小肽Ospep5對水稻耐鎘性的影響

李明月 張文婷 李 陽 張保龍 楊立明 王金彥,*

1江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所, 江蘇南京 210014; 2生物育種鐘山實驗室, 江蘇南京 210014; 3南京林業大學生物與環境學院, 江蘇南京 210037

水稻是人類的主要糧食作物之一, 是人類賴以生存和發展的最基本的物質基礎, 而水稻的食用安全與人類的健康和幸福息息相關[1]。隨著人類活動的增加, 大量的重金屬污染對土壤和環境造成了嚴重的影響[2]。鎘是水稻生長和人體的非必需元素, 它具有高毒性、易積累、難降解等特點, 且在微量濃度下便會對水稻生長發育和人體健康造成影響, 被廣泛認為是限制植物生長和發育的主要的重金屬脅迫之一[3]。近幾年的研究發現, 當植物受到鎘脅迫時,植物自身會產生針對鎘脅迫的防御策略, 這些防御策略主要有3種形式[4]。第1種是通過阻止重金屬被植物吸收, 可以防止鎘離子在細胞中的積累, 從而減少對植物的損害[5]。第2種是通過絡合作用和螯合作用, 來減少鎘離子在細胞中的游離。鎘離子在進入細胞后會迫使細胞產生活性氧, 而通過清除活性氧的方式可以有效減少鎘脅迫對生物大分子危害。植物能夠產生多種化合物, 如金屬硫蛋白、植物螯合劑和氨基酸等, 以清除活性氧, 從而減輕其對細胞的毒性[6]。第3種是提高抗氧化酶的活性來清除自由基和活性氧。一些重要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等。這些酶可以幫助將自由基和活性氧轉化為較為穩定的分子, 從而減輕氧化應激的程度[7]。植物可以通過各種途徑提高這些抗氧化酶的活性, 例如調節基因表達、增加酶的合成等, 從而增強對鎘脅迫的耐受性[8]。

此前研究表明, 植物細胞可以分泌一些5～60個氨基酸組成的多肽, 這類多肽與另一種細胞表面受體結合后可以調節植物的生長發育, 由于它們具有植物激素的許多特征, 因此也被稱為多肽激素[9]。多肽激素與傳統植物激素相似, 可以在很低的濃度下起作用, 在植物生長和應激反應中成為重要的細胞外信號分子[10]。小肽是其中一類較短的多肽分子,其分子量通常在2～10 kD之間, 可以在植物體內參與許多生理過程, 如生長調節、環境適應和脅迫響應等[11]。根據來源和合成方式的不同, 小肽可以分為內源性小肽和外源性小肽[12]。內源性小肽是由細胞內蛋白質分解產生的, 包括信號肽、激素和酶促肽等; 外源性小肽是由植物或其他生物分泌的, 包括植物防御肽、抗菌肽和胰島素等[13]。在過去的幾十年中, 越來越多的研究表明, 小肽可以提高植物對重金屬的耐受性。其中, 小肽對植物耐鎘的作用受到了廣泛關注。小肽的作用機制包括但不限于促進植物抗氧化能力、促進植物生長和代謝、調節植物根系的形態和生長、提高植物對鎘的吸收和轉運等[14]。在薺菜的研究中發現, 過表達AtPCS1基因可以提高植株體內螯合肽的含量, 從而增加了薺菜對鎘和砷的耐受性[15]。Lan等[16]新發現了一個新型的植物小肽家族IRON MANs (IMAs), 鎘處理可顯著誘導擬南芥小肽基因IMA1和IMA3的表達。在水稻中, CAL1和DEF8均能夠通過跨膜方式將鎘向細胞外運輸, 表明植物體內可能存在一類新型的小肽螯合轉運系統[17]。

在前期研究中, 我們通過翻譯組、轉錄組和蛋白質組等方法, 在水稻中發現了一個新型小肽Ospep5。在本研究中我們通過鎘處理水稻幼苗, 測定幼苗的形態指標和生理指標, 發現Ospep5可顯著提高水稻幼苗的耐鎘性。本研究結果不僅為水稻耐鎘提供了一種潛在有用的調節因子, 還為研究植物耐鎘性的復雜分子機制提供了更多的信息, 同時為植物鎘生物修復潛能的拓展提供了理論依據和基因資源。

1 材料與方法

1.1 基因編輯載體構建及水稻轉化

根據Hua等[18]的研究方法, 構建了一個靶向Ospep5的CRISPR/Cas9載體。將該載體轉化A.tumefaciens菌株EHA105中。然后按照Ma等[19]的研究方法, 使用農桿菌侵染水稻日本晴的愈傷組織進行轉化。根據表1中的引物序列進行擴增, 對PCR產物直接測序。最后選擇純合的敲除突變體ospep5-3進行下一步分析。

1.2 過表達載體構建及水稻轉化

將Ospep5基因連接到pCM1309載體中, 利用農桿菌介導轉化日本晴愈傷組織, 生成轉基因水稻植株。在T2代中選擇純合的轉基因株系Ospep5-OX,用于鎘敏感性分析和鎘含量測定。

1.3 試驗材料與處理

試驗在江蘇省農業科學院人工氣候室內完成。試驗水稻品種為日本晴, 日本晴Ospep5的CRISPR/Cas9突變體ospep5-3, 日本晴過表達植株Ospep5-OX。試驗中使用的小肽Ospep5 (MLDPTHMFVQPHVAD MIRSKISEFRDQNSYEKPS)由中國杭州丹港生物科技有限公司合成。首先挑選健康飽滿的水稻種子浸在清水中, 放在37℃烘箱中催芽3 d, 清水每天更換1次。采用水培法進行培養, 水培盒為黑色避光96孔, 長127 mm, 寬87 mm, 高124 mm, 水培營養液采用霍格蘭營養液, 每3 d換1次。每個水培盒種48顆飽滿水稻種子, 在水稻幼苗生長10 d時進行鎘脅迫處理, 將CdCl2·2.5H2O (分析純)一起與營養液拌勻后澆灌水稻, 同時將體外合成的小肽Ospep5均勻噴施在水稻幼苗表面, 直至有液滴形成, 對照組噴施等量蒸餾水。10 d齡的健康水稻幼苗植株被分為3個處理, 分別是對照(CK), 500 μmol L–1CdCl2(Cd), 500 μmol L–1CdCl2+300 nmol L–1Ospep5 (Cd+S5)。水稻幼苗處理7 d后取樣測定各生理生化指標。

1.4 形態學相關指標測定

每個重復隨機選取10株水稻幼苗, 去蒸餾水洗凈后用濾紙吸干其表面的水分進行測量。采用1‰的電子精密天平稱量植株鮮重, 使用0.1 cm的直尺測量植株地上部高度和主根長度。以平均值作為各項結果的基準。

1.5 生理學相關指標測定

稱取水稻葉片0.05 g, 剪碎放入20 mL丙酮∶無水乙醇(1∶1)混合液中置于黑暗條件下浸提至葉片完全脫綠變白進行葉綠素提取, 中間需混勻2～3次, 并在OD645和OD663處測量提取溶液的吸光度。水稻葉綠素含量的計算公式是: Chl = (8.04×OD663+20.29×OD645)×V/W。

使用北京索萊寶科技有限公司丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒對水稻幼苗植株進行丙二醛含量檢測;使用北京索萊寶科技有限公司脯氨酸(Pro)含量檢測試劑盒進行脯氨酸含量檢測檢測; 使用南京建成生物工程研究所有限公司總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒進行總超氧化物歧化酶活力測定。各處理3個重復。

1.6 水稻幼苗鎘離子含量測定

對處理7 d的水稻幼苗進行采樣, 取4個生物學重復, 每個重復6～8株。將幼苗表面用去離子水沖洗干凈, 吸干表面水分, 去除殘留的胚, 分成地上部和根部, 稱量鮮重。之后將樣品放在烘箱, 先用105℃烘15 min, 于80℃恒溫烘干1周至恒重, 稱量干重。將樣品轉移至25 mL帶蓋玻璃刻度試管, 加入適量濃硝酸(地上部5 mL, 根部3 mL), 50℃水浴過夜, 再用95℃水浴消煮至樣品充分溶解, 其間多次震蕩搖勻, 冷卻后加入去離子水定容至20 mL。最后使用ICP-OES測定鎘離子含量。

1.7 實時熒光定量PCR分析

對處理6 h后的日本晴水稻幼苗進行取樣, 每個處理3個重復, 每個重復隨機取4～6株幼苗。使用TRIzol試劑從幼苗中提取總RNA, 然后用無RNA酶的DNA消化酶I進行處理以去除殘留基因組DNA, 用M-MLV逆轉錄酶進行逆轉錄。所得cDNA用于qRT-PCR分析, 并使用表1中提供的特異性引物確定鎘應答基因的轉錄水平, qRT-PCR在QuantiDx Q16S熒光定量PCR儀(中國香港)中進行。Actin作為內參基因。

1.8 數據處理

借助Microsoft Excel 2020進行數據整理,Graphpad Prism 9.3繪制圖表, 并利用SPSS 26.0進行方差分析和顯著性檢驗(P<0.05), 采用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 Ospep5突變體的獲得和過表達植株的表達分析

在前期研究中我們鑒定到一個編碼34個氨基酸的小肽, 命名為Ospep5, 其前體編碼一個具有65個氨基酸、類似于修復因子IIH亞基TFB5蛋白。利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯方法在野生型日本晴背景下產生了Ospep5基因的敲除突變體, 通過測序驗證, 獲得了具有2-bp缺失的突變體ospep5-3進行后續研究(圖1-A)。經過農桿菌轉化得到過表達植株Ospep5-OX, 并以Actin作為內參進行Ospep5的qPCR分析, 其結果如圖1-B, 目的基因Ospep5在過表達Ospep5-OX的表達顯著高于野生型植株日本晴,其表達量高出野生型植株的5倍。

圖1 Ospep5的基因編輯突變體和過表達株系分析Fig. 1 Relative expression level of CRISPR/Cas9 mutant and overexpression lines of Ospep5

2.2 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗表型的影響

為了研究Ospep5在調節重金屬鎘脅迫下水稻幼苗生長中的作用, 我們在水稻苗期進行了鎘脅迫處理和外施合成小肽處理, 并在處理7 d后對水稻幼苗進行表型觀察。圖2-A表明, Cd處理組和Cd+S5處理組與對照日本晴CK相比, 生長都受到了鎘脅迫的抑制。然而, 與單獨CdCl2處理的幼苗相比, 外施合成小肽Ospep5的幼苗生長明顯緩解了鎘脅迫的抑制。圖2-B表明, 在突變體ospep5-3中, 結果與圖2-A在野生型日本晴中的結果相同, 經過CdCl2處理的幼苗生長都受到了明顯的抑制, 經過小肽Ospep5處理的幼苗生長明顯緩解了鎘脅迫的抑制。圖2-C表明, 在單獨CdCl2處理的幼苗中, 野生型日本晴和過表達Ospep5-OX幼苗, 其生長明顯優于突變體ospep5-3的幼苗。綜上所述, 鎘處理會顯著抑制水稻幼苗的生長, 小肽Ospep5可以緩解鎘脅迫對水稻幼苗的生長抑制。

圖2 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗生長的表型影響Fig. 2 Phenotypic effects of Ospep5 on rice seedling growth under cadmium stress

2.3 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗鮮重、株高和根長的影響

為了研究Ospep5在重金屬鎘脅迫下水稻植株的生長發育情況, 進行了相應形態指標的測定。苗期是植物生長發育的重要時期, 也是對鎘脅迫較為敏感的時期, 鮮重、株高、根長是最為直觀的植株生長發育指標。對鮮重、株高、根長進行統計, 由表2可知, 在野生型日本晴中, 單獨鎘處理顯著降低了幼苗的鮮重、株高和根長; 而與單獨鎘處理相比, 施加小肽Ospep5后, 幼苗的鮮重、株高和根長顯著升高。在ospep5-3中, 其結果與在野生型日本晴中相同, 經過單獨鎘處理的幼苗, 其鮮重、株高和根長被顯著抑制; 而與單獨鎘處理相比, 施加小肽Ospep5后, 幼苗的鮮重、株高和根長顯著升高。并且在單獨鎘脅迫處理的幼苗中,Ospep5-OX的鮮重、株高和根長顯著高于ospep5-3的鮮重、株高和根長。因此, 表明Ospep5在鎘脅迫條件下可以對水稻幼苗植株的鮮重、株高和根長起到調節作用,證實了Ospep5可以緩解鎘脅迫下水稻幼苗的生長發育。

表2 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗的鮮重、株高和根長的影響Table 2 Effects of Ospep5 on fresh weight, plant height, and root length of rice seedlings under cadmium stress

2.4 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗葉綠素、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

為了研究Ospep5在重金屬鎘脅迫下對水稻幼苗生理特性的影響, 我們對水稻幼苗進行了生理指標測定。測定了在鎘處理前后葉綠素、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。實驗結果顯示, 鎘脅迫下與無鎘對照組相比, 葉綠素含量顯著減少, 而MDA、Pro含量和SOD活性則顯著增加(圖3)。這表明在重金屬鎘脅迫下, 水稻幼苗體內的抗氧化系統能夠抵抗由于鎘脅迫引起的過氧化反應。在進行鎘脅迫處理的同時, 施加了Ospep5,實驗結果顯示, 與單獨加鎘處理相比, 施加Ospep5的處理組葉綠素和SOD的含量顯著增加, 而MDA和Pro的含量則顯著降低。這表明Ospep5能夠緩解鎘脅迫對植物的負面影響。同時, 發現在單獨鎘脅迫處理中,Ospep5-OX植株的葉綠素含量比ospep5-3和日本晴高, 而MDA和Pro的含量則比ospep5-3和日本晴低。綜上所述, 實驗結果表明, 在重金屬鎘脅迫下, Ospep5對植物生長的影響是多方面的, 包括葉綠素、Pro、MDA和SOD等。因此, 在進一步的研究中, 需要更深入地探究Ospep5在重金屬鎘脅迫下的分子機制和生理作用。

圖3 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗生理指標的影響Fig. 3 Effects of Ospep5 on physiological indexes of rice seedlings under cadmium stress

2.5 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗鎘含量的影響

為了分析Ospep5是否參與調節水稻植株對鎘脅迫的響應, 我們對處理7 d后的野生型日本晴水稻幼苗進行了鎘離子含量測定。圖4表明, 在鎘脅迫下, 水稻幼苗的地上部分和地下部分的鎘離子含量均顯著增加。然而, 與單獨鎘脅迫相比, 經過外施Ospep5發現, 水稻幼苗在鎘脅迫下, 其地上部分和地下部分的鎘離子含量均顯著降低。因此, 表明Ospep5能夠降低水稻幼苗在鎘脅迫下的鎘含量, 并增強其抗鎘能力。

圖4 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗鎘含量的影響Fig. 4 Effects of Ospep5 on cadmium content in rice seedlings under cadmium stress

2.6 基因表達分析

為了進一步揭示Ospep5是否參與調控鎘脅迫相關基因, 我們對處理6 h后的水稻幼苗進行qRT-PCR表達分析(圖5)。與對照相比, 在鎘脅迫下OsHMA2和OsCAL1基因表達下調,Ospep5和OsHMA3表達上調; 與單獨鎘脅迫處理相比, 通過外源施加合成Ospep5可使4個基因表達量均上調。這些研究表明, Ospep5可導致水稻幼苗對鎘脅迫的敏感降低, 減少鎘在植物體內的積累, 這驗證了Ospep5在介導水稻耐鎘性方面的功能, 可能是通過調節細胞離子穩態實現的。

圖5 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗相關基因的qRT-PCR的分析Fig. 5 Relative expression level of Ospep5 on rice seedling related genes under cadmium stress

3 討論

近年的研究表明, 小肽作為信號分子廣泛參與植物的生長發育、免疫及環境適應性的調控, 因此越來越多的科學家認識到植物小肽的生物學意義[20]。在擬南芥中, 激素類多肽分子AtPep3可調控植物抗鹽脅迫[21]。在干旱脅迫中, 多肽CLE25能在根部感受缺水信號, 并進行運輸, 有效提高植物的抗旱性[22]。然而, 關于植物小肽如何緩解水稻中的鎘脅迫的信息尚不充分。在本研究中, 葉面均勻噴施合成小肽Ospep5能有效緩解鎘脅迫對水稻苗期的生長發育的影響, 鮮重、株高和葉綠素顯著增加, 并促進根系生長。植物小肽Ospep5可能介導鎘積累并賦予植物較強的鎘耐性。Gu等[23]發現了一種具有類轉運功能的韌皮部鎘卸載蛋白DEF8, 該蛋白通過螯合和跨細胞膜分泌機制, 在重金屬Cd向地上部位的長途轉運以及籽粒中韌皮部鎘卸載過程中發揮了雙重作用。在之前研究中,OsHMA2參與鎘離子從根到地上部分的運輸以及鎘在節中的分配,OsHMA3位于液泡膜上在鎘向液泡運輸中起著重要作用, 過表達OsHMA2和OsHMA3可以顯著降低水稻植株鎘含量[1]。OsCAL1是水稻防御素蛋白, 能夠蝥合細胞質中的鎘排至細胞外, 過表達OsCAL1可以顯著降低水稻植株的鎘含量, 提高其對鎘的耐受性[24]。在本實驗中, Ospep5可以通過上調OsHMA2、OsHMA3和OsCAL1基因的表達來降低水稻幼苗體內鎘積累,從而顯著提高水稻耐鎘性。其中,OsHMA2和OsHMA3通過調節鎘的轉運減少鎘在細胞質中的積累, 而OsCAL1則是通過與鎘結合減少鎘的自由態從而降低植物體內鎘含量。Ospep5過表達顯著提高水稻的耐鎘性, 可能是因為重塑細胞內鎘的吸收和轉運。相反, Ospep5功能缺失突變體ospep5-3表現出明顯的鎘敏感性。用外源Ospep5肽處理的ospep5-3突變體產生與Ospep5-OX植株相似的表型。說明Ospep5可以增強水稻幼苗的耐鎘性, 緩解水稻幼苗在鎘脅迫下傷害。

鎘脅迫是作物遭受的環境脅迫之一, 對大多數生物體, 包括人類和植物, 具有較強毒性[25]。在鎘脅迫下, 植物會遭受氧化損傷, 導致活性氧的積累,其積累速度遠遠超過抗氧化酶清除的速度, 結果發生膜脂過氧化, 對植物細胞造成嚴重傷害, 最終損害超過了植物自我修復的能力[26]。抗氧化酶和抗氧化劑在細胞氧化還原平衡中起著至關重要的作用[27]。一些研究表明, 植物小肽可以調節植物的氧化還原狀態[28]。在本實驗中, 當植物處于鎘脅迫時, 與對照相比, 顯著提高了水稻幼苗SOD活性和MDA含量。當外施Ospep5, 增加了SOD活性并且降低了MDA含量, 保護了細胞免受活性氧的侵害。因此Ospep5可能調節抗氧化酶活性, 具有解毒的作用, 提高了植物的耐脅迫性。在鎘脅迫下, 植物體內會迅速累積脯氨酸作為重要的滲透調節物質, 用以抵抗鎘對植物造成的傷害, 維持細胞正常的結構功能, 提高植物的抗逆性[29]。在本研究中, 脯氨酸在鎘脅迫下顯著增加, 提示水稻幼苗為了維護細胞的穩定性而做出的生理性適應措施。這些結果與張家欣[30]在旱柳中的研究結果以及程雪等[31]在芹菜中的研究結果相似。然而, 在鎘脅迫下施用Ospep5肽處理水稻幼苗植株, 逆轉了鎘脅迫誘導的高水平脯氨酸。因此,Ospep5可能通過調節其他滲透保護劑而不是脯氨酸來緩解鎘對植物的傷害。同時, Ospep5可以促進植物根系中超氧化物歧化酶(SOD)的活性, 從而增強了水稻幼苗對鎘脅迫的抗氧化防御能力, 降低了鎘對水稻幼苗的毒性影響。這些結果還需要進一步深入研究。綜上所述, 鎘脅迫會抑制水稻幼苗的生長,而Ospep5有助于促進水稻幼苗在鎘脅迫下的生長。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9突變體ospep5-3、過表達Ospep5-OX和野生型日本晴材料, 施加CdCl2和合成小肽Ospep5處理, 證實小肽Ospep5可以有效促進水稻幼苗在鎘脅迫下生長。Ospep5可通過調節水稻幼苗體內的抗氧化系統酶POD的活性, 滲透調節物質Pro含量, 增加葉綠素含量, 抑制膜脂過氧化物MDA含量, 降低鎘離子含量, 使耐鎘基因OsHMA2、OsHMA3和OsCAL1表達上調等方式, 有效地緩解水稻的鎘脅迫。研究表明Ospep5通過調節水稻幼苗各種生理生化反應以及調控耐鎘基因表達的方式, 最終提高了水稻幼苗對鎘脅迫的耐受性。