亞硒酸鈉、酵母硒和富硒螺旋藻對雜交鱘幼魚生長、抗氧化能力及組織硒含量的影響

陳 政 劉 翠 劉昊昆朱曉鳴 韓 冬,楊云霞金俊琰解綬啟,

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室,武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 100049;3.湖北省水產動物營養與飼料工程技術研究中心,武漢 430072)

硒作為魚體生長發育所必需的一種微量元素,不僅是谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶的活性中心[1],能有效地清除氧化應激所產生的有害自由基,阻止脂質過氧化,還是脫碘酶的活性中心,可調節甲狀腺激素的代謝平衡[2]。同時,硒還能有效增強機體的免疫水平和抗病能力[3],提高魚體的生長性能[4],改善魚肉品質[5]。在諸多生理生化功能中,抗氧化功能是硒在體內發揮作用的基礎,在斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[6]、異育銀鯽“中科三號”(Carassius auratus gibeliovar.CAS Ⅲ)[7]和鱸(Lateolabrax japonicas)[8]等魚類上的研究均顯示,飼料中添加硒可顯著提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)等抗氧化酶的活性,從而提高機體的抗氧化能力。

硒在自然界的存在形式主要有有機硒和無機硒兩種,飼料中添加的無機硒和有機硒主要是亞硒酸鈉和酵母硒。亞硒酸鈉便宜易得,但毒性較大、生物利用率低、在生物體內貯積率低。快捷有效的獲得有機硒主要通過利用酵母菌株或藻類的富集能力,將無機硒轉化為硒蛋白。相較亞硒酸鈉,有機硒是安全有效的補硒形式,硒以硒代半胱氨酸或硒代蛋氨酸的形式存在于硒蛋白中,更易被機體消化吸收,生物利用度較高且具有較高的安全性和穩定性。除酵母外,藻類也是硒有機化的良好載體,其中螺旋藻(Arthrospira platensis)含有豐富的硒蛋白、具有較高的抗氧化能力[9],因此,富硒螺旋藻也是一種具有潛力、有待開發的有機硒源。在斑點叉尾鮰上的研究顯示,相較無機硒,飼料中添加有機硒更能提高魚體的免疫力和抵抗力[10],生物效價更高,魚體硒蓄積量更高,肝臟GSH-Px活性更高,需要量也更低[11]。在虹鱒(Salmo gairdneri)上的研究結果顯示,有機硒相比無機硒有更高的硒沉積率、更好的抗應激效果、不會誘導脂質過氧化,并且與其他微量元素沒有明顯的互作關系[12]。相比亞硒酸鈉,酵母硒能顯著提高黃顙魚肌肉硒沉積、抗氧化及抗低溫應激能力[13]。此外,石斑魚(Epinephelus malabaricus)[5]和大西洋鮭(Salmo salar)[14]的研究也表明有機硒的利用率高于無機硒。

硒作為人體必需的微量元素之一,對人類健康起著至關重要的作用。在飼料中添加硒既可以促進魚類的健康高效養殖,也有益于通過生產富硒水產品為我國缺硒地區居民補充膳食硒。健康的成年人每日硒攝入量應為55 μg,最低攝入量為每日40 μg[15]。硒缺乏已被證實與克山病、大骨節病、動脈粥樣硬化等一系列疾病有關[16]。在飲食中補充硒以維持一個最佳的硒狀態對于預防癌癥、糖尿病、心血管疾病及提高免疫力、改善機體亞健康狀態可能有幫助[17,18]。富硒水產品可作為人類補充硒的有效途徑,湖北既有穩居全國第一的淡水養殖產量,又有全球唯一探明獨立硒礦床,具有生產富硒飼料原料及富硒水產品得天獨厚的條件。

鱘是一種個體大,肉質鮮美的軟骨硬鱗魚,魚卵可以做成名貴的魚籽醬。本實驗所使用的雜交鱘(Acipenser baerii♂×Acipenser schrenckii♀)為西伯利亞鱘與史氏鱘的雜交種,具有生長速度快、飼料效率高、抗病力強、營養價值高和無肌間刺等優點,具有較高的經濟價值,養殖前景相當廣闊[19]。目前關于鱘飼料中添加硒的研究較少,本實驗旨在通過研究飼料中添加不同類型和水平的硒源對雜交鱘生長性能、抗氧化狀態和硒蓄積的影響,為雜交鱘高效健康養殖及富硒水產品的生產提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以魚粉、豆粕和菜粕為蛋白源,魚油、豆油1∶1混合作為脂肪源,配制粗蛋白含量為45%、粗脂肪含量為10%的基礎飼料,基礎飼料配方及營養成分見表1。另外在基礎飼料中添加亞硒酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)、酵母硒(安琪酵母有限公司)及富硒螺旋藻(由中國科學院水生生物研究所藻類生物學重點實驗室提供)三種不同來源的硒,硒的添加量設低、高兩個水平,硒添加量分別為0.4和1.2 mg/kg,配制6種實驗飼料。飼料硒含量采用原子熒光光度計法(GB 5009.93-2017 第一法)測得,對照組、低亞硒酸鈉組、高亞硒酸鈉組、低酵母硒組、高酵母硒組、低富硒藻組和高富硒藻組飼料中硒的實測含量分別為1.34、1.67、2.49、1.80、2.54、1.82和2.50 mg/kg,各組相應命名為C、S1、S2、Y1、Y2、P1和P2。在飼料制備前,將所有原料均經100目粉碎機粉碎后過40目篩,按硒的添加量將3種硒源準確稱取,并采用逐級預混法將其與礦物質預混料及維生素預混料等成分充分混勻,再將所有成分按配方充分混勻,加水,經雙螺桿膨化飼料機(濟南鼎潤機械設備有限公司)制成直徑為1.5 mm的膨化顆粒飼料,70℃烘干后封口防止受潮,置于-20℃冰箱中保存。

表1 飼料配方和主要營養成分(干重)Tab.1 Formulation and proximate composition of the basal diet(% in dry matter)

1.2 實驗魚和飼養管理

實驗用雜交鱘幼魚購自湖北天峽鱘業有限公司,購回后暫養于湖北省荊州市石首市石首老河長江四大家魚原種場網箱中,投喂商品飼料,馴養2周。實驗開始時將實驗用魚饑餓24h,挑選體格健壯、規格均勻、初始體重為(7.82±0.12) g的雜交鱘各55尾分別放入21個網箱(2 m×2 m×2 m)中,將所有網箱隨機分為7組,每組3個重復,分別投喂7組飼料。每天飽食投喂兩次,投喂時間為8:00和16:00,并記錄投喂量和水溫,養殖周期為62d。實驗光照為自然光,水溫為15—25℃,水體溶氧＞6 mg/L,氨氮＜0.1 mg/L,養殖水體硒的含量低于檢測限度(＜0.001 mg/L)。

1.3 樣品采集與分析

實驗結束時,在饑餓處理24h后,將各個網箱中所有實驗魚撈取計數并稱重,雜交鱘終末均重約為38.88 g。每個網箱隨機選取6尾魚用MS-222麻醉,其中2尾保存于-20℃冰箱,用于測定魚體硒含量。其余4尾魚,用肝素鈉潤洗過的注射器尾靜脈取血,放入抗凝離心管中,4℃ 3000 r/min離心15min,取上清液血漿置于-80℃冰箱保存,其中2尾魚的血漿用于測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量,另外兩尾用于血漿常規生化指標測定。選取抽血后的2尾魚置于冰盤上解剖,取出魚的肝臟、背肌分別裝袋置于-20℃冰箱保存,用以測得組織硒含量,剩余空殼用于分離脊椎骨并用于脊椎骨硒含量測定。

飼料成分的分析參考AOAC[20]的方法測定,水分含量采用105℃常壓干燥,粗蛋白含量使用凱氏定氮儀(KD-310,Opsis,Sweden)測定,粗脂肪含量使用索氏抽提法脂肪測定儀(SoxtecTM2055,Foss,Sweden)測定,灰分含量通過馬弗爐(湖北英山縣建力電爐制造廠,湖北英山) 550℃充分灼燒測定。飼料、全魚、肝臟及肌肉組織均在徹底干燥后充分粉碎攪勻,采用原子熒光光度計法(GB 5009.93-2017 第一法)測得干樣硒含量。血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒,按照使用說明進行測試。血漿總葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量,均采用全自動生化分析儀(邁瑞BS-460,廣東深圳)及其相應試劑盒進行測定。

1.4 數據計算及統計分析

特定生長率(Specific growth rate,SGR,%/d)=100×(ln魚體末重-ln魚體初重)/養殖天數

飼料效率(Feed efficiency,FE,%)=100×(終末體重-初始體重)/攝食量

采用軟件SPSS 22.0(IBM SPSS Statistics 23.0,IBM,USA)進行統計分析,經正態檢驗及方差齊性檢驗后,采用Two-way ANOVA計算硒源(Source)和硒水平(Level)間的差異及兩者的交互作用。然后進行單因素方差分析(One-way ANOVA),當各處理組間差異顯著,對各組數據進行Ducan’s多重比較,顯著性水平設為P＜0.05,數據分析結果用平均值±標準誤差表示(means±SE)。使用R 4.1.0 (R Core Team,奧地利維也納)和RStudio 1.4.1106 (RStudio,美國波士頓)進行Pearson相關分析,采用“psych”包版本2.1.9計算不同組織間硒含量的相關性及組織硒含量與血漿酶活、生化指標的相關性,并使用“pheatmap”包1.0.12版本進行可視化處理。

2 結果

2.1 不同硒源和硒水平對雜交鱘生長性能和飼料利用的影響

如圖1所示,不同硒源及硒水平對雜交鱘幼魚的特定生長率和飼料效率無顯著影響(P＞0.05)。

圖1 不同硒源和硒水平對雜交鱘生長和飼料利用的影響Fig.1 Effects of different selenium sources and levels on growth and feed utilization of juvenile hybrid sturgeon

2.2 不同硒源和硒水平對雜交鱘組織硒含量的影響

如圖2所示,不同水平的硒添加顯著影響雜交鱘幼魚全魚和肝臟硒含量,其中低、高水平硒添加都能顯著提高全魚硒含量,但只有高水平硒添加顯著提高肝臟硒含量(P＜0.05)。不同硒源對雜交鱘全魚及肝臟硒含量影響不顯著(P＞0.05)。硒源和硒水平對雜交鱘肌肉和脊椎骨硒含量的影響存在交互作用,其中高酵母硒組及高富硒螺旋藻組的肌肉和脊椎骨硒含量均顯著高于其余各組,且高酵母硒添加組脊椎骨硒含量顯著高于高富硒螺旋藻組(P＜0.05)。

圖2 不同硒源和硒水平對雜交鱘組織硒含量的影響Fig.2 Effects of different selenium sources and levels on tissue Se contents of juvenile hybrid sturgeon

2.3 不同硒源和硒水平對雜交鱘血漿抗氧化能力的影響

如圖3所示,不同硒源對雜交鱘血漿GSH-Px活性影響不顯著(P＞0.05),但相較于對照組及低水平硒添加組,高水平硒添加可顯著提高GSH-Px活性(P＜0.05)。不同硒源和硒水平對雜交鱘幼魚血漿SOD以及CAT活力無顯著影響(P＞0.05)。不同硒源顯著影響血漿MDA含量,其中富硒螺旋藻組MDA含量顯著低于亞硒酸鈉組(P＜0.05)。

圖3 不同硒源和硒水平對雜交鱘血漿抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of different selenium sources and levels on plasma antioxidant capacity of juvenile hybrid sturgeon

2.4 不同硒源和硒水平對雜交鱘血漿生化指標的影響

如表2所示,酵母硒組血漿TP、LDL-C和TC含量均顯著高于亞硒酸鈉組,硒源和硒水平對雜交鱘血漿HDL-C含量的影響有交互作用,其中低酵母硒組雜交鱘血漿HDL-C含量顯著高于對照組、高亞硒酸鈉組、高酵母硒組和低富硒螺旋藻組(P＜0.05)。血漿TC含量同時也受飼料硒水平顯著影響,低硒添加可顯著提高雜交鱘血漿TC含量(P＜0.05)。不同硒源和硒水平對雜交鱘幼魚的血糖、白蛋白和甘油三酯含量無顯著影響(P＞0.05)。

表2 不同硒源和硒水平對雜交鱘幼魚血漿生化指標的影響Tab.2 Effects of different selenium sources and levels on plasma biochemical indices of juvenile hybrid sturgeon

2.5 相關性分析

如圖4a所示,在亞硒酸鈉組中,肌肉硒含量與全魚硒含量呈顯著正相關(P＜0.05),但肝臟硒含量與肌肉硒含量呈顯著負相關(P＜0.05)。在酵母硒組中,脊椎骨硒含量與肌肉硒(P＜0.05)和肝臟硒含量(P＜0.01)均正相關。如圖4b所示,血漿GSH-Px活性與肌肉(P＜0.01)、脊椎骨(P＜0.01)和肝臟硒含量(P＜0.05)正相關,血漿總蛋白和白蛋白含量與肌肉硒含量正相關(P＜0.05),但血漿低密度脂蛋白膽固醇與總膽固醇含量與肝臟硒含量呈顯著負相關(P＜0.05)。

圖4 雜交鱘幼魚不同組織硒含量間的相關性(a)、雜交鱘幼魚組織硒含量與血漿抗氧化和生化指標的相關性(b)Fig.4 Correlation plot of Se contents in different tissues of juvenile hybrid sturgeon (a),correlation plot between tissue Se contents and plasma antioxidant and biochemical indices of juvenile hybrid sturgeon (b)

2.6 富硒鱘魚的參考攝入量

根據中國營養學會制定的中國居民膳食營養素參考攝入量,幼兒(1—3歲)每日的硒參考攝入量為20 μg,學齡期兒童(7—10歲)每日的硒參考攝入量為35 μg,青春期為40 μg,哺乳期婦女的硒參考攝入量達65 μg每日;對成年人而言,每日的硒攝入推薦量為50 μg,可耐受的每日最高硒攝入量為400 μg。在本實驗中,高濃度酵母硒及富硒螺旋藻飼喂的雜交鱘肌肉硒含量較高,高酵母硒組及高富硒螺旋藻組雜交鱘魚肉的硒營養素參考值(NRV)最高,分別為39.05%和34.14%(表3)。

表3 成人攝入富硒雜交鱘魚肉的硒參考攝入量及日食用量上限Tab.3 Recommended daily consumption and upper limit of fish meat when supplementing selenium for adults with only meat of hybrid sturgeon fed with different feeds

3 討論

3.1 不同硒源和硒水平對雜交鱘生長性能和飼料利用的影響

飼料中硒的添加對養殖魚類的生長和增重具有重要意義[6,7],但不同魚類對硒的需求量存在差異,以亞硒酸鈉為硒源時,斑點叉尾鮰的硒推薦量為0.25 mg/kg[6],大口黑鱸(Micropterus salmoide)的適宜添加水平為1.60—1.85 mg/kg[21],而黃尾鰤(Seriola lalandi)的需要量高達5.56 mg/kg[22]。作為機體必需的微量元素,硒在飼料中的含量不足或過量都會抑制幼魚的生長[23]。目前,雜交鱘的硒需求量并不清楚,本實驗中不同水平的硒添加對雜交鱘生長和飼料利用無顯著影響,說明基礎飼料中1.34 mg/kg的硒可能已滿足雜交鱘幼魚的需求,此時硒的額外添加對雜交鱘的生長無促進效果。不同魚類對同一硒源的需求量不同,同種魚類對不同硒源的需求量同樣存在差異,在異育銀鯽[24]、斑點叉尾鮰[11]、虹鱒[25]和石斑魚[5]上的研究均表明有機硒相較于無機硒生物效價更高,效果更好,在飼料中的有效添加量也更低。但本實驗中不同硒源對雜交鱘生長和飼料利用的影響差異不顯著,原因可能是有機硒和無機硒的添加既未不足也未過量,短期內對雜交鱘的生長無促進或抑制作用,其生物效價的不同也多表現在組織蓄積等方面而非生長性能上。

3.2 不同硒源和硒水平對雜交鱘組織硒含量的影響

在本實驗中,飼料中硒的添加水平對雜交鱘的全魚和組織硒含量造成顯著影響。但是,飼料中的硒僅在以高濃度有機硒(酵母硒和富硒螺旋藻)的形式添加時,才能顯著提高雜交鱘肌肉和脊椎骨硒含量,亞硒酸鈉或低水平硒添加提升效果不顯著。這不僅說明硒在雜交鱘幼魚體內的蓄積是劑量依賴型的,還說明不同硒源的代謝方式可能存在差異。

一般而言,相較于無機硒,有機硒更容易被機體吸收轉化后富集在組織中,斑點叉尾鮰[11]上的研究表明,相較于無機硒,有機硒更容易沉積在肌肉中;且當石斑魚[5]飼料中添加硒達到1.5 mg/kg時,有機硒添加組的肌肉硒含量是無機硒添加組的3倍多。飼料中的硒以有機形式添加時,多富集在蛋白質豐富的肌肉組織中[5,26],而以無機形式添加時,則在肝臟中代謝沉積,從而導致肝臟硒含量較高[16]。在虹鱒上的研究也表明,無機硒只能提高肝臟中的硒含量,而有機硒既可以提高肝臟硒含量又能提高肌肉中的硒含量[12],本實驗的結果與之一致。高濃度有機硒(酵母硒和富硒螺旋藻)添加顯著提高了雜交鱘全魚、肝臟和肌肉硒含量,而高濃度無機硒(亞硒酸鈉)添加只顯著提高了雜交鱘全魚和肝臟硒含量,且無機硒在肌肉中和肝臟中的沉積呈負相關,而有機硒則呈正相關,這說明不同類型的硒沉積模式不同。不同硒源的硒沉積規律不同,可能是因為代謝途徑不同。有機硒中的硒以硒代氨基酸的形式結合在蛋白質中,能有效地增加機體硒沉積;無機硒結合人體蛋白的難度更大,大量沉積在肝臟中,大部分可能最終被肝臟或腎臟排泄至體外。另一方面,有機硒在體內的代謝周期比無機硒長[27],動物對有機硒的消化率更高,能更充分地被機體加以利用,這些都可能是導致有機硒的肌肉沉積量較無機硒高的原因。肌肉是魚體的重要可食部分,飼料中添加適宜濃度的有機硒是生產富硒魚肉制品的有效手段。若僅以不同飼料飼喂的雜交鱘魚肉為成年人補硒,攝入更少的高濃度有機硒(酵母硒以及富硒螺旋藻)飼喂的雜交鱘魚肉即可達到硒攝入的每日推薦量,飼料中高濃度有機硒添加是生產富硒水產品和為人類補硒的有效途徑。

在軍曹魚(Rachycentron canadum)上的研究指出,脊椎骨硒含量隨著飼料有機硒或無機硒水平的升高而升高[28],然而在本實驗中,只有高水平酵母硒和富硒螺旋藻的添加顯著提高了雜交鱘脊椎骨硒含量,并且高濃度酵母硒對脊椎骨硒含量的提升效果最顯著,且其脊椎骨硒含量與肌肉硒含量高度正相關。但是,需要指出的是,與真骨魚類的骨骼不同,鱘軟骨不僅可食用,還具有獨特的保健藥用功效[29],本實驗的這一發現對鱘富硒軟骨的開發具有借鑒意義。

3.3 不同硒源和硒水平對雜交鱘血漿抗氧化能力的影響

高水平硒的添加可以顯著提高雜交鱘幼魚的血漿抗氧化能力。硒作為谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性中心[1],其抗氧化作用主要就是通過GSH-Px清除脂質過氧化物,防止氧自由基對機體造成損傷。缺乏硒會降低GSH-Px活性從而導致機體抗氧化能力下降[23],在大口黑鱸[21]、鱸[8]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[23]和石斑魚[30]上的研究都指出,機體的GSH-Px活性會隨飼料硒水平的升高而逐漸升高;類似的,本實驗中飼料中高水平的硒添加顯著提高了血漿GSH-Px活性,且血漿GSH-Px活性與雜交鱘肌肉、肝臟及脊椎骨硒含量正相關,說明血漿GSH-Px活性受到魚體組織硒含量的影響。此外,在斑點叉尾鮰[11]和軍曹魚[28]上的研究都發現,有機硒相較無機硒更能提高機體GSH-Px活性,不同類型的硒提升機體GSH-Px活性的效果不一樣。在本研究中,不同硒源對雜交鱘GSH-Px的影響并不顯著,這與斑點叉尾鮰和軍曹魚上的結果不同,但與在黃顙魚上發現亞硒酸鈉和酵母硒都能顯著提高幼魚肝臟GSH-Px活性的結果一致[13]。

GSH-Px、SOD和CAT都具有抵抗機體氧化損傷的重要作用,是細胞防御的重要組成部分,但在本實驗中,雜交鱘血漿SOD和CAT活性并未受到飼料中添加硒的類型或水平影響。之前的研究表明,飼料中過量的硒會降低異育銀鯽血清CAT 和T-SOD活性[7],這也說明2.5 mg/kg的飼料硒含量未對雜交鱘的抗氧化系統造成顯著的負面影響。MDA是脂質氧化產物,在西伯利亞鱘(Acipenser baeri)上的研究結果顯示,不同濃度的硒添加對鱘魚體內的MDA含量沒有顯著影響[31]。但虹鱒飼料中硒含量的增加能有效降低其血清和肌肉中MDA含量[32]。在本實驗中,飼料硒水平對雜交鱘幼魚血漿MDA含量影響不顯著,但富硒螺旋藻組的血漿MDA含量顯著低于亞硒酸鈉組,這可能是由于亞硒酸鈉添加減少脂質過氧化物產生的效果不顯著,而螺旋藻的添加可以降低脂質過氧化物的生成[33]。

3.4 不同硒源和硒水平對雜交鱘血漿生化指標的影響

血漿總蛋白包括多種酶和抗體,具有重要的免疫作用,硒可以提高斑點叉尾鮰感染愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)時血清抗體的水平,且有機硒效果更顯著[10]。本實驗中酵母硒的添加可顯著提高雜交鱘血漿總蛋白含量,表明酵母硒的添加對提高雜交鱘的免疫力可能有一定的作用。許多研究都表明,飼料中硒的添加會影響機體的脂質代謝[34]。飼料中添加過量硒會通過促進脂質生成、下調脂質分解和激活內質網應激來增加黃顙魚脂質沉積[35]。本實驗中硒源和硒水平對雜交鱘幼魚的脂肪代謝均產生了一定的影響,但具體機制仍需進一步的研究。

4 結論

綜上所述,不同硒源和硒水平對雜交鱘生長和飼料利用無顯著影響;高水平硒添加可以提高全魚及肝臟中硒的含量,不同類型硒在魚體的蓄積模式不一致,高水平的有機硒(酵母硒和富硒螺旋藻)添加相比無機硒(亞硒酸鈉)更易在肌肉和脊椎骨中蓄積;硒與血漿GSH-Px活性呈正相關關系,高水平硒添加可顯著提高雜交鱘抗氧化能力,不同硒源對雜交鱘的抗氧化能力無顯著差異。通過估算,本研究中高硒飼料養殖的雜交鱘肌肉的安全食用上限可達2049 g/d,食用更少的高濃度有機硒(酵母硒及富硒螺旋藻)飼喂的雜交鱘魚肉即可達到成年人硒的每日推薦攝入量。