發酵菜籽粕對黃顙魚表觀消化率、肝臟及腸道健康的影響

賈冰玉 鄒峰余 徐杰杰 趙 濤 柳聲贊 羅 智

(華中農業大學水產學院,武漢 430070)

菜籽粕是我國第二大蛋白質原料,其營養物質豐富,氨基酸組成全面,富含含硫氨基酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸及硒、鎂、鐵、鈣等礦物質[1]。歐盟、中國、加拿大和印度是全球四大菜籽粕生產國/組織,2020年我國菜籽粕產量達到909萬噸,居于世界第二位[2]。隨著水產養殖規模的不斷增加,水產行業飼料供給不足,而菜籽粕可作為潛在的新型植物蛋白源應用于水產飼料行業。但是菜籽粕含有的高碳水化合物、高粗纖維及大量抗營養因子成為其在水產飼料中的限制因素。抗營養因子過量會導致動物消化功能、抗氧化能力與免疫功能受損,并且會降低攝食量和生產性能[3,4]。有研究已表明,菜籽粕經過發酵可以有效降解硫甙、單寧和植酸等抗營養因子,并通過水解蛋白質為易吸收的小分子多肽等來提高菜籽粕的營養價值[5,6]。因此,發酵菜籽粕可作為一種有潛力的飼用蛋白源應用于水產飼料行業。

發酵菜籽粕在畜禽生產中的研究較廣泛,已證明它可以提高動物增重率、生產性能和免疫力,增加動物對飼料的表觀消化率,增加礦物質利用率并改善腸道健康[7—9]。然而,發酵菜籽粕在水產飼料行業的應用研究較為缺乏。有研究表明,發酵菜籽粕可以替代南美白對蝦(Litopenaeus Vannamei)飼料中64.40 g/kg水平的魚粉,而未發酵菜籽粕替代魚粉的水平僅為25 g/kg[10]。與未發酵菜籽粕替代組相比,發酵菜籽粕替代組可以明顯增加鯽(Carassius auratus)[11]和真鯛(Pagrus major)[12]的生長性能及飼料利用率,提高魚體的抗氧化水平。魚類的健康和免疫與抗氧化防御系統高度相關,當魚體受到的氧化損傷過重時,甚至會引起魚體細胞凋亡[13,14]。

黃顙魚(Tachysurus fulvidraco)廣泛分布于亞洲多個國家,是中國最重要的淡水養殖物種之一[15]。因此,本實驗以黃顙魚為養殖對象,先對其生長性能和表觀消化率進行分析,初步探討了發酵菜籽粕對魚體生長和營養物質消化吸收能力的影響。接著從黃顙魚肝腸組織、腸道緊密連接相關基因表達水平、炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡等方面入手,進一步討論了發酵菜籽粕對魚體肝臟及腸道健康的影響,為發酵菜籽粕在水產飼料中的開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 飼料配制

飼料配方參考Han等[16]試驗方法配制3組實驗飼料: 以基礎飼料為對照組(Control),未發酵菜籽粕替代30%基礎飼料為URSM,發酵菜籽粕替代30%基礎飼料為FRSM。具體組成見表1。其中,發酵菜籽粕所用菌種為 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)來源于中國典型培養物保藏中心,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)來源于華中農業大學生命科學技術學院發酵與酶工程教研室趙述淼老師的饋贈。飼料原料經粉碎,過60目篩,按飼料配方準確配制,采用逐級放大原則充分混勻。充分揉搓飼料,經水產專用擠條膨化機壓成細條,烘干后保存于-20℃條件下。

表1 飼料配方和成分分析Tab.1 Feed formulation and proximate analysis of experimental diets

1.2 飼養管理

黃顙魚購自當地養殖場(武漢,中國)。在養殖實驗開始之前,暫養2周黃顙魚進行馴化。在正式實驗前,實驗魚饑餓24h,選取180尾健康無病黃顙魚[體重: (6.08±0.02) g],隨機放入9個養殖缸中,每缸20尾魚。實驗共3個處理,每個處理組3個平行。每天8:00和16:00投喂至表觀飽食,每次投喂0.5h后吸除殘餌。在投喂1周后,開始收集糞便樣品。實驗采用靜態水養殖系統,養殖期間連續充氣保證水體的溶氧充足。在整個實驗過程中,為了確保水質,每缸每天換水2次,每周對水體氨氮、pH、溶解氧和溫度等水體指標測定2次,試驗期間水溫為28.7—30.7℃,pH為7.8—8.1,溶解氧和氨氮分別為6.1—6.5 mg/L和0.03—0.07 mg/L。實驗共持續7周。

1.3 樣品采集

糞便樣品的收集采用虹吸法,每次投餌后6h內,每隔2h收集1次糞便。收集新鮮、成型、飽滿及包膜完好的糞便顆粒,烘干并存于-20℃冰箱,直到糞便樣品夠分析用。

取樣前將黃顙魚饑餓24h,用100 mg/L MS-222麻醉后進行計數和稱重。抽血后,迅速置于冰上解剖取其內臟、肝臟及腸道進行稱重,以計算形體指標。每缸取3條魚在冰上迅速解剖取其肝臟和腸道,分別在TRIzol溶液中提取RNA,用于測定相關基因表達水平。另取3尾魚冰上迅速解剖,分離肝臟和腸道組織,置于甲醛固定液中固定,用于后續組織學觀察。另隨機選取6尾魚于冰上迅速解剖,將其肝臟組織及腸道組織分別冷凍于液氮中,保存于-80℃冰箱,用于酶活性及氧化應激相關指標的測定。

1.4 樣品分析

表觀消化率測定在105℃烘箱中烘干至恒重,測得樣品干物質含量(GB/T 6435-2006);采取凱氏定氮法測定樣品粗蛋白含量(GB/T 5009.5-2003);采取索氏抽提法測定樣品粗脂肪含量(GB/T 6433-2006);飼料和糞便的總能采用熱量氧彈儀(6200 Isoperibol Calorimeter)測定;采用電感耦合等離子發射光譜儀(ICP-OES;Optima 8000DV,PerkinElmer,USA)測定飼料及糞樣中的釔含量。實驗原料干物質、粗蛋白、粗脂肪和能量的表觀消化率的計算公式參照何明等[17]。

肝臟和腸道HE染色分析參照文獻[18]的方法,取肝臟或腸道樣品經梯度酒精脫水,接著進行石蠟包埋和切片(厚度6—8 μm),用蘇木精和伊紅(HE)染色后經中性樹脂封片。其中,染色過程為: 二甲苯脫蠟-100%—50%酒精逐級復水-蘇木精染色-流水沖洗返藍-50%—95%酒精逐級脫水-伊紅染色-二甲苯透明-中性樹脂封片。

肝臟及腸道生化指標測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和總抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定,丙二醛(MDA)含量、Caspase 3和Caspase 9酶活性均采用碧云天生物技術的商業化試劑盒進行測定,操作過程參照試劑盒說明書。

基因表達水平分析根據文獻[18]方法,總RNA的提取方法參照Invitrogen的TRIzol說明書進行。通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific,USA)測定總RNA的濃度和純度。以提取的總RNA為模板,采用TaKaRa反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA,然后在巢式PCR儀上進行反轉錄反應。反應結束將產物保存于-20℃備用。采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測黃顙魚組織的基因表達,熒光定量引物見表2。本實驗選用雙內參,用GeNorm標準化,選擇8種管家基因(18S rRNA、b2m、ubce、tuba、gapdh、rpl7、tbp和elfa)對它們進行轉錄水平穩定性檢測。采用2-ΔΔCt方法計算相對表達水平。

表2 熒光定量PCR基因引物Tab.2 Primers used for quantitative Real-time PCR

1.5 計算公式

增重率(WGR,%)=100×(末體重-初體重)/初體重

攝食率(FI,%)=100×飼料攝入量/[(初體重+末體重)/2×天數]

存活率(SR,%)=100×末魚數量/初魚數量

肥滿度(CF,g/cm3)=100×魚體重/(體長,cm)3

臟體比(VSI)=100×內臟團重/魚體重

肝體比(HSI)=100×肝臟重/魚體重

比腸重(ISI)=100×腸道重/魚體重

飼料系數(FCR)=飼料攝入量/(末體重-初體重)

1.6 統計分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計分析,所有數據結果均用平均值±標準誤(mean±SE,n=3)表示。使用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行不同組間指標差異性統計檢驗,若不同組間的差異顯著,則采用Duncan多重比較來檢驗不同處理組間的差異顯著性,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生長、飼料利用及形體指標

如表3所示,FRSM組黃顙魚的末體重(FBW)和增重率(WGR)顯著高于URSM組(P＜0.05)。與對照組相比,URSM組黃顙魚的飼料系數(FCR)和肝體比(HSI)顯著增加(P＜0.05)。而發酵菜籽粕飼料顯著降低了菜籽粕導致的飼料系數及肝體比的增加(P＜0.05)。

表3 發酵菜籽粕對黃顙魚生長、飼料利用及形體指標的影響Tab.3 Effects of fermented rapeseed meal on growth,feed utilization and morphological index of yellow catfish

2.2 原料的表觀消化率

由表4可知,黃顙魚對發酵菜籽粕原料的干物質、蛋白質、脂肪和能量的表觀消化率平均值分別為71.92%、83.38%、91.08%和79.65%,均高于未發酵菜籽粕原料。另外,黃顙魚對發酵菜籽粕原料的干物質表觀消化率的增加率(3.91%)最低,對脂肪表觀消化率的增加率(18.16%)最高。

表4 黃顙魚對未發酵菜籽粕和發酵菜籽粕的表觀消化率Tab.4 Apparent digestibility of unfermented rapeseed meal and fermented rapeseed meal in yellow catfish (%)

2.3 肝臟及腸道HE染色

如圖1所示,與對照組相比,URSM組黃顙魚肝臟組織出現明顯病變,細胞核偏移至一側,黃顙魚肝細胞空泡化現象明顯。FRSM組黃顙魚肝臟組織的病變情況得到明顯改善,肝細胞空泡化的相對面積顯著低于URSM組(P＜0.05)。由圖2可知,與對照組相比,URSM組黃顙魚的腸道絨毛長度顯著降低(P＜0.05),絨毛寬度無顯著差別(P＞0.05),而腸道zo-1和zo-2的mRNA表達水平顯著下調(P＜0.05)。發酵菜籽粕緩解了菜籽粕導致的腸道絨毛長度顯著降低及zo-1和zo-2表達的下調。

圖1 發酵菜籽粕對黃顙魚肝臟組織的影響(HE染色)Fig.1 Effect of fermented rapeseed meal on liver of yellow catfish (HE staining)

圖2 發酵菜籽粕對黃顙魚腸道結構的影響Fig.2 Effect of fermented rapeseed meal on the intestinal structure of yellow catfish

2.4 炎癥因子相關基因表達

如圖3A所示,FRSM組飼料飼喂黃顙魚降低了未發酵菜籽粕誘導的肝臟促炎因子相關基因(tnfα、tnf-β、il-1β和il-6)mRNA表達的上調,并提高了肝臟抗炎因子il-10mRNA表達水平的下調。而在黃顙魚腸道中(圖3B),FRSM組也降低了未發酵菜籽粕誘導的tnf-α和il-6的mRNA表達水平的上調,且抗炎因子相關基因(tgf-β和il-10)mRNA表達水平顯著高于URSM組(P＜0.05)。

圖3 發酵菜籽粕對黃顙魚肝臟(A)和腸道(B)炎癥因子相關基因表達的影響Fig.3 Effect of fermented rapeseed meal on gene expressions of inflammatory cytokines in the liver (A) and intestine (B) of yellow catfish

2.5 抗氧化系統相關基因表達及酶活性

由圖4可知,與對照組相比,URSM組黃顙魚的肝臟cat、sod1、gpx1和keap1的mRNA表達水平及T-AOC、CAT和T-SOD酶活性顯著下調(P＜0.05),而nrf2的mRNA表達水平和MDA含量顯著增加(P＜0.05)。而FRSM緩解了抗氧化系統相關基因表達和酶活的變化。由圖5可知,FRSM對腸道抗氧化系統與肝臟有相似的變化,FRSM同樣緩解了未發酵菜籽粕飼料導致的黃顙魚腸道氧化應激相關基因和酶活的變化。

圖4 發酵菜籽粕對黃顙魚肝臟抗氧化系統的影響Fig.4 Effect of fermented rapeseed meal on antioxidant system in the liver of yellow catfish

圖5 發酵菜籽粕對黃顙魚腸道抗氧化系統的影響Fig.5 Effect of fermented rapeseed meal on antioxidant system in the intestine of yellow catfish

2.6 肝臟和腸道細胞凋亡相關基因表達

由圖6A可知,與對照組相比,URSM組飼料飼喂的黃顙魚肝臟促凋亡基因(bax、caspase3、caspase9和mdm2)的表達水平顯著上調(P＜0.05),而bcl2的mRNA表達水平顯著下調(P＜0.05)。發酵菜籽粕飼料緩解了未發酵菜籽粕誘導的黃顙魚肝臟細胞凋亡相關基因的變化。由圖6B可知,FRSM組飼料同樣緩解了菜籽粕誘導的黃顙魚腸道bax、p53、caspase3、caspase9和mdm2表達水平的上調及bcl2表達的下調。

圖6 發酵菜籽粕對黃顙魚肝臟(A)和腸道(B)細胞凋亡相關基因表達的影響Fig.6 Effect of fermented rapeseed meal on gene expressions of apoptosis in the liver (A) and intestine (B) of yellow catfish

3 討論

3.1 發酵菜籽粕對動物生長及表觀消化率的影響

通過為期7周的養殖實驗,可以看到FRSM組飼料促進了黃顙魚的生長,提高了飼料利用率。在肉雞飼養實驗中,也觀察到喂食FRSM的肉雞的增重率及飼料系數明顯高于未發酵菜籽粕組[9]。菜籽粕中含有大量硫甙、植酸和單寧等抗營養因子,這些有毒物質會影響動物生長性能及對營養物質的吸收利用[19,20]。有研究表明,飼料中過量硫甙會導致嚴重的生長抑制[3]。與未發酵菜籽粕組相比,發酵菜籽粕組的硫甙、植酸及單寧的抗營養因子含量得到明顯降解。因此,發酵菜籽粕促進黃顙魚的生長及飼料的利用可能和菜籽粕中有毒物質的降解有關。

養殖魚類飼料的營養價值取決于單個飼料原料的營養成分及動物消化和吸收營養物質的能力[21]。在本研究中,黃顙魚對發酵菜籽粕原料的干物質、蛋白質、脂肪及總能的表觀消化率均高于URSM組。這與Chiang等[7]的研究結果一致,該研究發現飼喂發酵菜籽粕的肉雞對能量和干物質的表觀消化率高于未發酵菜籽粕。將發酵菜籽粕與未發酵菜籽粕作為試驗原料添加至泥鰍(Misgurnus anguil-licaudatus)飼料中,結果也表明泥鰍對發酵菜籽粕的干物質及蛋白質的表觀消化率較高[22]。表觀消化率是判斷動物飼料營養平衡的依據,能夠在為目標魚類設計的飼料中更準確地進行成分替代[23]。所以表觀消化率測定是評價發酵菜籽粕在飼料中的使用價值的重要的第一步。豆粕經發酵后添加至飼料中,大口黑鱸(Micropterus salmoides)對飼料的干物質和蛋白質的表觀消化率得到了顯著增加,并且未對大口黑鱸的增重造成影響[17]。由此說明微生物發酵能促進魚類對植物性蛋白源的表觀消化率的增加,這可能是FRSM組黃顙魚體重增加及飼料系數減少的另一個重要因素。

3.2 發酵菜籽粕對動物肝臟及腸道結構的影響

魚類肝臟在幾項重要功能的基礎代謝中起著重要作用[24]。有研究表明,飼料中高含量的菜籽粕會抑制草魚(Ctenopharyngodon idella)的生長,并對肝臟等內臟結構造成損害[25]。本研究同樣發現FRSM組黃顙魚肝臟組織出現明顯病變,肝細胞空泡化現象嚴重。據報道,菜籽粕中的硫甙分解形成的腈類化合物會損害肝腎功能[26],這可能是未發酵菜籽粕對黃顙魚肝臟造成損傷的原因之一。在本研究中,URSM組黃顙魚的肝體比明顯高于其他兩組,這也進一步證實了肝臟組織學觀察結果。在本研究中,FRSM組黃顙魚肝臟組織的病變情況得到明顯改善,空泡化的相對面積減少。通過對患脂肪肝的小鼠喂食發酵乳,8周后發現小鼠肝臟空泡化數量明顯減少[27]。這說明菜籽粕可能通過微生物發酵降低菜籽粕中的抗營養因子含量,從而改善菜籽粕對黃顙魚肝臟造成的損傷。

腸絨毛對營養的消化利用具有重要的功能,有利于增加酶活性和養分吸收[4]。在本實驗中,URSM組降低了黃顙魚腸絨毛高度,飼料中添加發酵菜籽粕緩解了這一變化。有研究發現,飼料中添加不超過10%的發酵菜籽粕時,肉雞十二指腸和空腸黏膜的絨毛高度增加[8]。腸絨毛的高度和寬度是反映腸黏膜形態結構和功能完整性的最直接指標[14]。有研究表明,菜籽粕中的芥酸引起魚類腸道充血和腸絨毛增生,破壞了草魚腸道結構完整性[28]。由此可知,發酵菜籽粕可能通過降解抗營養因子緩解菜籽粕對黃顙魚腸道結構的損傷,從而改善魚體腸道健康。

緊密連接蛋白在魚類腸道屏障中發揮著重要的作用[29]。在本研究中,發酵菜籽粕添加緩解了菜籽粕引起的zo-1和zo-2的mRNA表達下調。Occludin和Claudin-1是跨膜蛋白,Zo-1和Zo-2屬于閉合小環蛋白,它們構成緊密連接復合體,選擇性地阻止腔內物質自由進出[30]。有研究報道了菜籽粕中的抗營養因子會下調緊密連接相關基因的表達[28]。occludin、claudin-1、claudin-3和zo-2等緊密連接的下調會損害動物的腸道屏障[31]。這說明未發酵菜籽粕中過量的抗營養因子使黃顙魚的腸道屏障功能受損。Laukoetter等[32]報道上調zo-1和occludin基因表達水平有利于小鼠腸屏障功能的恢復。由此說明,發酵菜籽粕可以通過增強黃顙魚腸道細胞間的緊密連接,從而維持腸道屏障的完整性。

3.3 發酵菜籽粕對動物肝臟和腸道炎癥及抗氧化能力的影響

研究表明屏障功能與炎癥因子相關[14]。在本研究中,發酵菜籽粕緩解了菜籽粕誘導的黃顙魚肝臟和腸道炎癥因子相關基因的變化。同樣,發酵飼料喂養斷奶仔豬,空腸il-10、tgf-β表達水平顯著上調[33]。tnf-α、tnf-β、il-1β和il-6是重要的促炎基因,而il-10和tgf-β作為抗炎基因在炎癥控制中也發揮重要作用[34]。因此,本研究結果表明,未發酵菜籽粕具有促進肝臟和腸道炎癥的特性,發酵菜籽粕激活了黃顙魚的免疫反應基因。同樣,Wang等[35]通過研究也發現發酵菜籽粕添加可以提高肉雞免疫力。

魚類的健康和免疫與抗氧化防御系統高度相關,屏障完整性受損可導致炎癥因子泄漏到血液循環系統,從而引發應激反應或加重全身炎癥反應[14]。在正常情況下,Nrf2與抑制蛋白Keap1結合形成Keap1-Nrf2復合物,應激時,Nrf2從Keap1釋放并進入細胞核與抗氧化反應元件(ARE)結合,促進抗氧化相關基因的轉錄[36]。菜籽粕中的芥酸會誘導魚腸道中Nrf2通路相關的氧化損傷[28]。在本實驗中,添加未發酵菜籽粕黃顙魚肝臟和腸道keap1mRNA表達水平下調和nrf2的mRNA表達水平上調,這說明未發酵菜籽粕導致黃顙魚產生氧化應激。T-AOC代表生物體抵御ROS損傷的能力[37]。SOD是對抗氧自由基的主要防御系統之一[38]。在本研究中,未發酵菜籽粕飼喂的黃顙魚的MDA水平升高,抗氧化防御標志物(CAT、T-SOD和T-AOC)水平下降,飼料中添加發酵菜籽粕顯著緩解了菜籽粕導致的氧化應激反應。丙二醛是過氧化過程的最終產物[39]。使用菜籽粕與棉籽粕復合替代魚粉的飼料飼喂黃顙魚,結果發現替代水平達到20%后可明顯增加黃顙魚肌肉的MDA水平[40]。有研究表明發酵菜籽粕降低了MDA含量,并提高了T-AOC和T-SOD活性,因此發酵菜籽粕可以降低氧化損傷的風險[41]。另外,通過銀鮭(Oncorhynchus kisutch)養殖實驗發現,發酵豆粕替代10%魚粉蛋白促進了肝臟抗氧化能力[42]。因此,本研究表明微生物發酵可以緩解菜籽粕導致的肝臟和腸道組織的氧化應激,從而促進黃顙魚的生長。

3.4 發酵菜籽粕對動物肝臟及腸道凋亡相關基因表達的影響

氧化應激是促進細胞凋亡的重要因素,當氧化應激產生的ROS過量時,會誘導細胞發生凋亡[13]。在本研究中,URSM組黃顙魚的促凋亡相關基因上調及bcl2基因下調。Bcl-2家族在細胞凋亡信號轉導過程中起著重要作用,其表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素[43]。其中,bcl2/bax比值是啟動細胞凋亡的“分子開關”,下調bcl2或上調bax表達可促進細胞凋亡[44]。此外,bax和bcl2可以形成調節線粒體膜通透性的聚合物,引起細胞色素C釋放,使Caspase活化,最終引起細胞凋亡[45]。p53蛋白激活可引起細胞周期阻滯、DNA修復和細胞凋亡,其活性主要受MDM2的抑制[46]。有研究表明菜籽粕中的芥酸會誘導草魚細胞凋亡[28]。這說明未發酵菜籽粕中過量的抗營養因子可能會導致黃顙魚產生過多ROS,從而誘導肝臟和腸道細胞凋亡。在本研究中,FRSM組飼料飼喂黃顙魚緩解了細胞凋亡現象。有研究表明,發酵菜籽粕提取物能大大降低ROS的水平,從而可能減輕細胞凋亡[47]。來自酵母細胞壁的多糖具有高抗氧化活性[48]。因此,菜籽粕可能通過發酵降低其中的抗營養因子含量并提高相關多糖含量,從而緩解黃顙魚肝臟和腸道細胞凋亡。

4 結論

綜上所述,使用發酵菜籽粕替代未發酵菜籽粕添加至飼料中飼喂黃顙魚,增加了黃顙魚的生長性能和飼料利用率,提高了黃顙魚對原料的干物質、蛋白質、脂肪和能量表觀消化率,并且改善了菜籽粕引起的肝臟及腸道結構損傷、炎癥反應、氧化損傷和細胞凋亡。由此可見,菜籽粕經發酵處理可減少其對黃顙魚肝臟和腸道健康的不利影響,本實驗不僅能夠為黃顙魚的養殖提供理論指導,而且有助于發酵菜籽粕在魚類實際生產中的開發應用。