魚類腸道益生地衣芽孢桿菌FA6發酵工藝的響應面法優化

潘美井 王桂堂吳山功

(1.大連海洋大學水產與生命學院,大連 116023;2.中國科學院水生生物研究所,武漢 430072)

抗生素等化學藥物的長期使用,造成了水產養殖中藥物殘留、病原菌耐藥性增強及食品安全等問題,因而受到了許多國家和地區的限制使用[1]。益生菌能夠改善養殖水環境,刺激免疫系統發育,維持腸道微生態平衡,提高生長性能等[2—5],近年來逐漸地替代抗生素等化學藥物,應用于水產養殖。

芽孢桿菌是水產養殖中常用的益生菌[6,7],但是水產養殖中使用的芽孢桿菌很多都不是魚類自身來源的菌株。地衣芽孢桿菌FA6(Bacillus licheniformisFA6)是本實驗室從草魚的腸道中分離出的一株芽孢桿菌,其可以耐受高溫和膽汁酸,分泌多種胞外酶,改善草魚的生長性能、抗氧化能力、腸道屏障能力和抗病性[8]。地衣芽孢桿菌FA6經發酵擴大培養后,可制成應用于水產養殖的菌制劑。發酵培養基成分和發酵條件對微生物發酵液含菌量有很大的影響[9—11],但是地衣芽孢桿菌FA6的發酵培養基和發酵條件還不清楚,需要確定和優化。

芽孢桿菌液體發酵工藝優化一般使用單因素實驗和正交實驗,在考察的因素較多時,這些方法不僅實驗量大、成本高、耗時長,而且可能導致不可靠的結論[12,13]。響應面法(Response Surface Methodology,RSM)可同時對影響生物量的各個因子水平及其交互作用進行優化和評價,從而快速有效地確定多因子系統的最佳的組合[14—16]。

本研究采用單因素實驗和響應面法實驗對地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基和發酵條件進行優化,以期獲得其活菌含量最高的發酵培養基配方和發酵條件,為其在高密度生產,產業化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

地衣芽孢桿菌FA6是本實驗室前期從草魚腸道中分離獲得,菌液保存于-80℃冰箱。

1.2 培養基

LB液體培養基作為種子培養基和初始發酵培養基,含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和NaCl 10 g/L,pH 7.0—7.2。固體培養基則在LB液體培養基中加入15 g/L的瓊脂作為凝固劑。

1.3 培養條件

種子菌液培養條件: 接種量為一接種環的單菌落,發酵溫度37℃、裝液量50 mL/250 mL、轉速120 r/min、發酵時間24h。

初始發酵培養條件: 接種量為2%的種子菌液,發酵溫度37℃、裝液量50 mL/250 mL、轉速120 r/min、發酵時間24h。

1.4 活菌數的測定

活菌數的測定采用稀釋涂布平板計數法[17]。

1.5 單因素實驗

初始發酵培養基和其他發酵條件保持不變的情況下,探究培養基初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0時、接種量分別為0.5%、1%、2%、4%或8%時、發酵時間分別為8h、12h、16h、20h、24h、29h、32h或36h時、發酵溫度分別為17℃、22℃、27℃、32℃、37℃或42℃時、轉速分別為60、90、120、150或180 r/min時,以及裝液量分別為25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、100 mL/250 mL、150 mL/250 mL或200 mL/250 mL時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數的變化。通過地衣芽孢桿菌FA6活菌數的比較分析,確定最適的初始pH、接種量、發酵溫度、發酵時間、轉速和裝液量,得到最佳發酵條件。

以初始發酵培養基為對照組,用10 g/L的可溶性淀粉(原料為馬鈴薯)、玉米淀粉、玉米糊精、乳糖、麥芽糖、蔗糖或葡萄糖替換初始發酵培養基的碳源(胰蛋白胨)。在最佳發酵條件下發酵后,測定地衣芽孢桿菌FA6活菌數,以確定發酵培養基的最佳碳源。再分別添加10、20、30、40、50、60或70 g/L的最佳碳源,以確定最佳碳源的最適添加量。

以初始發酵培養基為對照組,用10 g/L的蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸膏、豆粕粉、大豆蛋白胨替代初始發酵基礎培養基的氮源(酵母提取物)。在最佳發酵條件下發酵后,測定地衣芽孢桿菌FA6活菌數,以確定發酵培養基的最佳氮源。再分別添加10、20、30、40、50或60 g/L的最佳氮源,以確定最佳氮源的最適添加量。

以初始發酵培養基為對照組,通過在初始發酵培養基中添加1 g/L的MnSO4、CaCl2、KH2SO4、K2HPO4、Na2HPO4或MgSO4,在最佳發酵條件下發酵后,測定地衣芽孢桿菌FA6活菌數,以確定可以添加至培養基的無機鹽種類。

1.6 響應面法實驗

根據單因素實驗結果,Plackett-Burman Design(PBD)實驗選取可溶性淀粉、酪蛋白胨、NaCl、MgSO4、Na2HPO4、K2HPO4、KH2SO4、初始pH、接種量、裝液量、發酵溫度、發酵時間和轉速共計13個發酵因素作為自變量(X1、X2··· X13),以地衣芽孢桿菌FA6活菌數作為響應值(Y),篩選出顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數的發酵因素。利用Design expert 11.0軟件制定PBD實驗方案(表1),每個發酵因素設置兩個水平,低水平(-1)為其單因素實驗的最佳值,高水平(+1)取低水平的1.25—2倍[18,19];PBD實驗共20個組(表2)。當發酵因素的置信度高于90%(P＜0.05)時,表明其對地衣芽孢桿菌FA6活菌數有顯著影響。

表1 Plackett-Burman Design實驗的因素及水平Tab.1 Factors and levels of the Plackett-Burman Design experiment

表2 Plackett-Burman Design實驗的設計及結果Tab.2 Design and results of Plackett-Burman Design experiment

根據PBD實驗結果,選取顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數的3個發酵因素進行最陡爬坡實驗(表3)。參考王瑤等[20]的研究方法,依據3個發酵因素影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數的正負效應,確定其爬坡方向和步長,快速逼近最佳區域,以此獲得Box-Behnken Design(BBD)實驗的中心點。

表3 最陡爬坡實驗的設計及結果Tab.3 Design and results of Steepest Climbing experiment

根據PBD實驗和最陡爬坡實驗的結果,使用軟件Design-Expert 11.0設計3因素3水平的BBD實驗(表4)。BBD試驗的因素為PBD實驗篩選出的3個發酵因素,每個發酵因素設置3個水平,零水平(0)為最陡爬坡實驗確定的中心點,低水平(-1)和高水平(+1)為零水平的±1.5倍,其他發酵因素與其單因素實驗的最佳值保持一致。BBD實驗共17個組,包含5個中心點(表5)。BBD試驗結果采用軟件 Design-Expert 11.0擬合回歸方程和方差分析,并通過回歸方程預測地衣芽孢桿菌FA6活菌數的最優值及其對應最優發酵工藝。

表4 Box-Behnken Design實驗的因素及水平Tab.4 Factors and levels of Box-Behnken Design experiments

表5 Box-Behnken Design實驗的設計及結果Tab.5 Design and results of Box-Behnken Design experiment

根據BBD實驗結果,將地衣芽孢桿菌FA6置于預測的最佳發酵培養基和發酵條件下進行發酵實驗。通過發酵實驗獲得地衣芽孢桿菌FA6活菌數的實際值,并計算預測值與實際值的相對誤差。將在初始發酵培養基和初始發酵條件下發酵作為對照組,計算優化效率。

1.7 數據處理與分析

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)組間差異,以P＜0.05作為差異顯著性水平;采用Design Expert 11.0 軟件進行響應面實驗設計及其結果分析,采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行單因素實驗結果的統計和分析[21,22]。

2 結果

2.1 單因素試驗

初始pH對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖1所示,在初始pH為4.0—10.0,隨著初始pH的增大,地衣芽孢桿菌FA6活菌數先增加后減少。當初始pH為7.0時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數達到最大,為1.00×109CFU/mL,但與初始pH為5.0、6.0或8.0的活菌數無顯著性差異(P＞0.05)。當初始pH為4.0、9.0或10.0時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數顯著低于初始pH為7.0的活菌數(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發酵的最佳初始pH為7.0。

圖1 不同發酵條件對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響Fig.1 Effects of different fermentation conditions on the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

接種量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖1所示,在接種量為0.5%時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最低,為1.37×109CFU/mL。在接種量為1%時,地衣芽孢桿菌FA6的活菌數最高,為2.08×109CFU/mL,顯著高于接種量為0.5%的活菌數(P＜0.05);并高于接種量為2%的活菌數,但不顯著(P＞0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發酵的最佳接種量為1%。

發酵時間對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖1所示,隨著發酵時間的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數先增加后減少。在發酵時間為20h時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為3.27×109CFU/mL,顯著高于其他所有發酵時間的活菌數(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發酵的最佳時間為20h。

發酵溫度對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖1所示,隨著發酵溫度的升高,地衣芽孢桿菌FA6活菌數先增加后減少。在發酵溫度為27℃時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為3.49×109CFU/mL,顯著高于發酵溫度為22和32℃時的活菌數(P＜0.05)。因此地衣芽孢桿菌FA6發酵的最佳溫度為27℃。

轉速對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖1所示,隨著轉速的增大,地衣芽孢桿菌FA6活菌數先增加后減少。當轉速為150 r/min時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為1.42×109CFU/mL,與轉速為120和180 r/min的活菌數無顯著差異(P＞0.05),但顯著高于轉速為60 r/min時的活菌數(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發酵的最佳轉速為150 r/min。

裝液量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖1所示,隨著裝液量的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數先增加后減少。當裝液量為50 mL/250 mL時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為0.94×109CFU/mL,并顯著高于裝液量為25 mL/250 mL和100 mL/250 mL的活菌數(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發酵的最佳裝液量為50 mL/250 mL。

碳源及其添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖2所示,當可溶性淀粉作為碳源時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為1.08×109CFU/mL,其次是玉米淀粉,為1.0×109CFU/mL,且顯著高于對照組的活菌數(P＜0.05)。當葡萄糖或蔗糖作為碳源時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數均顯著低于LB培養基中的活菌數(P＜0.05),分別為3.12×107和4.37×107CFU/mL。因此,地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基的最佳碳源為可溶性淀粉。隨著可溶性淀粉添加量的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數先增加后減少。當可溶性淀粉的添加量為50 g/L時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為3.05×109CFU/mL。綜上所述,地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基的最佳碳源為可溶性淀粉,其最適添加量為50 g/L。

圖2 不同碳源、氮源或無機鹽及其添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響Fig.2 Effects of different carbon sources,nitrogen sources or inorganic salts and their concentration on the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

氮源及其添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖2所示,當酪蛋白胨作為氮源時,地衣芽孢桿菌活菌數最高,為1.85×109CFU/mL,其次是蛋白胨,為1.68×109CFU/mL,且顯著高于對照組的活菌數(P＜0.05)。當大豆蛋白胨作為氮源時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最低,為2.87×108CFU/mL,顯著低于對照組的活菌數(P＜0.05)。因此,地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基的最佳氮源為酪蛋白胨。最佳氮源添加量對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖2所示。隨著酪蛋白胨添加量的增加,地衣芽孢桿菌FA6活菌數先增加后減少。當氮源添加量為40 g/L時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為3.97×109CFU/mL。綜上所述,表明地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基的最佳氮源為酪蛋白胨,其最適添加量為40 g/L。

無機鹽對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響如圖2所示,當LB基礎培養基中添加MgSO4、KH2PO4、K2HPO4或Na2HPO4時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數均顯著高于對照組(P＜0.05)。當LB培養基添加MgSO4時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最高,為2.84×109CFU/mL,與對照組差異顯著(P＜0.05)。當加LB培養基添加CaCl2時,地衣芽孢桿菌FA6活菌數最小,為6.53×108CFU/mL,與對照組差異不顯著(P＞0.05)。綜上所述,MgSO4、KH2PO4、K2HPO4和Na2HPO4可作為無機鹽,添加至地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基。

2.2 響應面法實驗

Plackett-Burman Design實驗PBD實驗模型的決定系數R2=0.9060,矯正系數R2Adj=0.7025,P=0.0385＜0.05,表明該實驗模型可靠(表6)。可溶性淀粉(X1)、KH2PO4(X7)、發酵溫度(X11)和轉速(X13)對地衣芽孢桿菌FA6活菌數有顯著影響(P＜0.05),其顯著影響大小順序為: 發酵溫度＞可溶性淀粉＞轉速＞ KH2PO4(表6)。因此,發酵溫度、可溶性淀粉和轉速是影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數最顯著的3個發酵因素。

表6 Plackett-Burman Design實驗的統計分析結果Tab.6 Statistical analysis of the Plackett-Burman Design experiment

最陡爬坡實驗在最陡爬坡實驗中,可溶性淀粉和轉速對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響具有正效應,其水平逐漸增加;發酵溫度具有負效應,水平逐漸減小(表3)。地衣芽孢桿菌FA6活菌數在第3組實驗達到最高值,為5.46×109CFU/mL,對應的淀粉60g/L、發酵溫度27℃和轉速140 r/min可作為BBD實驗的中心點(表3)。

Box-Behnken Design實驗采用Design-Expert 10.0軟件對BBD實驗結果進行回歸擬合,得到二階回歸方程為:Y=674.00+12495A+27.35B+77.75C+17.20AB+53.85AC+32.20BC-273.43A2-23.08B2-3.27C2。回歸方程的決定系數R2=0.9326,矯正系數R2Adj=0.8460,表明該回歸方程的擬合性較好;回歸方程模型P=0.0024(＜0.01),失擬項P=0.6994(＞0.05),表明回歸方程的模型可信(表7)。因此,可用該回歸方程預測地衣芽孢桿菌FA6活菌數的最優值。回歸方程預測地衣芽孢桿菌FA6活菌數的最優值為8.20×109CFU/mL,對應發酵因素為: 發酵溫度(A)28.8℃、可溶性淀粉(B)70 g/L、轉速(C)160 r/min。

表7 Box-Behnken Design實驗的統計分析結果Tab.7 Statistical analysis of Box-Behnken Design experiment

方差分析顯示,模型中可溶性淀粉和轉速的一次項差異顯著(P＜0.05),發酵溫度的二次項差異極顯著(P＜0.001),而發酵溫度、可溶性淀粉和轉速間的交互作用差異不顯著(P＞0.05;表7),表明各發酵因素對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響不是簡單的線性關系。

在響應曲面圖中,發酵溫度的響應曲面變化幅度最大且陡峭,其次是轉速,而可溶性淀粉響應曲面變化幅度最小且不明顯(圖3),表明發酵溫度和轉速顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數。在等高線圖中,發酵溫度與可溶性淀粉和轉速的等高線圖呈橢圓形,可溶性淀粉與轉速的等高線圖呈圓弧形(圖3),表明發酵溫度與可溶性淀粉、轉速的交互作用顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數,而可溶性淀粉與轉速的交互作用影響不顯著。

圖3 發酵因素的交互作用影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數的響應曲面圖及等高線圖Fig.3 The interaction of fermentation factors influenced the response surface and contour plots of the number viable bacteria ofBacillus licheniformisFA6

優化后的發酵實驗在優化后的發酵培養基和發酵條件下,實際發酵獲得的地衣芽孢桿菌FA6活菌數為7.97×109CFU/mL,與預測最優值的相對誤差為2.8%。對照組地衣芽孢桿菌FA6活菌數為8.77×108CFU/mL,計算優化效率為提高8.1倍。

3 討論

工業發酵微生物種類繁多,但魚類腸道益生菌發酵的研究相對較少。地衣芽孢桿菌FA6是本實驗室從草魚腸道分離的一株芽孢桿菌,具有優異的生物學特性和抗逆性,可應用于水產養殖[8,23]。一般而言,魚類自身來源的益生菌更適應魚類腸道環境,更易于在腸道中定殖,從而長期發揮益生作用[24]。優化魚源益生芽孢桿菌的發酵工藝,能夠推動其在水產養殖中應用,進而促進水產養殖的健康與可持續發展。

適宜的培養條件有助于菌株的快速生長和代謝[25,26]。在本研究中,地衣芽孢桿菌FA6需要高轉速和低裝液量,這與丁泓皓等[27]研究結果一致。提高轉速和降低裝液量可以增加培養基的氧容量,從而促進微生物的生長[28]。在高密度發酵時,可在地衣芽孢桿菌FA6的對數生長期采用增加通氣量和較大轉速來提高其生物量。研究發現,溫度和pH會直接影響微生物細胞內的酶活性[13]。地衣芽孢桿菌FA6的最佳發酵溫度和初始pH與其他研究[29—31]報道的芽孢桿菌的最佳溫度和初始pH不同,表明不同芽孢桿菌的培養條件有差異。因此,探究地衣芽孢桿菌FA6的最佳發酵條件顯得十分重要,也是開發優良菌株至關重要的環節。

發酵培養基中的營養素類型及其濃度在微生物的生長和代謝中起到重要作用[32]。碳源的代謝速率會影響微生物的生長和代謝,微生物可以直接吸收利用速效碳源,但速效碳源消耗太快易造成微生物營養缺乏,從而提早衰老和自溶;遲效碳源可以克服速效碳源代謝過快產生的弊端,并且營養豐富,來源廣泛,價格低廉[33]。值得注意的是,在本研究中可溶性淀粉比葡萄糖更合適作為地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基的碳源。這與張皎皎等[26]研究結果相似,即可溶性淀粉作為碳源時,甲基營養型芽孢桿菌WM-1的抑菌活性最強,蔗糖作為碳源時,抑菌活性最低。本研究發現,豆粕粉可以作為地衣芽孢桿菌FA6發酵培養基的氮源,表明地衣芽孢桿菌FA6可以利用植物性蛋白。這使地衣芽孢桿菌FA6采用價格更便宜的植物性蛋白進行發酵,降低發酵成本成為可能。在優化無機鹽的實驗中,無機鹽MgSO4對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的增加具有促進作用。這可能是因為Mg2+作為許多酶、ATP化合物、核糖體和細胞膜穩定的輔助因子,能促進微生物對營養物質的利用及其能量轉導,從而提高微生物活菌數[32]。本研究篩選出的碳源、氮源和無機鹽及其濃度,對于后續發酵罐擴大培養具有重要的參考意義。

響應面法是一種周期短、試驗次數少和精度高且能同時研究多個因素的交互作用的分析方法,廣泛應用于生物發酵工程[34,35]。目前利用響應面法對芽孢桿菌產酶、胞外多糖和氨基酸等代謝產物的發酵優化較為常見[36—38]。本研究通過PBD實驗篩選出了顯著影響地衣芽孢桿菌FA6活菌數的三個發酵因素: 可溶性淀粉、轉速和發酵溫度。進一步分析等高線圖,發現發酵溫度與可溶性淀粉及轉速的交互作用對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響顯著,這與BBD實驗的方差分析結果相反。推測是發酵溫度對地衣芽孢桿菌FA6活菌數的影響最顯著,并且發酵溫度逐漸升高時,對地衣芽孢桿菌FA6活菌數增加具有極顯著的抑制作用,從而導致其與其他發酵因素的交互作用顯著。地衣芽孢桿菌FA6采用最佳發酵工藝進行發酵,實際獲得的活菌數與預測值的相對誤差小于5%,表明采用響應面法優化發酵工藝可行且有效[39]。

4 結論

本研究以地衣芽孢桿菌FA6為研究對象,通過單因素實驗和響應面法實驗對發酵初始pH、接種量和發酵時間等發酵條件,以及培養基的碳源、氮源和無機鹽的種類及添加量進行了優化,最終確定最佳發酵培養基: 70 g/L可溶性淀粉、40 g/L酪蛋白胨、2 g/L K2HPO4、1 g/L KH2PO4、2 g/L Na2HPO4、2 g/L MgSO4和8 g/L NaCl;以及最佳發酵條件: 初始pH 7.0、接種量 1%、發酵溫度 28.8℃、發酵時間 31h、裝液量 50 mL/250 mL和轉速160 r/min。在此發酵培養基和發酵條件下,地衣芽孢桿菌FA6活菌數可達7.97×109CFU/mL,較優化前提高了8.1倍。最佳發酵工藝的獲得,將能夠為魚源芽孢桿菌的高密度生產,產業化應用提供基礎。