銀耳多糖對人軟骨細(xì)胞的增殖效應(yīng)和抗炎作用

譚敏穎，戴川景，盧學(xué)敏，王毅剛，關(guān) 磊，程 勇,

（1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江杭州 310018；2.浙江天草生物科技股份有限公司，浙江湖州 313399）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種出現(xiàn)在關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中非常普遍的骨組織慢性[1]和退行性疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)組織的代謝異常，骨關(guān)節(jié)的磨損、撕裂[2]和滑膜液炎癥因子的增加[3]。近年來發(fā)現(xiàn)髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)OA 是導(dǎo)致殘疾的主要原因，人們普遍認(rèn)為OA會日益增加人們生活的負(fù)擔(dān)，這會導(dǎo)致醫(yī)療系統(tǒng)的壓力不斷增加。在全球范圍內(nèi)影響約5 億人口且女性發(fā)病率高于男性[4]。它可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙、疼痛、僵硬，限制正常的組織功能，嚴(yán)重降低人們的生活質(zhì)量[5]。關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是多種潛在因素共同的作用結(jié)果[6]，其中人口老齡化[7-8]、肥胖（BMI≥30 kg/m2）[8]，或者骨組織異常負(fù)荷受損[9]、肌肉無力和關(guān)節(jié)松弛，頻繁下蹲等都可能是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要風(fēng)險因素。巨噬細(xì)胞是維持組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵媒介[10]，在OA 關(guān)節(jié)中巨噬細(xì)胞受到球蛋白誘導(dǎo)后，會產(chǎn)生許多促炎細(xì)胞因子和生長因子，如白介素6（Interleukin-6，IL-6）[3]、單核化學(xué)吸引蛋白。促炎細(xì)胞因子會上調(diào)細(xì)胞外合成基質(zhì)（Extracellular cartilage matrix，ECM）金屬蛋白酶和蛋白聚合酶（MMP-3 和MMP-13，以及ADAMTS-4 和ADAMTS-5）來抑制細(xì)胞基質(zhì)合成，從而破壞關(guān)節(jié)組織[3]。

目前對于骨關(guān)節(jié)炎的治療大致可分為藥理學(xué)、非藥理學(xué)和手術(shù)干預(yù)。骨關(guān)節(jié)炎臨床經(jīng)濟學(xué)會（European Society for Clinical and Economic Aspects of Osteoporosis,Osteoarthritis and Musculoskeletal Diseases，ESCEO）建議使用低劑量、短期的乙酰氨基酚、藥用級氨基葡萄糖和硫酸軟骨素用于緩解OA 帶來的疼痛[11]。天然化合物硫酸軟骨素和葡萄糖胺已經(jīng)被多個研究證明具有抑制OA 的效果[12-13]，并證明它有利于人類關(guān)節(jié)中蛋白聚糖合成，改善細(xì)胞外軟骨基質(zhì)的代謝紊亂[14]。其他常見的藥理學(xué)手段包括使用非甾體抗炎藥（NSAIDs）、撲熱息痛（對乙酰氨基酚）[15]等，這些藥物在治療OA 中被頻繁使用，并且其作用效果在臨床中得到了驗證[16]。但是非甾體抗炎藥具有強烈的毒性，可導(dǎo)致胃出血，腎臟血流減少等風(fēng)險[17]，而除了非甾體類藥物以外，還有內(nèi)皮質(zhì)類固醇注射[16]和關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸的方式可以幫助患者減輕疼痛[18]。有研究表明，隨著注射時間的增加，類固醇的效果會減小，而且可能會對軟骨產(chǎn)生有害影響。此外，有研究者使用間充質(zhì)干細(xì)胞在動物模型中治療OA[19]，但目前還沒有在臨床進(jìn)行驗證和治療。目前，對于OA 的臨床治療面臨著艱巨的挑戰(zhàn)。

在這些治療藥物中大部分副作用強，服用后會產(chǎn)生胃出血潰瘍等毒副作用。銀耳多糖作為一種具有藥用價值的食物，副作用小，是一種具有潛力的抗炎藥材。銀耳是一種真菌，通常被用來入藥或者直接食用。其中的有效生物活性成分是銀耳多糖，包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、酸性低聚糖和酸性雜多糖等[20]。研究者對銀耳多糖的藥用價值在不斷挖掘，發(fā)現(xiàn)銀耳多糖具有免疫調(diào)節(jié)[21]、抗氧化、降血糖、降血脂和抗腫瘤的作用，而且具有低副作用。銀耳提取物可以抑制LPS 刺激引起的炎癥反應(yīng)[22]、雙環(huán)素硫酸鈉引起的結(jié)腸炎[23]、成纖維細(xì)胞損傷[24]等諸多炎癥反應(yīng)，并且可以促進(jìn)抗炎因子白介素-2（Interleukin-2，IL-2）的增加[25]，說明銀耳多糖是一種有效的炎癥抑制劑。但是對于在關(guān)節(jié)炎方面，銀耳多糖的藥用價值仍不明確。

本研究擬通過銀耳多糖處理骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型—人軟骨細(xì)胞T/C-28a2 后，檢測銀耳多糖對T/C-28a2 細(xì)胞的增殖效應(yīng)和細(xì)胞毒作用，以及促炎因子IL-6、相關(guān)骨保護(hù)因子（Osteoprotegerin，OPG）、促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellularsignal-regulated kinases，ERK-MAPK）和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor-kappaB，NF-κB）的表達(dá)，進(jìn)一步檢測活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的水平，以探究銀耳多糖促進(jìn)人軟骨細(xì)胞T/C-28a2 的增殖、抑制骨關(guān)節(jié)炎的形成、保護(hù)軟骨組織并抵抗細(xì)胞凋亡的作用，為開發(fā)銀耳多糖作為抗炎藥物提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、活性氧（ROS）檢測試劑盒、D-氨基葡萄糖、硫酸軟骨素Sigma 公司；氨糖軟骨素鈣片 湯臣倍健；銀耳多糖、硫酸化銀耳多糖 分析純，杭州天草生物公司；IL-6 ELISA 試劑盒 義翹神舟；胎牛血清（FBS）、胰酶消化液（0.25% Tryspin-EDTA（1×））、青-鏈霉素溶液 Gibco 公司；人軟骨細(xì)胞T/C-28a2 ATCC、DMEM高糖培養(yǎng)基 Hyclone 公司；鼠抗體、兔抗體 Santa Cruz 公司；β-actin ERK-MAPK CST 公司；OPG NF-κB BAX 華安生物公司；噻唑藍(lán)（MTT）、結(jié)晶紫 麥克林公司。

ELx800 多功能酶標(biāo)分析儀 美國 Biotek 公司；4J1093 倒置熒光顯微鏡 Nikon 公司；Nu425-400e細(xì)胞生物安全柜 Nuair 公司；V6B5R3 流式細(xì)胞儀NovoCyte? Advanteon 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將軟骨細(xì)胞T/C-28a2 培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補充10%的胎牛血清（FBS），以及培養(yǎng)基總體積1%的10000 unites/mL青霉素和10000 μg/mL 的鏈霉素，細(xì)胞在5%的CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 法檢測不同藥物對軟骨細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種到96 孔板中，12 h 后每孔加入100 μL 濃度為0、1、10、100 μg/mL D-氨基葡萄糖，硫酸軟骨素，銀耳多糖，硫酸化銀耳多糖和氨糖軟骨素等的完全培養(yǎng)基并單獨設(shè)置只加磷酸緩沖液的調(diào)零組分別刺激細(xì)胞。將處理后的細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。分別在藥物刺激1、3、6 d 后檢測細(xì)胞存活率。采用MTT 測定法，每孔加入20 μL 的濃度為5 mg/mL 的噻唑藍(lán)溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸盡上清，隨后加入150 μL DMSO（分析純）溶解甲臜結(jié)晶，搖床上600 r/min 振蕩10 min，在酶標(biāo)儀中測定OD490的數(shù)值。再根據(jù)以下公式計算細(xì)胞存活率，公式為：

1.2.3 結(jié)晶紫染色測定不同藥物對軟骨細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的T/C-28a2 軟骨細(xì)胞，按1×104個細(xì)胞/孔鋪于24 孔板中。細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同藥物的完全培養(yǎng)基刺激細(xì)胞：D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素鈣片、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖；每種藥物設(shè)置濃度為1 μg/mL，同時設(shè)置僅含細(xì)胞不加任何藥物的陰性對照組，每個組設(shè)3 個復(fù)孔。3 d 后去除原細(xì)胞培養(yǎng)基，后用PBS 輕柔地洗2 次，每孔加入200 μL 配制好的結(jié)晶紫溶液，室溫靜置15 min。將孔板浸入蒸餾水多次，清洗24 孔板直至水變成無色，再將24 孔板倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中烘干水分。在光源充足的條件下將24 孔板置于白色卡紙上拍攝結(jié)晶紫染色結(jié)果照片。后加入33%的乙酸溶液溶解結(jié)晶紫，600 r/min 振蕩10 min 后，使用酶標(biāo)儀以490 nm 波長檢測。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定不同藥物處理軟骨細(xì)胞后的IL-6 表達(dá) 為了定量檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平，收集不同藥物處理的細(xì)胞上清，樣品制備方法如下：

無LPS 刺激細(xì)胞上清樣品的制備：取對數(shù)生長期的T/C-28a2 軟骨細(xì)胞，5×106個細(xì)胞/孔鋪于6 孔板中。將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞2 次，隨后分別在孔內(nèi)加入使用無血清DMEM 稀釋的1 μg/mL D-氨基葡萄糖、1 μg/mL 氨糖軟骨素、1 μg/mL 硫酸軟骨素、1 μg/mL 硫酸化銀耳多糖和1 μg/mL 銀耳多糖以及正常培養(yǎng)基。48 h 后，收集含不同藥物刺激細(xì)胞的上清，7000 r/min 離心10 min，收取細(xì)胞上清液并將其分裝到1.5 mL EP 管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LPS 刺激細(xì)胞上清樣品的制備：取對數(shù)生長期的T/C-28a2 軟骨細(xì)胞，5×106個細(xì)胞/孔鋪于6 孔板中。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞2 次，隨后加入不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h。除盡無血清培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次，分別在孔內(nèi)加入使用無血清DMEM 稀釋的1 μg/mL的LPS，培養(yǎng)24 h。除去含有LPS 的培養(yǎng)基，分別在孔內(nèi)加入使用無血清DMEM 稀釋的1 μg/mL 的D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖及正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。收集含不同藥物刺激細(xì)胞的上清，7000 r/min 離心10 min，收取細(xì)胞上清液并將其分裝到1.5 mL EP 管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將收集的細(xì)胞上清稀釋10 倍并儲存于-80 ℃，使用ELISA 試劑盒測定IL-6（pg/mL）的濃度。具體為：將100 μL 一抗加入96 孔板，4 ℃孵育過夜，第二天使用pH7.5 的1×磷酸緩沖溶液沖洗3 次，每孔加入封閉液350 μL，室溫孵育 120 min。孵育結(jié)束后進(jìn)行洗板，分別將 100 μL 樣品加入到相應(yīng)的反應(yīng)孔中，用封板膜封住反應(yīng)孔并室溫孵育120 min。洗板后每孔加入250 μL 二抗孵育90 min，用磷酸緩沖溶液沖洗3 次，每孔加入 150 μL 顯色液。室溫下避光孵育 27 min，使用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程為Y=0.0108X+0.0792，（R2=0.9989），式中：Y 為樣品在450 nm 波長吸光值；X 為樣品IL-6 濃度（pg/mL）。

1.2.5 Western blot 檢測不同藥物處理后骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的人軟骨細(xì)胞T/C-28a2，以5×106個細(xì)胞/孔鋪于6 孔板中。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成含有1 μg/mL 的D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖的完全培養(yǎng)基以及無藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL 蛋白質(zhì)裂解緩沖液（1×，靜置3 min），用槍頭順時針攪動提取蛋白，收到的蛋白樣品100 ℃金屬浴10 min 使蛋白變性。配10%的分離膠，每孔15 μL 上樣跑SDS-PAGE 電泳。將電泳凝膠轉(zhuǎn)印至0.45 μm PVDF 膜，350 mA 2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗脫后孵育一抗4 ℃過夜，洗脫后孵育二抗2 h，清洗之后滴加ECL 顯影液與化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯影，使用Image J 對蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同藥物對ROS 釋放的影響取對數(shù)生長期的T/C-28a2 軟骨細(xì)胞，按3×106個細(xì)胞/孔鋪于12 孔板中。將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。去除細(xì)胞上清，用冰PBS 沖洗細(xì)胞2 次，按照活性氧（ROS）檢測試劑盒說明，將試劑盒中Master Reaction Mix 以每孔450 μL 加入12孔板中，放置于5% CO2，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，每孔加入50 μL 含有DMEM 無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物，使其終濃度為1 μg/mL。設(shè)空白對照加入對應(yīng)量PBS 處理，5% CO2，37 ℃ 孵育2 h。最后收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3～5 次，采用Graphpad Prism 9軟件繪圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示，并進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），使用Waller-duncan（W）進(jìn)行多重比較分析。P＞0.05表示無顯著性差異，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 表示有顯著性差異，P＜0.001 表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳多糖促進(jìn)人軟骨細(xì)胞T/C-28a2 的增殖活性

分別用完全培養(yǎng)基稀釋的0（對照組）、1、10、100 μg/mL D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖刺激T/C-28a2 細(xì)胞，以及在孔板中只加入磷酸緩沖溶液（調(diào)零組），分別在第1、3、6 d 通過MTT 的方式檢測藥物對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖1 所示，加入上述5 種藥物后，硫酸化銀耳多糖對T/C-28a2 細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性作用，當(dāng)藥物濃度1 μg/mL 時銀耳多糖能刺激T/C-28a2 細(xì)胞增殖。在處理3 d 后，銀耳多糖和硫酸軟骨素對T/C-28a2 細(xì)胞的增殖作用更加明顯。藥物濃度1 μg/mL 與10、100 μg/mL 相比，能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，因此確定1 μg/mL 為實驗濃度中相對合適作為進(jìn)一步研究的濃度。

圖1 不同藥物在不同濃度作用下對人軟骨細(xì)胞T/C-28a2 的增殖活性Fig.1 Effect of different drugs at different concentrations on human chondrocyte T/C-28a2 cell viability

2.2 銀耳多糖對人軟骨細(xì)胞T/C-28a2 的細(xì)胞毒性效應(yīng)

由于硫酸軟骨素對軟骨細(xì)胞T/C-28a2 的增殖作用有助于修復(fù)軟骨損傷。本實驗通過結(jié)晶紫染色進(jìn)一步探究1 μg/mL D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖對軟骨細(xì)胞的增殖作用，結(jié)果表明1 μg/mL 銀耳多糖、D-氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、氨糖軟骨素均能刺激軟骨細(xì)胞T/C-28a2 的增殖（圖2）。其中，硫酸軟骨素（P＜0.001）與銀耳多糖（P＜0.05）處理人軟骨細(xì)胞，細(xì)胞增殖差異性更顯著。

圖2 銀耳多糖對人軟骨細(xì)胞T/C-28a2 的毒性效應(yīng)Fig.2 Toxic effects of Tremella fuciformis polysaccharide on T/C-28a2 in human chondrocytes

2.3 銀耳多糖抑制骨關(guān)節(jié)炎的炎癥水平

據(jù)報道，硫酸軟骨素（軟骨素4,6-硫酸鹽）已經(jīng)用于治療人骨關(guān)節(jié)炎（OA），并取得了較好的治療效果[26-27]。研究顯示，在沒有加入脂多糖的情況下，所有藥物的加入均使IL-6 表達(dá)水平與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）（圖3a），在LPS 處理組中，硫酸化銀耳多糖（P＜0.01）、氨糖軟骨素（P＜0.001）與硫酸軟骨素處理組之間作用有顯著性或極顯著差異，銀耳多糖和氨糖軟骨素處理組之間有顯著性差異（P＜0.01）（圖3b），這表明硫酸軟骨素的抑制炎癥的效果要高于以上幾種藥物。此外，銀耳多糖和硫酸軟骨素處理組之間IL-6 的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明銀耳多糖和硫酸軟骨素藥效相近，而且銀耳多糖相對于其他藥物處理方式對于防止炎癥反應(yīng)的發(fā)生更有效，這與已有文獻(xiàn)綜述植源性多糖可以緩解炎癥的發(fā)生[28]的結(jié)果一致。

圖3 銀耳多糖對炎癥標(biāo)志物IL-6 含量的影響Fig.3 Effect of Tremella fuciformis polysaccharide on the content of inflammatory marker IL-6

2.4 銀耳多糖促進(jìn)骨保護(hù)和抑制骨關(guān)節(jié)炎的機制分析

為進(jìn)一步研究藥物在分子水平上的作用機制、對骨組織的保護(hù)作用和藥物刺激對細(xì)胞凋亡的影響，利用Western blot 技術(shù)檢驗了相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（圖4）。結(jié)果顯示，銀耳多糖和硫酸軟骨素處理能增加骨保護(hù)因子OPG 的表達(dá)，表明銀耳多糖和硫酸軟骨素具有骨組織保護(hù)作用。進(jìn)一步檢測了NF-κB 和凋亡信號Bax 蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)使用銀耳多糖和硫酸軟骨素處理后它們的表達(dá)量相對對照組減少，這說明OA 發(fā)生發(fā)展中NF-κB 信號被抑制，且這兩種藥物可以有效的抑制細(xì)胞凋亡。

圖4 銀耳多糖對OA 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Tremella fuciformis polysaccharide on expression of OA-related proteins

2.5 銀耳多糖抑制軟骨細(xì)胞ROS 活性氧水平

為檢測銀耳多糖對軟骨細(xì)胞的氧化損傷和藥物安全性，進(jìn)行了活性氧（ROS）釋放實驗[29]。結(jié)果表明，與無藥物處理的對照組相比，藥物處理組細(xì)胞的ROS 相對釋放量更少，特別是銀耳多糖（P＜0.01）和硫酸軟骨素（P＜0.001）處理組（圖5），這說明銀耳多糖和硫酸軟骨素可以阻礙大量ROS 產(chǎn)生，這可能進(jìn)一步阻礙炎癥的發(fā)展。

圖5 銀耳多糖處理人軟骨細(xì)胞后ROS 的釋放Fig.5 ROS release from human chondrocytes treated with Tremella fuciformis polysaccharide

3 討論與結(jié)論

目前，骨組織在早期骨關(guān)節(jié)炎中的變化原因尚不完全清楚，當(dāng)軟骨細(xì)胞被內(nèi)源或外源性的因素刺激時，通常會表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞的凋亡[30-31]、細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的變化[32]和ECM 降解[33]等。本研究使用銀耳多糖刺激軟骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)出了對軟骨細(xì)胞活力的促進(jìn)作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞凋亡因子Bax 上調(diào)有關(guān)[31]，與本研究發(fā)現(xiàn)銀耳多糖刺激軟骨細(xì)胞Bax 表達(dá)下調(diào)一致，這表現(xiàn)出了銀耳多糖的抗凋亡效應(yīng)。更進(jìn)一步地，ERK1/2-MAPK 和JNK 途徑的激活會使細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular cartilage matrix，ECM）的蛋白酶表達(dá)上調(diào)[31,34]，骨微裂會刺激損傷區(qū)域的骨細(xì)胞產(chǎn)生NF-κB 信號[35]。當(dāng)NF-κB 上調(diào)時，軟骨細(xì)胞會無法補償降解的ECM，導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)平衡障礙[36]，細(xì)胞炎癥和骨組織結(jié)構(gòu)退化[31,37]，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生。此外，當(dāng)受體骨保護(hù)素OPG 失活時會導(dǎo)致骨吸收的發(fā)生[38-39]。本研究發(fā)現(xiàn)骨銀耳多糖處理軟骨細(xì)胞后，保護(hù)因子OPG 表達(dá)上調(diào)，而NF-κB、ERK1/2-MAPK 表達(dá)下調(diào)，因此推測銀耳多糖對軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，并對骨關(guān)節(jié)炎具有抑制作用。

先前研究發(fā)現(xiàn)，退化軟骨組織或軟骨損傷環(huán)境中IL-6 水平增高，在IL-6/Stat3 模型中，IL-6 主要通過Stat3 信號誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分解代謝和軟骨細(xì)胞凋亡[40]。本實驗通過在軟骨細(xì)胞中加入LPS 模擬炎癥環(huán)境，對比了炎癥產(chǎn)生前后加入藥物后促炎因子IL-6的變化，發(fā)現(xiàn)在非炎癥環(huán)境下藥物刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6 水平?jīng)]有顯著性差異，而加入LPS 誘導(dǎo)后，硫酸軟骨素和銀耳多糖組與對照組相比IL-6 產(chǎn)生水平顯著降低。這表明在沒有發(fā)生炎癥反應(yīng)時，藥物對細(xì)胞的作用相差不明顯，當(dāng)炎癥發(fā)生時，銀耳多糖可以通過下調(diào)炎癥因子表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用，因此推測銀耳多糖具有良好的抗炎活性，有效減緩骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。

在OA 治療中，銀耳多糖對軟骨再生和清除自由基具有重要意義。高水平的ROS 可能會阻礙炎癥中骨軟骨組織的自然再生過程[33]。此外，活性氧（ROS）水平可能導(dǎo)致廣泛的氧化應(yīng)激反應(yīng)，高水平的ROS 可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷[41]。本研究通過檢測不同藥物刺激下活性氧的變化，發(fā)現(xiàn)銀耳多糖的ROS釋放量顯著降低（P＜0.05），說明銀耳多糖對軟骨細(xì)胞清除自由基具有影響，具有高抗氧化性和低細(xì)胞損傷的效用，并可能進(jìn)一步抑制炎癥的發(fā)生。

綜上，本研究探討了銀耳多糖對骨關(guān)節(jié)炎的潛在影響，發(fā)現(xiàn)銀耳多糖具有抑制骨關(guān)節(jié)炎的效用，可以通過降低IL-6 產(chǎn)生的水平減少骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，OPG 的增加表明銀耳多糖可以在一定程度上保護(hù)軟骨組織，抵抗細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)銀耳多糖的抗炎作用及機制，為探索銀耳多糖作為抗炎藥物和OA治療提供了新的思路。