晶體蛋白(insecticidal crystal protein, ICP),Vip3編碼的蛋白是Bt在營養期分泌的完全不同于ICP的一種殺蟲蛋白,這2種殺蟲蛋白在進化上沒有同源性并且殺蟲機理存在差別。為了有效降低害蟲產生抗性的幾率, 我們利用人工合成的方法將Cry1Ab和Vip3Aa蛋白的主要結構域組合形成融合蛋白M2cryAb-vip3Aa。目的基因m2cryAb-vip3Aa的核苷酸序列長度為4287 bp,編碼的蛋白包含1428個氨基酸, 預測的分子量大小為159.2 kD, 等電點為5.26, 包含Vip3Aa-N、Endotoxin-C、Endotoxin-M、Endotoxin-N和CBM-4-9等結構域(圖1); 目的基因m2cryAb-vip3Aa的啟動子來自于花椰菜花葉病毒的CaMV 35S啟動子, 大小為346 bp; 終止子來源于Ti質粒的NOS終止子, 大小為253 bp。通過農桿菌介導法將包含m2cryAb-vip3Aa表達盒和bar表達盒的載體pCAMBIA3300+m2cryAb-vip3Aa導入HiIIB受體, 獲得T0代轉基因植株, 將昌7-2 (具有優異農藝性狀的骨干自交系)作為輪回親本進行5代連續回交轉育, 篩選到抗蟲耐除草劑的優異轉基因玉米株系LG11。

圖1 M2cryAb-vip3Aa蛋白的結構域預測Fig. 1 Domain prediction of M2cryAb-vip3Aa protein

2.2 m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11中的分子檢測

為了分析外源插入目的基因在LG11轉化體中的整合情況, 我們通過PCR方法對BC4F2和BC5F2代LG11植株中的外源插入目的基因m2cryAbvip3Aa和bar進行了檢測(圖2)。外源插入片段在不同世代中均能擴增出目的條帶, 表明LG11的外源插入序列已穩定整合進玉米基因組內。

圖2 轉化體LG11目的基因的PCR檢測Fig. 2 Detection of target genes of LG11 by PCR

此外, 我們還通過Southern雜交方法進一步確認LG11轉化體中目的基因整合進基因組的情況,并檢測其插入拷貝數。選取BamH I和Hind III兩種限制性內切酶對BC4F2～BC5F2代LG11的基因組DNA進行酶切, 并以目的基因m2cryAb-vip3Aa和bar的特異區段序列為模板合成探針進行Southern雜交, 結果如圖3所示。雜交結果顯示BC4F2代轉化體LG11、BC5F1代轉化體LG11和BC5F2代轉化體LG11均出現了特異性條帶, 這表明m2cryAb-vip3Aa和bar基因均成功整合進轉化體LG11的基因組中,均為單個拷貝且穩定遺傳。

圖3 目的基因m2cryAb-vip3Aa和bar的Southern雜交結果Fig. 3 Southern hybridization of target genes m2cryAb-vip3Aa and bar

2.3 m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11轉化體中的表達分析

為了更好的了解m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11轉化體中的表達模式, 我們利用qRT-PCR方法檢測了m2cryAb-vip3Aa和bar基因在BC5F2代LG11轉化體主要組織器官中的表達情況(表2)。m2cryAbvip3Aa基因在BC5F2代LG11轉化體的組織器官中均有表達, 在苗期葉片中表達量最高, 在成熟期葉片中表達量最低。bar基因在BC5F2代LG11轉化體組織器官中也均有表達, 在苗期根中表達量最高, 在吐絲期根中表達量最低。實驗結果說明外源基因m2cryAb-vip3Aa和bar在LG11轉化體中呈組成型表達, 但不同發育時期的不同組織器官中表達量存在差異。

表2 轉化體LG11外源基因的表達模式分析Table 2 Relative expression pattern of the exogenous genes in LG11 transformants

2.4 LG11轉化體對靶標害蟲的抗性分析

為了評價LG11轉化體對靶標害蟲玉米螟和草地貪夜蛾的抗性, 我們通過室內人工接蟲和田間人工接蟲2種方法對LG11轉化體的抗蟲性進行了分析。離體葉片人工接蟲后, 啃食LG11的玉米螟全部死亡, 葉片近乎完整, 而對照昌7-2中的玉米螟則正常進食, 死亡很少(圖4-A, B)。離體葉片的室內生測統計結果(表3)顯示, BC5F2代LG11葉片造成的玉米螟死亡率為100.00%, 顯著高于對照(10.00±1.50)%,以此計算的校正死亡率為100.00%, 表明LG11葉片對玉米螟的抗性級別為高抗; BC5F2代LG11葉片造成的草地貪夜蛾死亡率為97.50%, 顯著高于對照(2.50±0.50)%, 以此計算的校正死亡率為97.44%, 表明LG11葉片對草地貪夜蛾的抗性級別為高抗。離體花絲人工接蟲后, 啃食LG11的玉米螟全部死亡, 花絲基本完整, 而對照昌7-2中的玉米螟則正常進食,花絲被啃食嚴重(圖4-C, D)。花絲的室內生測統計結果(表3)表明, BC5F2代LG11花絲造成的玉米螟死亡率為100.00%, 顯著高于對照(7.50±4.80)%, 以此計算的校正死亡率為100.00%, 表明花絲對玉米螟的抗性級別為高抗; BC5F2代LG11花絲造成的草地貪夜蛾死亡率為100.00%, 顯著高于對照(7.50±5.00)%,以此計算的校正死亡率為100.00%, 表明花絲對草地貪夜蛾的抗性級別為高抗。

圖4 玉米心葉期葉片和玉米花絲對玉米螟室內生測結果(接蟲后5 d)Fig. 4 Laboratory bioassay of maize leaves at heart leaf stage and maize silks on Ostrinia furnacalis (5 days after insect ingestion)

表3 玉米螟和草地貪夜蛾室內生測Table 3 Laboratory bioassay of Ostrinia furnacalis and Spodoptera frugiperda

田間生測結果(表4)顯示, 心葉期接蟲玉米螟后,對照昌7-2的食葉級別為7.73±0.31, 蟲害級別為7,抗性級別為感, 說明該材料為當地感蟲材料, 本次人工接蟲質量可滿足抗性鑒定要求, 同時, LG11的食葉級別為1.33±0.24, 顯著低于對照, 蟲害級別為1,抗性級別為高抗; 穗期的田間生測結果(表3和圖5-A,B)顯示, 接蟲玉米螟后, 對照昌7-2的雌穗被害級別為6.50±0.71, 抗性級別為感, 說明該材料為當地感蟲材料, 人工接蟲質量可滿足抗性鑒定要求, LG11的雌穗被害級別為1.40±0.06, 顯著低于對照, 抗性級別為高抗。

圖5 花絲接玉米螟和草地貪夜蛾后的穗期抗蟲效果Fig. 5 Insect resistance of silk grafted with Ostrinia furnacalis and Spodoptera frugiperda at ear stage

田間心葉期接蟲草地貪夜蛾后, 對照昌7-2的食葉級別為7.83±0.24, 蟲害級別為7, 抗性級別為感,說明該材料為當地感蟲材料, 人工接蟲質量可滿足抗性鑒定要求; 而LG11的食葉級別為1.09±0.09, 顯著低于對照, 轉化體蟲害級別為1, 抗性級別為高抗(表5)。穗期的田間生測結果(表5和圖5-D)顯示, 接蟲草地貪夜蛾后, 對照昌7-2的雌穗被害級別為6.20±0.57, 抗性級別為感, 說明該材料為當地感蟲材料, 人工接蟲質量可滿足抗性鑒定要求, 而LG11的食葉級別為1.41±0.41, 顯著低于對照, 抗性級別為高抗。

2.5 LG11轉化體對除草劑的耐受性分析

為了在田間控制條件下評價轉化體LG11對除草劑草銨膦的耐受性, 我們通過人工噴施方法對播種后18 d (幼苗處于三葉一心期到五葉一心期)的轉化體LG11和對照昌7-2噴施草銨膦, 并在噴施后1、2和4周分別調查藥害等級植株數(含無藥害植株)和株高, 噴施效果如圖6所示, 統計結果如表6所示。陰性對照昌7-2在噴施草銨膦1周后, 所有植株均出現4～5級藥害, 植株大部分死亡, 成苗率0, 受害率達100%; LG11在不同劑量下皆能100%成苗,但有一定藥害產生, 藥害率達4.57%～4.69%, 噴施2周后藥害癥狀消失。對其株高進行調查, 結果發現不同劑量下轉化體株高沒有顯著性差異, 但顯著高于同處理的對照。該結果表明LG11可耐受4倍田間推薦劑量中量的草銨膦。

圖6 噴施草銨膦1周后LG11和對照昌7-2的耐受性Fig. 6 Tolerance of LG11 and control Chang 7-2 after one week of spraying with glufosinate

表6 BC5F2代LG11對草銨膦除草劑耐受性Table 6 Tolerance of LG11 of BC5F2 generation to glufosinate herbicide

3 討論

玉米蟲害是影響我國玉米產量和品質的重要因素之一, 亞洲玉米螟、黏蟲等鱗翅目害蟲是我國各玉米產區面臨的最嚴重的生物脅迫[8]。大面積高劑量噴施化學殺蟲劑嚴重污染生態環境, 且增加生產成本。因此, 抗蟲始終是玉米品種改良的重要研究內容, 也是現代生物技術進行品種改良的首選目標性狀之一[8]。培育抗蟲轉基因玉米可有效減少化學殺蟲劑的使用, 同時因其殺蟲具有特異性, 對非靶標生物安全, 有利于保護生物多樣性[17-18]。本研究利用農桿菌介導法獲得抗蟲耐除草劑T0代轉基因植株, 通過與生產上應用較多的骨干自交系昌7-2回交轉育, 獲得了農藝性狀優異且抗蟲耐除草劑的玉米新種質, 豐富了抗蟲耐除草劑玉米種質資源。

轉Bt基因玉米因具有特定且高效的目標性狀而深受種植者歡迎[17]。但大面積持續種植抗蟲轉基因玉米, 也會引發靶標害蟲產生抗性。有研究表明, 在南非, 表達Bt Cry1Ab殺蟲蛋白的抗蟲轉基因玉米MON810對草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda表現中等殺蟲效果, 導致在田間很快產生抗性[19]; 在波多黎各和巴西, 表達Bt Cry1F的抗蟲轉基因玉米對草地貪夜蛾的殺蟲效果沒有達到高劑量, 田間很快產生抗性[10]; 在巴西, 草地貪夜蛾對表達Bt Cry1Ab的抗蟲轉基因玉米也產生了抗性[11]; 在加拿大, 表達Bt Cry1F的抗蟲轉基因對歐洲玉米螟Ostrinianubilalis的殺蟲效果沒有達到高劑量, 田間很快產生抗性[12]。因此, 為了阻止或延緩靶標害蟲抗性種群的發生, 保障轉基因作物的可持續利用, 必須配套實施有效的抗性治理措施。為此, 各國生物學者提出了抗性治理策略IRM (insect resistance management),目前應用最為廣泛且能有效延緩靶標害蟲產生抗性的策略主要有“高劑量/庇護所” (high dose/refuge)策略和“多基因” (pyramid)策略[13]。在“高劑量/庇護所”策略中, “高劑量”是指轉Bt基因作物能保持高劑量表達殺蟲蛋白, 這樣就可以殺死靶標害蟲中的100%隱性敏感純合(ss)個體和99%抗性雜合(sr)個體, 僅有抗性純合(rr)個體可能存活; “庇護所”是指在轉Bt基因作物周圍種植一定數量的非轉基因作物, 提供足夠數量的害蟲敏感個體, 與來自轉Bt基因作物區的抗性純合個體進行交配, 從而產生雜合個體, 被高劑量表達殺蟲蛋白的轉基因作物殺死, 達到稀釋抗性基因的目的, 減少抗性遺傳可能性[14]。轉Bt基因作物高劑量表達Bt殺蟲蛋白是“高劑量/庇護所”策略實施成功與否的關鍵。單個殺蟲蛋白質往往殺蟲譜比較窄, 殺蟲活性比較低, 長期大量使用、可引起害蟲抗性的發展[20], 因此, 獲得具有高殺蟲活性的新型蛋白質殺蟲毒素, 對提高殺蟲能力和減緩害蟲抗性的發生具有重要的應用價值[21]; 相比單個基因的轉化, 多個基因的聚合或融合具有明顯優勢: 殺蟲效果更好, 殺蟲譜更廣, 多個抗蟲基因之間殺蟲譜可以互相彌補, 有效延緩昆蟲產生抗性的時間并延緩抗性品種的使用壽命。LG11的抗蟲性分析結果表明, 含有m2cryAb-vip3Aa融合蛋白的LG11轉化體對靶標害蟲玉米螟和草地貪夜蛾的抗性為高抗, 這對今后制定實施“高劑量/庇護所”策略提供了重要科學依據。在“多基因”策略中, 在同一株植物中同時導入2個或多個沒有交互抗性的針對同一靶標害蟲的抗蟲基因, 使得轉基因植物產生抗性的風險減小,可有效延緩抗性的產生和發展[12]。LG11可以同時表達Cry1Ab和Vip3Aa兩種不同類型的殺蟲蛋白, 且這2種蛋白不同源、殺蟲機制不同, 相較于僅含單一Bt殺蟲蛋白的植株, 能有效降低靶標害蟲產生抗性的幾率, 對害蟲的抗性治理起到積極作用。

4 結論

抗蟲耐除草劑玉米LG11是將m2cryAb-vip3Aa和bar基因串聯導入受體材料并與昌7-2進行回交轉育獲得的新種質。PCR檢測和Southern雜交檢測證實m2cryAb-vip3Aa和bar基因已整合進植物基因組,均為單個拷貝且穩定遺傳; 表達模式分析顯示m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11中呈組成型表達,但在不同發育時期的不同組織器官中表達量存在差異; 抗蟲性分析顯示LG11對靶標害蟲玉米螟和草地貪夜蛾高抗; 耐除草劑分析顯示LG11可耐受4倍田間推薦劑量中量的草銨膦。